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苦碟子注射液的体外细胞毒性研究
目的：探讨苦碟子注射液(KDZ)的安全剂量及体外细胞毒性评价的可行性。方法：采用 MTT 法检测沈阳、通化两个厂家共12批次的KDZ对小鼠成纤维细胞(L929)的细胞毒性级别，并比较各两厂家之间的半数抑制浓度(IC50)差异是否存在统计学意义。结果：12批 KDZ 的给药浓度与 OD 值成显著的负相关，相关系数分别为-0.986和-0.924；12批KDZ原液对L929的细胞毒性级别均为4级，稀释64倍时毒性级别均为1级；两个厂家KDZ的IC50比较差异并无统计学意义(P＞0.05)。结论：当KDZ稀释64倍时对L929细胞基本无毒，采用细胞评价方法对KDZ进行安全性评估是可行的。
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小鼠B7-1基因RNAi慢病毒载体的构建及其沉默效应研究
目的：构建介导小鼠B7-1基因RNAi的慢病毒载体，研究其对L929细胞表面B7-1分子表达的沉默效应。方法：从小鼠B7-1基因编码区选择3段RNA干扰靶序列，制备转录双发夹RNA的前体DNA，并克隆至慢病毒穿梭质粒，构建B7-1的RNAi慢病毒穿梭载体，测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒，经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T细胞GFP表达水平确定病毒滴度，流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1基因RNAi慢病毒稳定感染的L929细胞，流式细胞术分析细胞中GFP及B7-1分子表达的状况；将感染细胞与分离的小鼠脾脏T细胞混合培养，分析B7-1稳定沉默细胞刺激T细胞增殖的能力。结果：成功了构建小鼠B7-1基因RNA干扰的重组慢病毒载体；获得了滴度达（3～5）×108 TU／ml的浓缩重组慢病毒，重组慢病毒可有效感染L929细胞介导GFP表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929细胞，该细胞表面B7-1分子表达受到抑制，刺激T细胞增殖的能力显著下降（P＜0.05）。结论：构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1分子的RNAi慢病毒载体，该载体可稳定沉默L929细胞表面B7-1分子表达，抑制B7-1／CD28信号诱导的T细胞增殖效应。
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氧化苦参碱对L929肿瘤细胞免疫抑制作用的影响
目的:体外研究氧化苦参碱(MOX)对L929肿瘤细胞(L929)免疫抑制作用的影响.方法:获取经MOX作用后再培养的L929培养上清,以不经MOX作用同步培养的1929培养上清作对照,检测上清对小鼠脾细胞5项免疫功能的影响(包括NK杀伤和ConA诱导转化,MTT法;细胞表面IL-2Rα、cD3ε+ζ+和CD3ε-ζ+表达水平,流式细胞术法)和上清中4种免疫抑制分子的浓度(包括TC,F-βl、PGE2、VEGF和IL-1O,定量ELISA法).分析MOX影响L929免疫抑制作用与影响L929免疫抑制分子分泌之问的关系.结果:不经MOX作用同步对照培养的1929培养上清(C-S1、C-S2),可稳定地测到所测4种免疫抑制分子(以TGF-βl和PGF2浓度高),和稳定地抑制所测小鼠脾细胞5项免疫功能(C-SI比C-S2,P>0.05).经MOX作用后的L929,其第一次再培养上清(MOX-S1),4种免疫抑制分子的浓度及对5项免疫功能的抑制均明显低于对照上清(c-SI);其第二次再培养上清(MOX-s2)与MOX-S1相比,4种抑制分子浓度无明显变化(P>0.05),除对CD3ε+ζ+的抑制作用明显降低外(P<0.01),对其余4项免疫功能的抑制作用亦无明显变化(P>0.05).相关分析显示,MOX下调L929对小鼠脾细胞ConA诱导转化及IL广2Ra和CD3ε-ζ+表达的抑制与下调TGF-βl和PGF2分泌显著正相关,下调对MK杀伤的抑制与下调TGF-βl分泌显著正相关.结论:氧化苦参碱可显著下调L929免疫抑制分子分泌而显著下调L929肿瘤细胞的免疫抑制作用,下调肿瘤细胞免疫抑制作用可能是其抗瘤新机制之一.
