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不同可变数目串联重复序列组合鉴定结核分枝杆菌临床菌株分型的效果
目的 探讨不同可变数目串联重复序列(VNTR)组合鉴定MTB临床菌株分型的效果并在全国推广使用.方法 连续收集国内5个区县的891株MTB菌株样本,通过计算不同VNTR组合的分辨力指数(HGI),系统评估目前常用的VNTR分型组合,包括国外推荐的12个散在分布重复单位(MIRU)位点组合(MIRU-12)、15/24 VNTR位点组合(VNTR-15/VNTR-24)、24 VNTR位点加4个高变位点组合(VNTR“24+4”)以及国内吕冰等建立的15位点组合(VNTR-L15)和本课题组筛选的VNTR“9+3”组合.结果 分辨力由高至低依次为VNTR“24+4”(0.999 2)、VNTR“9+3”(0.998 9)、VNTR-24 (0.992 9)、VNTR-15 (0.988 4)、VNTR-L15 (0.970 9)、MIRU-12(0.924 8).VNTR“9+3”的分型能力不仅超过VNTR-15,且高于VNTR-24,与分辨力高的VNTR“24 +4”组合分型结果一致的菌株数为822株,一致率达到96.6％ (822/851).结论 VNTR“9+3”的分辨力和分型结果均与VNTR“24+4”相当,且具有位点数少、工作量小,易于推广的优点.建议将VNTR“9+3”组合作为我国MTB基因型分型的推荐方案推广应用.
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结核分枝杆菌散在分布重复单位基因型分型法的应用研究
目的建立结核分枝杆菌散在分布重复单位 (mycobacterial interspersed repetitive units,MIRU)基因型分型法,评估该方法在我国应用的可行性.方法采用简单数字表法随机抽取上海地区2000年至2002年保存的菌株,对其进行MIRU分型,并与间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)的结果进行比较.结果用Spoligotyping方法对随机抽样的91株临床菌株进行基因型分型,得到20种基因型,其中81株(89%)属于北京基因型菌株,而用MIRU分型方法可将这些菌株分为46种基因型.81株北京基因型菌株可以分为39种不同的MIRU基因型.12个MIRU位点的多态性分析表明各位点有较大的区别,其中位点26显示了较高的多态性,位点16、31、40显示了中等程度的多态性.结论 MIRU分型方法简单快速,其数字化结果清晰可靠,是一种有效的结核分枝杆菌基因型分型方法.
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山东省局部地区结核分枝杆菌散在分布重复单位基因分型技术的应用
目的 对结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterial interspersed repetitive units,MIRU)基因分型技术在山东省局部地区的应用进行评价.方法 2004年2月至2006年6月,对山东省12个县级结核病防治所实验室分离培养的826株结核分枝杆菌,应用MIRU基因分型技术进行分型.结果 826株结核分枝杆菌分为201种基因型,123个独特型,78个簇,大簇基因型为223325173533.成簇的菌株中相对应的患者有流行病学接触史者18例.MIRU基因分型法分辨率为0.90,位点26显示相对较高多态性.该基因分型法的重复性为100%.完成1株菌株基因分型需要成本人民币约50元.结论 MIRU基因分型技术的重复性好,快速、简单、经济,不需要昂贵的设备.不足之处是223325173533基因型菌株在山东是社会传播的优势菌群,占分离结核分枝杆菌的30.89%,需要通过二线分型方法IS6110限制性片段长度多态性基因分型技术或增加新的多态性较高的可变数目串联重复序列位点进一步提高分辨率.
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多种基因分型技术在识别结核分枝杆菌基因型的联合应用
京基因型MTB(分辨力分别为0.9930和0.9933)的分型中.结论 MIRUs分型的方法简便、快速,结果有效、可靠,在大规模的结核病分子流行病学研究中,可先采用MIRUs,再对成簇MTB菌株进行IS6110-RFLP二次分型的联合分型策略.
