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左侧视网膜剥夺鸽右视盖差异表达基因的克隆与鉴定
采用抑制消减杂交技术构建左侧视网膜剥夺后右视盖基因差异表达的文库,研究在无光刺激的条件下视盖发育受阻的分子机制.随机测序21个序列,6个序列经反Northern 证实为真阳性,3个序列未发现明确的同源序列,另外3个分别与homo sapiens SH3GL2、G.domesticaus、 transthyretin有较高的同源性.21个序列中,11个基因片段被分配序列号.这些结果为深入研究视觉发育提供了有益的线索.
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利用抑制消减杂交初步构建犬小孢子菌在不同诱导底物表达的差异基因文库
目的 比较犬小孢子菌在儿童与成人头皮组织、儿童头皮组织与儿童光滑皮肤组织为诱导底物表达的差异基因,探讨犬小孢子菌蛋白酶在头癣中的发病机制.方法 将犬小孢子菌菌株分别接种于含儿童光滑皮肤组织(driver1)、儿童头皮组织(tester)和成人头皮组织(driver2)三种底物诱导培养基中培养,经抑制消减杂交技术(SSH)分别构建在tester与 driver1,tester与 driver2培养基中培养的犬小孢子菌菌株正反向差异基因文库,菌液PCR筛选鉴定,对阳性克隆进行测序分析.结果 在tester与driver1的正向差异基因文库中初步筛选出1个差异表达基因与编码红色毛癣菌线粒体细胞色素b和NADH1-5具有高度同源性,另15个差异表达基因在真菌界均未知.结论 应用SSH技术成功构建了不同底物诱导培养基犬小孢子菌表达的差异基因文库;这个与编码红色毛癣菌线粒体细胞色素b和NADH1-5具有高度同源性的差异表达基因,可能在犬小孢子菌所致头癣中起一定作用,进一步研究该基因的功能对研究头癣的发病机制具有重要意义.
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c血清型变形链球菌抑龋相关基因文库的构建
目的: 构建c血清型变形链球菌抑龋相关基因的抑制消减文库,为变形链球菌抑龋基因的筛选奠定基础.方法:从一对c血清型变形链球菌高、低毒力株中提取基因组DNA,AluⅠ酶切,以低毒力株的DNA酶切产物为tester DNA,高毒力株的DNA酶切产物为driver DNA,tester DNA连接接头后与driver DNA进行抑制消减杂交,并检测连接效率与消减效率.将获得的消减PCR产物,即差异基因/差异DNA片段,与pCR2.1载体连接,转化E.coli TOP10F′感受态细胞,进行蓝白筛选.结果:AluⅠ酶切高、低毒力株基因组DNA,产生的酶切产物位于0.1～2 kb之间.tester DNA与接头的连接效率＞25%,抑制消减杂交后消减效率检测显示,同时存在于tester与driver DNA中的23S rRNA基因在消减组中出现时间较未消减组晚12 个循环,将消减PCR产物克隆后,挑取96个转化子,构建抑龋相关基因的抑制消减文库.结论:利用抑制消减杂交技术进行c血清型变形链球菌高、低毒力株之间基因组DNA的比较,初次构建了抑龋相关基因的抑制消减文库.
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传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建
目的:构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库,筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库. 方法:采用抑制消减杂交技术,以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料,分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取64个白色克隆进行酶切鉴定. 结果:扩增消减cDNA文库获得760个克隆,随机挑取的64个阳性克隆经酶切后均有200～600 bp的插入片段. 结论:构建的传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定了工作基础.
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内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的筛选
目的:筛选内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因.方法:提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后mRNA,反转录合成cDNA,与对照组间进行抑制消减杂交,经菌落原位斑点杂交筛选阳性克隆并进行测序和同源性分析.结果:内皮细胞内毒素刺激后显示有18条基因差异表达,包括与炎症反应、细胞骨架重构、细胞生长和凋亡以及能量代谢有关的已知基因,另有三条为新基因序列.结论:抑制消减杂交有效地克隆了内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因,有助于阐明内皮细胞活化后细胞形态和功能改变的分子机制.