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青蒿琥酯逆转L929肿瘤细胞的免疫抑制作用
目的:体外研究青蒿琥酯(ART)逆转L929肿瘤细胞 (L929) 的免疫抑制作用.方法:获取经ART作用后再培养的L929培养上清和不经ART作用同步对照培养的L929培养上清,检测上清对小鼠脾细胞4项免疫功能的影响(包括NK杀伤和ConA诱导转化: MTT法; 细胞表面CD4+和CD8+表达水平:流式细胞术法)和上清中4种免疫抑制分子的浓度(包括TGF-β1、PGE2、VEGF和IL-10:定量ELISA法).分析青蒿琥酯逆转L929的免疫抑制作用与其下调L929免疫抑制分子分泌之间的关系.结果:同步对照培养的L929的上清,可稳定地检测到所测4种免疫抑制分子(TGF-β1 和PGE2浓度高)和对所测小鼠脾细胞4项免疫功能的显著抑制作用(C-S1与C-S2相比,P＞0.05).对ART作用后的L929:其第一次再培养上清 (ART-S1)与相应对照上清(C-S1)相比,4种免疫抑制分子的浓度及对小鼠脾细胞NK杀伤、ConA诱导转化和CD4+CD8- 表达的抑制作用显著降低(P＜0.01);其第二次再培养上清 (ART-S2)与ART-S1相比,除IL-10浓度轻度上升(P＜0.05)和对小鼠脾细胞CD4-CD8 +表达的抑制作用轻度降低(P＜0.05)外,余无显著变化(P＞0.05).相关分析显示, ART逆转L929对小鼠脾细胞NK杀伤、ConA诱导转化及CD4+CD8-表达的抑制,与其下调L929分泌TGF-β1 (r=0.971、r=0.984、r=0.990,P＜0.05) 、PGE2 (r=0.960、r=0.981、r=0.982,P＜0.05)及VEGF (r=0.970、r=0.992、r=0.982,P＜0.05)显著正相关. ART逆转L929对小鼠脾细胞CD4-CD8+表达的抑制,可能与其下调L929其它免疫抑制分子分泌有关.结论:ART可通过下调L929免疫抑制分子分泌而逆转其免疫抑制作用,逆转肿瘤免疫抑制应是ART抗瘤新机制之一.
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低浓度叔丁基过氧化氢对小鼠胚肺成纤维细胞L929增殖作用的影响
目的 通过不同浓度的叔丁基过氧化氢(Tert-Butyl bydroperoxide,TBHP)作用于培养的小鼠胚肺成纤维细胞系L929细胞,观察低浓度的TBHP对细胞生长、增殖的影响.方法 按TBHP的终浓度从低到高分别为:空白组(0μmol/L)、低浓度组(1 μmol/L)、中浓度组(10 μmol/L)和高浓度组(40μmol/L)分成四组.通过破壁灵芝孢子粉水提液(2.0 g/L)作用L929细胞系24 h,使细胞同步化,分别加入相应浓度的TBHP溶液.用MTT比色法检测细胞活力,并以溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)的免疫荧光染色法观察各组细胞的增殖变化,同时在相差显微镜下观察细胞的形态学变化.结果 镜下观察发现,TBHP 1μmol/L组细胞密度高于空白组和中、高浓度组.且BrdU阳性细胞数目多,细胞生长旺盛;MTT结果 显示TBHP1μmol/L组OD值高,其次为空白组和中浓度组,高浓度组低(P＜0.01),BrdU阳性荧光显色主要在刚刚分裂完成的细胞,呈现"镜像性"改变.结论 低浓度TBHP对体外培养L929细胞的增殖、生长具有一定促进作用,BrdU阳性荧光显色细胞的"镜像性"改变是反映细胞增殖活性的有效判定指标.