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以数目可变的串联重复序列和结核分枝杆菌散在分布重复单位为基础的基因分型方法在结核分枝杆菌流行病学研究中的应用
结核病是一种严重影响人类健康的传染病.全球有近1/3人口感染了结核分枝杆菌,主要分布在发展中国家.如果不能及时和有效地控制结核病传播,在今后20年内,发展中国家将会有2亿人罹患结核病.在我国,三分之一人口已感染结核分枝杆菌,受感染人数超过4亿,其中约有10%发生结核病.如果不采取有效的措施,在未来十年内预计有3 000万人发生结核病.当前结核病控制面临的主要困难有:贫困人口的结核病发病率高、发现率低、耐药结核菌感染增多,而伴随着城市化过程的人口流动,更加剧了结核病在人群间的传播.为了有效地控制结核病传播,除了在全国范围内实施面向贫困人群的结核病控制专项项目外,还需建立完整、准确的结核病流行病学监测体系.分子流行病学是监测传染病传播的有效途径,它是建立在"感染相同菌株的患者有相同的传染源即存在分子流行病学联系"假设基础之上的,而分子流行病学在结核病基因分型中的应用,与传统流行病学相比能更准确地预测疾病的暴发流行及其传播模式.
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老年缺血性脑卒中患者白细胞介素1受体拮抗剂基因多态性研究
目的 探讨白细胞介素1受体拮抗剂基因内含子2的变数串联重复(VNTR)多态性与老年缺血性脑卒中的关系.方法 选择老年缺血性脑卒中患者112例作为脑卒中组,选择同期年龄和性别相匹配的健康志愿者或其他疾病住院的惠者105例作为对照组,通过PCR和琼脂糖凝胶电泳来确定其基因型.结果 脑卒中组患者A2等位基因频率低于对照组(4.9% vs 10.5%,x2=4.78,P=0.029),AlA2+A2A2基因型的频率也较对照组低(9.8% vs 20.0%,x2±4.47,P=0.035).结论 白细胞介素1受体拮抗剂内含子2基因VNTR多态性与老年缺血性脑卒中有关,其A2等位基因对脑卒中可能有保护作用.
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内皮型一氧化氮合酶4b/a基因多态性与缬沙坦降压疗效的关系
患者对抗高血压药物反应各不相同,其差异可能与遗传素质的不同有关.本研究旨在探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因第4内含子上27bp数目可变的串联重复序列(VNTR)多态性对缬沙坦降压效应的影响.
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老年动脉粥样硬化患者雄激素受体基因多态性的分布及临床意义
目的研究雄激素受体基因多态性在老年人动脉粥样硬化(AS)中的分布规律及该位点与AS的关系. 方法应用多聚酶链反应扩增片段长度多态性(PCR-Amp-FLP)技术对100例老年AS患者及78例非AS患者雄激素受体基因位点短串联重复序列(STR)进行多态性分析. 结果在该位点重复单位为GGC, 片段大小在177～267 bp之间,重复次数为9～39次,杂合度为85%,多态信息量(PIC)为0.80;AS患者中雄激素受体基因位点片段大小在195～237 bp之间,重复次数为15～29次,杂合度为77%,PIC为0.72,两组的基因频率分布差异有显著性 (P＜0.001);男性、女性的AS组与对照组比较差异均有显著性(P＜0.05);非AS组男性与女性比较差异无显著性(P＞0.05); AS组男性与女性比较差异有显著性(P<0.05). 结论雄激素受体基因GGC位点改变可能对不同性别,尤其是老年男性易患AS具有一定的作用,该位点可能可以作为老年人AS一种遗传标记.
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急性髓细胞白血病患者NPM1与FLT3基因突变的研究
目的 探讨急性髓细胞白血病(AML)患者中NPM1基因与FLT3基因内部串联重复(ITD)突变的发生率,并了解其临床特征及预后.方法 收集86例成人AML患者初诊时骨髓单个核细胞,采用基因组DNA-PCR方法分别扩增其NPM1和FLT3基因,毛细管电泳方法分析NPM1第12外显子突变,琼脂糖电泳分析FLT3-ITD突变,随访判断其预后.结果 86例AML患者中共检出NPM1基因突变29例(33.7%),FLT3-ITD突变15例(17.4%).两种突变在50例染色体正常核型AML中的发生率分别为46.0%和24.0%,明显高于异常核型AML患者.7例中6例NPM1+/FLT3-ITD+双阳性AML患者表现为正常核型,外周血白细胞均＞50×109/L.单纯NPM1+或FLT3-ITD+AML患者初诊时也表现为高白细胞(P＜0.05),NPM1+AML患者CD34表达率较低(P＜0.001)、临床完全缓解(CR)率略高(66.7%、53.3%,P＞0.05)、总生存率(OS)高(P＞0.05);而FLT3-ITD+AML患者CR率略低(50.0%、58.8%,P＞0.05)、OS低(P＞0.05).NPM1+/FLT3-ITD-、NPM1-/FLT3-ITD-、NPM1+/FLT3-ITD+、NPM1-/FLT3-ITD+四组患者的CR率分别为66.7%、62.5%、50.0%、42.9%(P＞0.05),各组间OS差异无统计学意义(P＞0.05).结论 NPM1和FLT3-ITD突变是AML(尤其正常核型AML)患者常见的分子学异常,且与其临床特点、疗效及预后有一定相关性.