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内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因消减文库的构建
目的:建立人脐静脉内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的消减cDNA文库.方法:提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激6 h后mRNAs,反转录合成cDNA,与对照组间进行抑制消减杂交富集差异表达基因,经T载体转化感受态大肠杆菌.结果:建立了内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因消减cDNA文库.结论:经抑制消减杂交建立的消减cDNA文库富集并均一化了内毒素刺激后不同丰度的差异表达基因,为今后进一步筛选内毒素相关基因打下基础.
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联合应用SSH和cDNA表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因
目的 利用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)和大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因.方法 从SSH构建的大鼠轻度肝纤维化、重度肝纤维化2个差异cDNA文库中挑选1 000条上调显著的基因,与正常大鼠4 136条基因克隆制作成一张芯片,筛选早期活化的肝星状细胞相关基因.结果 获得与HSC早期活化相关的上调基因有202条,下调基因有80条,其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serum and glucocorticoid sensitive kinase,SGK)在正常大鼠基因克隆和2周及8周SSH上调差异基因中均呈上调信号.结论 联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效的方法;SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点,参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导.
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抑制消减杂交技术筛选大鼠急性心肌缺血后差异基因
目的 采用抑制消减杂交技术,筛选早期心肌缺血相关的RNA分子,为相关研究和应用提供依据.方法 10只SD雄性大鼠结扎冠状动脉前降支1h,制作心肌缺血模型.以缺血心肌的RNA分子为实验组,以非缺血区的RNA分子为对照组,用Clontech公司抑制消减杂交试剂盒进行杂交.经蓝白斑筛选阳性克隆测序并经过斑点杂交确认,构建早期大鼠心肌缺血后抑制消减杂交文库,所得序列和Genbank数据库比对.结果 筛选到10个阳性克隆和11个未知基因的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),按照功能分类,包括代谢相关的酶类基因,核糖体和翻译相关的基因,心肌重塑相关的基因等,其中组织蛋白酶L1,basigin等基因等是首次报道与早期心肌缺血相关.结论 采用抑制消减杂交技术获得的差别表达基因可为早期心肌缺血提供新的目标分子.
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利用反向mRNA斑点印迹从抑制消减杂交阳性克隆中筛选差异表达基因
目的:建立一种从抑制消减杂交阳性克隆中筛选差异表达基因的方法.方法:以阵列方式将抑制消减杂交阳性克隆的PCR产物点加于尼龙膜上,以标记polyA+RNA为探针进行反向杂交,化学发光法检测,在图象分析仪上进行光密度扫描,计量平均单位面积光密度,扣除背景,计算两个阵列各对应点之间光密度值的比值R(ratio).差异表达基因的阳性判定标准为R值大于或等于2.00.结果:通过反向mRNA斑点印迹技术可以从抑制消减杂交阳性克隆中把差异表达基因有效地筛选出来.结论:反向mRNA斑点印迹技术是一种筛选抑制消减杂交差异表达基因的有效方法.
关键词： 抑制消减杂交 基因克隆 差异表达基因 反向mRNA斑点印迹 筛选 -
α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因cDNA文库的构建
目的: 建立α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的文库.方法:抑制消减杂交法(SSH).结果:建立了3个人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库.其中,A差减文库(永生化人支气管上皮细胞BEP2D的cDNA为tester,α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆,B差减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester,BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver) 有301个克隆,C差减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester,BEP2D细胞的cDNA为driver)有586个克隆.,对文库中70个cDNA克隆单向测序后发现:61个cDNA为己知基因,9个cDNA在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因.结论:3个差减文库的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的基因,此为进一步研究α粒子诱导肺癌发生的分子机制奠定了基础.
