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抗HBs mAb的研制及其对野生与免疫逃逸变异HBsAg的交叉反应特征
目的:抗HBs G6 mAb制备及其对重组野生与免疫逃逸变异HBsAg结合能力与特点的评价.方法:常规制备并纯化抗HBs mAb,以纯化抗HBs mAb IgG包被,采用ELISA对17种野生及"a"决定簇替代性变异全基因重组表达HBsAg进行检测,并与几种市售HBsAg检测试剂进行比较.结果:该杂交瘤细胞生长与分泌特性稳定,其培养上清与腹水效价分别为2048及4096×103;对野生HBsAg检测(ELISA)敏感性不低于0.125 μg/L.该抗体可与15种变异抗原中12种发生反应(P/N≥2.5),反应信号强度分别为低反应组(2份,与野生株A值比较,下同)平均7.55%;中反应组(1例)为59.40%;高反应组(9种)分别为野生株的92.1%～109.4%,低反应或无反应表达产物的免疫逃逸变异部位集中在HBV"a"决定簇I环的起始部即120～124序列之间.部分表达产物采用市售试剂作同步检测,平均显色强度高于或明显高于几种国内应用为普遍的HBsAg ELISA(P<0.05).结论:抗HBs G6 mAb对多数免疫逃逸变异HBsAg有很强的结合能力,所针对的变异类型亦表现出某种特殊的规律.
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人源性抗HBsAg单链Fab基因在Pichia pastoris中的表达
目的:研究重组Fab的结构与亲和活性的关系.方法:通过重叠PCR,将人源性抗HBsAg Fab的H和L链基因融合构建单链Fab基因,并将其转入毕赤酵母表达载体pPICZαA中.以单链Fab基因表达载体通过氯化锂转化法转化毕赤酵母GS115.将获得的重组酵母在摇瓶中培养进行重组单链Fab的可溶性表达.表达上清经硫酸铵沉淀及亲和层析纯化后,用直接ELISA检测表达产物和纯化Fab的活性.结果:SDS-PAGE和Western blot分析显示,单链Fab在毕赤酵母中获得分泌型表达.薄层扫描显示,在摇瓶中培养毕赤酵母表达的单链Fab约为5～10 mg/L.经亲和层析纯化获得纯度达97.8%的重组单链Fab.经直接ELISA测定的结果显示,重组单链Fab具有较好的结合HBsAg的活性.结论:通过重叠PCR构建的融合单链Fab基因,可成功地在毕赤酵母中获得分泌型表达,表达产物具有较好的结合HBsAg的活性.
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亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体
目的:纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体,建立稳定、适于生产应用的纯化工艺.方法:以原核表达的重组人源性抗HBs scFv免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株14F7.将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水,经辛酸沉淀纯化后,制备亲和层析柱,纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体.结果:用抗scFv mAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAgFab的纯度可达95%以上,回收率可达70%～85%.结论:人源性抗HBs scFv制备mAb作为亲和层析的介质,可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAg Fab,适用于大规模生产重组人源性抗HBsAg Fab.
关键词： HBsAg 重组Fab 抗scFv单克隆抗体 亲和层析 -
抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的:构建抗人HBsAg单链抗体基因,并分析其在COS-7细胞中的表达.方法:以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板,分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因,通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly 4Ser)3的编码序列连接,并引入前导肽编码序列,构建具有L-VH-Linker-VL结构的单链抗体基因.将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP-N3,并转染COS-7细胞进行表达.结果:经测序表明,前导肽、连接肽、VL 及VH的序列正确.酶切鉴定证实,成功地构建了GFP基因融合表达载体.瞬时转染COS-7细胞后,通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达.转染细胞的培养上清浓缩后,进行 SDS-PAGE及Western blot 分析,可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达.培养上清的间接ELISA 检测证实,所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性.结论:成功地构建了抗人HBsAg 单链抗体基因,并可在COS-7细胞中分泌性表达.