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汉族人载脂蛋白B基因3′端可变数目串联重复序列与冠心病的关系研究
目的探讨汉族人载脂蛋白(apo)B基因3′端可变数目串联重复序列(3′VNTR)多态性与冠心病的关系.方法应用聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳技术检测了137例冠心病患者和120例健康对照组apoB基因3′VNTR多态性基因型,探讨了apoB基因多态性对血脂水平的影响. 结果冠心病组3′VNTR-B(大等位基因)频率明显高于对照组(10.95%比5.00%,P<0.05),且与性别、家族史、吸烟史、体重指数及冠状动脉病变程度无明显关系.冠心病组中3′VNTR-B等位基因携带者血清总胆固醇(TC)明显高于不含3′VNTR-B等位基因者,而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显低于不含3′VNTR-B等位基因者.Logistic回归分析显示,年龄、吸烟、家族史、3′VNTR、TC、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)是冠心病发生的独立危险因素.结论 apoB基因3′VNTR多态性对人群血脂水平有影响,3′VNTR-B等位基因可能与汉族人冠心病的发生相关联.
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寡核苷酸芯片筛查孤雄完全性葡萄胎患者的相关基因
目的 在全基因组DNA水平探讨孤雄完全性葡萄胎患者的相关基因,并探索其发生的分子机制.方法 短串联重复序列(STR)基因位点鉴定孤雄完全性葡萄胎的亲代来源;人基因组U133 Plus 2.0寡核苷酸芯片检测孤雄完全性葡萄胎和正常早孕绒毛组织中全基因组DNA水平的差异表达基因,荧光定量RT-PCR技术验证小部分差异表达基因;对寡核苷酸芯片检测的数据进行生物信息学分析.结果 11例经病理检查确诊的完全性葡萄胎患者中,其基因组DNA经STR基因位点鉴定显示,9例(82%)为父系来源,2例(18%)为双亲来源;寡核苷酸芯片检测显示,和正常早孕绒毛组织相比,孤雄完全性葡萄胎组织中表达上调基因279个,占检测基因的0.72%(279/38 500),表达下调基因1710个,占检测基因的4.44%(1710/38 500);小部分差异表达基因的荧光定量RT-PCR技术检测与寡核苷酸芯片检测结果一致;生物信息学分析显示,差异表达基因涉及多个生物学过程和通路,其中印迹基因的变化和生长激素及人胎盘生长催乳激素基因的变化尤为明显.结论 孤雄完全性葡萄胎的发生、发展是涉及多基因、多途径的复杂过程,其中印迹基因和生长激素类基因表达改变起重要作用.
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检测微卫星序列多态性位点鉴别完全性葡萄胎的亲代来源
目的 通过检测9个微卫星序列多态性位点以鉴别完全性葡萄胎的亲代来源.方法 用多重PCR技术和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染显色方法,对50例病理诊断为完全性葡萄胎患者的葡萄胎标本及夫妇外周血标本进行DNA分析.结果 50例完全性葡萄胎患者中,双亲来源完全性葡萄胎7例,占14%;孤雄完全性葡萄胎43例,占86%,其中孤雄单精完全性葡萄胎35例,孤雄双精完全性葡萄胎8.例.结论 微卫星序列多态性位点检测是一种鉴别完全性葡萄胎亲代来源的简便、快速、可靠、高效的方法.