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高表达asporin对L929细胞中TGF-β1及Col2α1的影响
目的：构建高表达 asporin 基因 L929细胞株，研究其对子小鼠正常成纤维细胞 L929 TGF-β1及Col2α1表达的影响。方法：运用RT-PCR技术从小鼠下颌骨组织中扩增asporin cDNA ，连接酶连接至真核表达载体pcDNA3．1（-），所得的重组质粒pcDNA3．1（-）-ASPNⅢ用脂质体法转染小鼠成纤维细胞L929，经过G418筛选，使用 RT-PCR 以及 Western blot 技术筛选 asporin 基因高表达的细胞株。并使用 RT-PCR 以及Western blot技术检测asporin 基因高表达对细胞TGF-β1及Col2α1表达的影响。结果：成功获得asporin 高表达的L929细胞株。RT-PCR以及Western blot技术检测高表达asporin对TGF-β1及Col2α1的表达有明显的抑制作用。结论：asporin基因在L929细胞中高表达能抑制细胞TGF-β1及Col2α1的表达。
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外源性CCN1促进辐射损伤L929细胞的生长和迁移
目的 观察外源性CCN1是否促进辐射损伤L929细胞生长和迁移,以探讨CCN1在放创复合伤修复中的作用.方法 以4 Gy γ射线辐射L929细胞作为辐射损伤细胞模型,细胞辐射后分别加入2 ml CCN1或RFP条件培养液,37℃,5%CO2培养,作为CCN1组和RFP组;空白条件培养液培养辐射损伤L929细胞作为空白组.各组进行MTT试验、平板克隆形成试验、细胞周期分析和划痕愈合试验.结果 与RFP组和空白组相比,CCN1条件培养液处理后,与空白组辐射损伤L929细胞增殖明显增强(P<0.05),与RFP组和空白组相比,克隆形成率明显增高[CCN1组(34.4±3.6)%, RFP组(24.5±2.9)%,空白组(29.5±3.5)%](P<0.05),培养5 d时CCN1组S期细胞[(37.3±2.3)%]比RFP组[(25.2±1.9)%]和空白组[(26.9±1.3)%]增多(P<0.01),细胞迁移能力明显增强划痕愈合试验在1~5 d的愈合宽度/原宽度值与RFP组和空白组相比差异显著(P<0.01).结论 外源性CCN1可促进辐射损伤的成纤维细胞生长和迁移,提示CCN1是放创复合伤修复的促进因素之一.
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辐射对L929细胞生长及CCN1基因表达的影响
目的 通过观察辐射对小鼠皮肤成纤维细胞系L929生长及CCNI基因表达的影响,探讨CCNI基因与辐射损伤的关系. 方法 体外培养L929细胞系,以4 Gy60Coy射线照射为辐射组,并设对照组,MTT法测细胞增殖变化,平板克降形成实验检测克隆形成能力,流式细胞术测细胞周期,RT-PCR及免疫细胞化学法检测L929细胞中CCN1基因的表达情况.结果辐射组细胞辐照2 d增殖抑制明显(P<0.01),克隆形成也明显受到抑制(P<0.05);辐射后24 h,细胞出现G2,期停滞;辐射后6 Hl929细胞CCN1的Mrna表达水平明显降低(P<0.01),至24 h开始回调(P<0.05);辐照后24～48 h,细胞CCN1蛋白的表达水平明显下降(P<0.01). 结论 因辐照生长受到抑制的小鼠成纤维细胞L929,其CCN1基因的表达水平下调,提示CCN1基因的表达水平低下是辐射导致细胞生长抑制的因素之一.
关键词： 辐射 电离 细胞系 L929 Cyr61/CCN1 -
人B-CAM/Lu基因逆转录病毒载体的构建及其在L929细胞中的表达
目的 克隆人B-CAM/Lu基因,构建其逆转录病毒表达载体,获得稳定高表达B-CAM/Lu的L929细胞株.方法 RT-PCR技术克隆人B-CAM/Lu基因,并插入逆转录病毒载体pEGZ中,该重组逆转录病毒载体与pH456、pH460两个辅助病毒载体一起,共转染包装细胞293T,并感染L929细胞,经Zeocin筛选获得的细胞株通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光鉴定细胞中B-CAM/Lu基因mRNA的转录和蛋白表达.结果 成功获得人B-CAM/Lu基因,测序正确,亚克隆至逆转录病毒载体pEGZ后,经转染筛选,获得的抗性L929细胞株通过RT-PCR和Western blot分析,检测到B-CAM/Lu mRNA的转录和目的 蛋白的表达,通过间接免疫荧光确定该蛋白定位表达在L929转基因细胞膜上.结论 成功克隆并构建了人B-CAM/Lu基因的重组逆转录病毒表达载体,获得稳定高表达B-CAM/Lu蛋白的L929细胞株,为将其作为免疫源,制备B-CAM/Lu单抗用于镰刀型红细胞病及一些肿瘤疾病的检测诊断打下了基础.