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抗HBsAg人IgG在CHO细胞中表达的影响因素探讨
目的探讨CHO-HB2细胞株表达抗HBsAg人IgG的影响因素.方法观察CHO-HB2细胞表达抗体的稳定性,不同培养基以及添加剂的效用,细胞接种密度和培养持续时间的选择,金属离子Zn2+诱导表达的作用,以及滚瓶的培养效果.结果CHO-HB2细胞的亚克隆株F4经液氮冻存半年多复苏后,在无氨甲喋呤(MTX)的培养基中连续传代第2个月,抗体表达量开始下降,5个月时接近用(MTX)施加选择压力前的基础水平.在培养基中添加多种氨基酸和维生素,并加入适量的Zn2+诱导金属硫蛋白启动子,可使表达量明显增加.滚瓶培养可进一步增加抗体的表达量,在无蛋白的无血清培养基中的表达量,从6.2mg/L提高到28mg/L.结论应及时用MTX对细胞株进行再加压筛选,以保持细胞稳定表达抗体的能力.通过优化培养条件,使用完全无蛋白的无血清培养基,可收到较好的效果,且有利于表达抗体的纯化.
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乙型肝炎表面抗原和抗体双阳性模式浅析
乙型肝炎病毒(HBV)的标志物在免疫学实验室检测中很常见, 随着乙肝疫苗的推广, 乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝表面抗体(HBsAb)的血清学模式更为临床关注.有些病例在不同时期采血重复试验时, 仍能测得HBsAg和HBsAb同时阳性, 且HBsAb的水平也不低, 提示HBsAb确实能与HBsAg同时存在.研究中我们分析了HBsAg和HBsAb在体外反应一些特性.
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重组人源抗HBsAg Fab的糖基化分析
目的: 分析重组人源抗HBsAgFab的糖基化.方法: 应用PAS糖染色法和经酶切糖苷酶H去糖基后,用MALDI-TOF-MS质谱仪对重组人源抗HBsAgFab的糖基化进行分析.结果: PAS染色法的结果显示,毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的重组人源抗HBsAgFab呈淡红色.用质谱仪测定P. pastoris表达的经内切糖苷酶H去糖基后的重组人源抗HBsAg Fab的相对分子质量(Mr),从50678.49降低到49 245,相差1 433.49(约相当于少了8个甘露糖基).结论: P. pastoris表达的重组人源抗HBsAgFab,为一种具有生物活性的低糖基化的蛋白,为深入研究其性质及功能奠定了基础.
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全血金标法筛选无偿献血者血中HBsAg的评价
用金标试剂检测献血者血中HBsAg,可大程度的满足无偿献血现场筛查的使用以及在广大乡村、边远地区简陋条件下检测的要求,且便于在家庭中开展个人自查.因此,有助于推动无偿献血的开展及<献血法>的顺利实施,乙肝传染源的及时发现、隔离及治疗,以及提高我国国民的健康水平.我们对金标试纸条的应用进行了评价.1 材料和方法血液标本来自无偿献血者.金标试纸条购自厦门新创公司;ELISA检测试剂盒购自上海科华和北京万泰公司.操作步骤严格按说明进行操作.
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HBsAg对树突状细胞免疫表型及CTL杀伤活性的影响
宿主的免疫反应在持续性HBV感染中起关键作用[1].近有人用HBsAg及其相关蛋白治疗慢性HBV感染, 取得了一定的疗效[2]. 提示HBsAg有可能作为治疗慢性持续性HBV感染的药物之一.
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HBsAg常规检测阴性结果分析
目的 了解日常工作中HBsAg漏检情况,为提高临床检验质量提供参考.方法 在日常工作中从临床检测备份管随机收集400份经国产A品牌全套试剂ELISA检测乙型肝炎病毒血清学指标(HBVM),其中HBsAg呈阴性结果的血清标本,按HBsAb检测结果分成HBsAb阴性和阳性两类各200例,双份分装-20℃冻存;增加B,C另外两种国产ELISA HBsAg试剂及美国超敏MONOLISA HBsAg ULTRA试剂,共四种试剂同时复检HBsAg,阳性标本行双份HBV DNA定量分析、结果取均值.结果 A,B,C三种国产试剂复检HBsAg结果一致阴性,美国超敏MONOLISA HBsAg ULTRA试剂从HBsAb阴性标本中检出5例HBsAg阳性,从HBsAb阳性标本中未检出HBsAg阳性结果.HBV DNA定量分析结果显示均小于500 copies/ml,其中400～500 copies/ml 1例, 100～200 copies/ml 2例,10～100 copies/ml 2例,未发现低于检测下限结果.结论 国产常规ELISA HBsAg试剂灵敏度普遍偏低、容易漏检;漏检标本多来自HBsAb阴性个体;漏检个体可能和隐匿性HBV感染相关,临床应重视长时间HBsAb阴性个体的HBVM定期复查工作.