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产前诊断标本的母体细胞污染及其影响
目的 评估国内现有的有创性产前诊断技术中母体细胞污染(MCC)的发生率及其对产前诊断结果的影响.方法 采用单中心大样本量研究方案,在2011年10月至2012年1月期间采用PowerPlex 16系统对519例孕中期羊水标本、57例孕早期绒毛标本及对应的576例孕妇外周血标本进行短串联重复序列(STR)分型,根据分型结果判断是否存在MCC及MCC的程度；结合核型分析结果和分子遗传学诊断结果分析MCC对产前诊断的影响.结果 3.1％(16/519)未经培养的羊水标本和1.3％(7/519)培养后的羊水标本存在MCC;5％(3/57)未经培养的绒毛标本存在MCC.MCC对于正常核型女性胎儿的核型分析无影响,但是增加了男性胎儿被误判为两性嵌合体,或者异常核型胎儿被误判为异常/正常核型嵌合体的风险.MCC对不同分子遗传学诊断方法的影响不同,对于基于PCR的基因定性分析,10％ MCC即可造成错误的分析结果；对于定量分析,10％及以上的MCC即对分子遗传学诊断结果产生干扰,30％ MCC可导致错误的诊断结果.结论 MCC可能影响产前诊断结果,核型为嵌合体的产前诊断羊水标本和可疑MCC的绒毛标本均应当进行MCC排除实验；MCC对于分子遗传学诊断结果的影响更为明显,建议产前分子遗传学诊断应尽可能常规进行胎儿组织标本的MCC排除实验.
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孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断中的应用
目的 依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,寻找一种无创性产前基因诊断的新方法.方法 提取42例孕14～40周的产妇血浆中游离胎儿DNA,采用引物延伸预扩增(primer extension preamplification, PEP) 后行PCR,特异性扩增其Y染色体重复序列(DYZ3)基因.同时采用9个短串联重复序列(short tandem repeat, STR)多态性位点的多重扩增方法以检出血浆中胎儿DNA.结果 DYZ3-PCR中,32例妊娠男性胎儿孕妇中有28例血浆中出现基因扩增带,检出率为87.5%,10例妊娠女性胎儿孕妇血浆有2例假阳性结果.性别总符合率为85.7%,STR-PCR中,检测出孕妇血浆中父源性胎儿DNA的存在.结论 应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断敏感性和特异性较高,是一种无创性产前基因诊断方法,具有广泛的临床应用前景.
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短串联重复序列基因座CSS1PO和FGA杂合度与攻击行为关系的研究
目的探讨短串联重复序列基因座杂合度与攻击行为的关系.方法 运用PowerPlex 18D System荧光标记复合扩增试剂盒对525例攻击行为军人个体(包括276例主动攻击行为个体和249例被动攻击行为个体)与313例对照样本个体外周静脉血进行PCR复合扩增,然后应用ABI3130XL型基因分析系统对扩增产物进行基因检测.比较三个群体中杂合子比率及17个STR基因座杂度性的差异.结果 17个STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡;三个群体中的杂合子比率差异无统计学意义(P>0.05);在CSS1PO基因座,被动攻击行为组的杂合度显著低于对照组(66.7% vs.74.8%,χ2=4.43,P＝0.035);在FGA基因座,主动攻击行为的杂合度显著低于被动攻击行为组(81.9% vs.88.4%,χ2=4.29,P＝0.038);其余STR基因座三组的杂合度无统计学意义(P>0.05).结论 CSS1PO和FGA基因座可能与攻击行为的发生有关;CSS1PO基因杂合性降低可能与被动攻击行为发生相关;FGA基因座杂合性改变可能与攻击行为发生的类型相关.
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短串联重复序列位点的优选及其在脊髓性肌萎缩症产前诊断中的应用
目的 优选出与运动神经元生存(survival motor neuron,SMN)基因紧密连锁且多态信息含量丰富的短串联重复序列(STR)位点,并将其应用于脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)产前基因诊断中.方法 用PCR扩增与SMN基因紧密连锁的11个STR位点,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测,银染法显色分析结果.通过多态信息含量(PIC)大小优选STR位点,并利用优选出的STR位点分别采用PCR-PAGE及基因扫描技术对6个SMA家系(包括父母、先证者和胎儿)进行连锁分析.结果 我们从11个STR位点中优选出了3个位点(D5S435、D5F149、D5S351),这3个位点在100名健康人中分别检测出8、19、18种多态性片段,其PIC值分别为0.84、0.91、0.92.应用上述3个位点对6个SMA家系进行产前诊断连锁分析,在6名胎儿中发现4名携带者和2名健康者.结论 通过优选出的3个STR位点可快速进行SMA产前基因诊断,准确地排除母血污染,而且可在胎儿中甄别出健康个体与基因携带者,进一步完善了SMA产前基因诊断体系.