关键词： 乙型肝炎病毒/乙肝病毒 乙型肝炎病毒血清学指标 HBsAg 隐匿性 -
HBsAg阳性患者乙型肝炎病毒表面大蛋白的检测及其意义
目的 探讨检测乙型肝炎病毒表面大蛋白(LHBs)用于反映HBsAg阳性患者体内乙型肝炎病毒复制的临床意义.方法 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和荧光定量PCR法对1 066例HBsAg阳性血清标本进行LHBs及HBV DNA检测.结果 ①在1 066例HBsAg阳性血清中HBV DNA阳性率为63.23%(674/1 066),LHBs的阳性率为66.42%(708/1066),二者比较无显著性差异(X2=2.240,P>0.05),两者总体符合率为91.93%;②不同HBV-M模式的HBV-DNA与LHBs检出结果均无显著性差异(P>0.05).③LHBs含量与HBV DNA拷贝数呈正相关(r=0.927,P<0.001).结论 血清中LHBs含量与HBV-DNA的拷贝数具有较好的相关性,LHBs能够反映HBV的复制情况.
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液态蛋白芯片法检测HBsAg和HBeAg的方法学的建立及临床应用
目的通过对HBsAg和HbeAg两种抗原的检测,建立液态蛋白芯片检测法及临床应用;并比较两种方法在检测HBsAg和HBeAg两种抗原对结果有无差异.方法用AXSYM免疫自动分析仪MEIA法和液态蛋白芯片法两种方法同时检测200例该院体检及门急诊临床样本HBsAg和HBeAg两种抗原,用标准血清的检测结果绘制出标准曲线,比较样本结果.结果液态芯片法检测结果与AXSYM免疫自动分析仪MEIA法检测HBsAg、HBeAg,阳性和阴性符合率HBsAg分别为95.6%,96.2%;HBeAg分别为91.4%,92.3%.在统计学上对临床样本判断无明显的差异(P>0.05).结论液态芯片法较AXSYM免疫自动分析仪MEIA法具有灵敏度高,线性范围广,准确性高,重复性好,操作简便、快速,标本用量少的优越性.并且通过联合检测,可同时检测多个项目,更加快捷、简便,病人的检测费用也可大幅度的降低.
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无偿献血者血液筛查开展HBcAb检测的必要性分析
目的 研究血站无偿献血者血液筛查开展HBcAb检测的必要性.方法 对114份HBsAg灰区可疑样本(0.8≤S/CO<1)及1 000份HBsAg阴性初次献血者样本(S/CO<0.8,无溶血、脂血等外观异常)做HBV-M五项(HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb)检测,对HBcAb阳性样本做荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测HBV-DNA,对HBV-DNA阳性样本再做HBcAb滴度测定.结果 114份HBsAg灰区可疑样本,HBcAb阳性37例;37例HBcAb阳性样本中HBV-DNA阳性21例;21例HBV-DNA阳性样本HBcAb滴度测定2例为1∶64,其余19例均≥1∶128.1 000份HBsAg阴性初次献血者样本中,HBcAb阳性51例;51例HBcAb阳性样本中HBV-DNA阳性2例;2例HBV-DNA阳性样本HBcAb滴度测定1例为1∶64,1例≥1∶128.结论 血站HBsAg检测应加设灰区(0.8≤S/CO<1),去除灰区可疑样本;再对HBsAg检测阴性样本进行HBcAb筛查,淘汰HBcAb阳性高滴度样本,才能确保输血安全.
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四种乙肝表面抗原测定方法的比较
目的探讨四种HBsAg检测方法的临床应用价值.方法①使用微粒子捕捉免疫发光法分析仪(Abbott);②ELISA立可读(国内著名品牌);③金标方法1(国内某品牌);④金标方法2(国内某品牌).四种方法测定血清HBsAg并进行比较.结果目前国产试剂存在假阴性和假阳性较多.结论以微粒子捕捉免疫发光法作为参照方法进行比较,ELISA方法假阳性结果较多、两种全标法存在假阴性结果.ELSIA阴性结果是可信的,而金标法阳性结果是可信的.两种方法都存在缺陷,应尽量使用公认的进口试剂来提高检测的准确性.
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胶体金免疫试带法与ELISA法检测HBsAg的互补性
本文对胶体金免疫试带法与ELISA法检测HBsAg作了比较,结果显示两种方法具有很强的互补性,同时应用可及大地提高检测HBsAg的准确度.
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HBsAg阳性献血者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性研究
目的探讨HBsAg阳性献血者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性变化及意义.方法应用比色法检测55例HBsAg阳性并伴ALT不正常的献血者及50例健康献血者的红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性,并将结果进行相关分析.结果与健康对照组比较,HBsAg阳性献血者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性明显下降.结论献血者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降与HBsAg阳性密切相关,ATP酶活性下降可能参与乙型肝炎病变的发生、发展过程.
关键词： HBsAg Na+-K+-ATP酶 红细胞膜 献血者 -
以S/CO值对ELISA法检测HBsAg进行室内质控
目前,绝大多数基层医院检验科应用ELISA法检测HBsAg,由于样品显色深浅与样品中抗原的含量没有一定正相关,所以一般不用定量检测,只用于定性检测;相应地,室内质控也不象生化定量那样受重视,不少检验工作者对如何进行HBsAg定性的质控办法也不甚明了.现将我们应用S/CO值进行室内质控的体会报告如下.
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2005～2012年无锡地区无偿献血者输血感染检测指标分析
目的：了解无锡地区无偿献血者血液传染性指标检测现状，以便采取有针对性的措施阻断经血液传播疾病。方法对2005～2012年无锡地区（不包括县、区）无偿献血血液标本329254（人）份的检测结果作回顾性统计分析。结果8年来，无锡地区无偿献血者的 HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 及抗-TP 四项检测阳性率分别为0.587％，0.452％，0.212％和0.509％，总阳性率为1.76％，不同年份间的抗-HCV、抗-HIV及抗-TP阳性率差异有统计学意义（χ2＝40.74～138.24，P值均＜0.01），2011～2012年 HBsAg 阳性率有明显升高，与以往年份比较差异有统计学意义（χ2＝47.56，52.34，P＜0.01），同时四项感染性指标的阳性人数在不同的性别、年龄和职业中有着不同比例的分布。结论多数指标阳性率逐年呈下降趋势，但个别指标仍有上升趋势，应进一步做好不同人群的科学无偿献血的宣传工作，确保血液安全。
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慢性HBV感染者低浓度HBsAg持续存在的临床特点及分子流行病学研究进展
慢性HBV感染者低浓度HBsAg持续存在已引起临床实验室及分子生物学专家的重视和关注,该文就低浓度HB-sAg人群的临床特点、分子生物学及流行病学新研究进展进行综述.
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不同方法测定HBsAg不确定度的探讨
目的 对检测HBsAg的四种方法进行评价,旨在选择适合实验室检测的方法.方法 分别采用ELISA、光激化学发光法(LICLIA)、时间分辨免疫荧光(TRFIA)手工法和前处理法进行批内及批间重复性检测,并进行统计学分析.结果 通过重复性试验显示,TRFIA前处理法的批内及批间变异系数(CV%)与其它方法相比,差异有统计学意义(P＜0.05),而其它几种方法相互间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 选择适合本单位恰当的方法才能降低实验室的不确定度,为室内质量控制建立良好的基础,更好地服务于临床.