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周围髓鞘蛋白22基因重复突变致夏科-马里-图斯病1A亚型的临床变异性
目的 探讨夏科-马里-图斯病(CMT)患者周围髓鞘蛋白22(PMP22)基因重复突变特征及临床变异性.方法 联合应用改良的等位基因特异性PCR-双酶切和基于荧光标记毛细管电泳短串联重复序列(STR)分析对45例临床拟诊CMT患者进行PMP22基因重复突变的检测,详细分析其中阳性病例的临床特征.结果 在45例拟诊CMT患者中共检测出PMP22基因重复病例21例,包括10例临床特征符合四肢远端萎缩无力的典型CMT1型患者和11例不典型的CMT患者,后者具有特殊表型:1例仅以轻度头晕就诊;1例合并听力障碍;2例以反复发作性肢体无力起病;2例伴有上肢姿势性震颤;4例伴有小脑性共济失调;1例伴有癫(癎)发作.结论 PMP22基因重复突变为CMT病常见的病因,改良的等位基因特异性PCR-双酶切提供了一种准确、可靠并易于操作的检测方法,有助于该病的诊断和鉴别.同时,通过综合分析PMP22重复突变阳性的CMT1A患者临床表现、电生理及病理特征,提示该组疾病具有高度的临床变异性.
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基于脐带血和短串联重复序列分析的脊髓小脑共济失调3型产前诊断
目的 探讨脊髓小脑共济失调3型(SCA3)的产前诊断方法 .方法 对1个SCA3家系女性先证者的胎儿进行产前检测,于妊娠20周抽取脐带血进行胎儿DNA提取,采用PCR和基于CEQ8000核酸分析仪的短串联重复序列分析技术进行SCA3基因CAG重复序列动态突变检测.结果 先证者SCA3基因CAG重复数目为31/75次,其配偶CAG重复数目为14/27次,胎儿CAG重复数目为14/31次,其中14次重复来自父亲,31次重复来自母亲的正常等位基因,符合孟德尔遗传规律.本次检测的胎儿携带患者的正常等位基因.胎儿出生后的检测结果 与产前检测完全相同.结论 通过脐带血和短串联重复序列分析技术检测SCA3基因CAG重复序列动态突变,可快速、可靠地进行SCA3产前诊断.
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遗传性乳光牙本质家系致病基因的染色体定位
目的研究一个在天津塘沽地区发现的遗传性乳光牙本质回族家系致病基因是否与染色体4q21连锁.方法提取该家系13名成员的外周血DNA,选择染色体4q21上的8个短串联重复序列多态性标记(short tandem repeat polymorphisms,STRPs)做荧光标记PCR等位片段分析,用lod连锁分析法分析该家系致病基因位点与上述8个STRPs的连锁关系.结果得到13名个体8个位点的基因型和单体型,连锁分析结果显示:8个STRPs的大lod值均大于0,其中5个STRPs的lod值大于1.结论该家系致病基因定位在染色体4q21上,表明中国回族人和报道的欧美人的DGI-Ⅱ的基因座位是一致的.
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扩展的简单串联重复位点诱发突变在遗传毒理学的应用进展
扩展的简单串联重复(ESTRs)序列是基因组DNA上高不稳定的一类重复序列.由于其自发突变和诱发突变率高,因而在生殖细胞诱发突变中的研究中得到广泛的应用.随着研究的深入,目前发现有3类重复序列——小卫星、微卫星和ESTRs,主要通过系谱法和单分子PCR法来研究这些重复序列的变化.但迄今为止,这些重复序列的突变机制还不明确.本文主要综述了目前国内外对这3种重复序列的异同、ESTRs突变研究方法的优缺点以及突变机制.
