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一种肠道病毒D68型感染性克隆的构建方法
目的 构建肠道病毒D68型(EV-D68)cDNA感染性克隆. 方法 利用聚合酶不完全引物延伸(Polymerase Incomplete Primer Extension,PIPE)法分别扩增EV-D68基因组cDNA片段与pBR322载体,得到的片段连接后测序,连接产物测序正确后作为载体与EV-D68的基因组的第2段扩增连接.以此类推,边扩增边连接,并测序,直到全基因组全部连接到pBR322上,在EV-D68基因组前面插入T7启动子后,经体外转录后的RNA转染RD细胞,转染后显微镜下连续观察是否出现细胞病变,并利用EV-D68的VP1特异性抗体进行免疫印迹确认. 结果 转染后24 h在显微镜下可以观察到典型的肠道病毒细胞病变,病变细胞裂解液的免疫印迹得到特异的EV-D68的VP1条带,这些结果显示包装出EV-D68病毒,这些包装的病毒经传代实验显示可以连续传代. 结论 成功构建EV-D68 cDNA感染性克隆.
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检测甲型流感病毒的绿色荧光蛋白报告系统的构建与鉴定
目的 构建pDZ-EGFP的真核表达重组质粒,转染MDCK细胞,建立增强型绿色荧光蛋白稳定转染的报告细胞系,提供更为直观、快速的检测甲型流感病毒的新途径.方法 将PCR扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入到pDZ载体中,将获得的pDZ-EGFP重组质粒用lipo-fectamine 2000转染MDCK细胞,通过G418进行选择培养,建立稳定转染的细胞系.传至3代,提取细胞总DNA,用EGFP的特异性引物进行PCR扩增及测序,鉴定细胞报告系统的稳定性；接种标准甲型流感毒株,用荧光显微镜和蛋白免疫印迹法检测EGFP的表达情况验证其应用性；另外,接种临床样本100份,用EGFP细胞报告系统检测的结果与Real-time RT-PCR检测结果进行比较,鉴定细胞报告系统的特异度和灵敏度.结果 稳定细胞系经传至3代,特异性EGFP引物利用PCR扩增到816bp的目的条带,测序结果与扩增的EGFP基因序列100％符合；稳定细胞系接种标准甲型流感毒株,24h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的增强表达,72h后用细胞裂解产物与EGFP的特异性抗体反应,获得目的条带；EGFP细胞报告系统检测的100份临床样本与Real-time RT-PCR检测结果相比,其特异度和灵敏度分别为88.52％和89.74％.结论 成功构建了pDZ-EGFP真核表达载体及稳定转染的MDCK细胞系,为甲型流感病毒的细胞培养鉴定及后期的致病机制的研究奠定了基础.
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肝炎病毒体外细胞培养体系的研究进展
病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的,以损害肝脏为主的感染性疾病.可以分为甲型、乙型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎.在这五种病毒性肝炎中,甲型肝炎和戊型肝炎是通过肠胃道传播的,其他三种肝炎则可以通过血液和体液传播.其中丁型肝炎病毒是缺陷病毒,它自身不会引起疾病,必需有乙型肝炎病毒的辅助才能感染宿主.本文就乙型、丙型和丁型肝炎的病原体即乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,:HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C Virus,HCV)和丁型肝炎病毒(hepatitis Delta Virus,HDV)体外细胞培养体系系统的研究现状作一简要综述.
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160六价铬诱导P53蛋白活化的机制
本研究探讨了Cr(Ⅵ)诱导P53活化的机制.培养人肺上皮细胞系A549并进行传代.取3×105A549细胞转入一个6孔平皿,于37℃下温孵24h,立即转染1μg报告质粒和1μg β-半乳糖苷酶(β-Gal)质粒,温孵过夜后冲洗,加入含10%FBS的F-12K培养基,再培养24h后加入5、10、20、50和100μmol/L的Cr(Ⅵ)溶液处理(未经处理的为对照),然后加入400μl报道溶解缓冲液,在4℃下抽提细胞2h;取80μl细胞溶解产物测量虫荧光素酶和β-Gal活性,结果以β-Gal标化的相对P53活性(与对照相比)来表示.另取经Cr处理后的A549细胞,抽提细胞经声处理断裂DNA和减少粘度,然后取20μl全细胞溶解产物加热、离心,进行蛋白印迹分析(Westernblot).取细胞溶解产物、20μlRecin/TNT(1:10)和10μg抗体在4℃下温孵过夜并离心,取上清进行Western blot反应.
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钙调神经磷酸酶Aβ小干扰RNA筛选及对心肌细胞肥大的抑制
目的 在细胞水平上筛选钙调神经磷酸酶(CaN)Aβ基因(mRNA)的小干扰RNA (siRNA)的干扰序列,为研究抑制在体心肌肥大的方法提供理论基础.方法 针对CaN Aβ mRNA,参照siRNA设计原则,应用软件设计候选干扰序列,构建相应的小发夹RNA表达载体(si1053,si 1280,si1539).培养乳鼠心肌细胞,分为6组:空白对照组,肥大模型组(醛固酮诱导),肥大+si 1280组,肥大+si1539组,肥大+si1053组,肥大+siGFP阴性对照组(转染针对GFP特定序列的shRNA质粒).48h后显微镜下测量心肌细胞直径、CaN Aβ及心房利钠因子(ANF)、β-重链肌球蛋白(β-MHC)mRNA水平.结果 肥大模型组心肌细胞直径以及心肌组织CaN Aβ、ANF、β-MHC mRNA表达水平较空白对照组明显增加(P＜0.05).肥大+si1053、肥大+si1280、肥大+si1539组细胞直径以及CaN Aβ、ANF mRNA水平均较肥大模型组及肥大+siGFP阴性对照组降低(P＜0.05),3组之间的CaNAβmRNA水平无明显差异(P＞0.05),其中肥大+si1280组的细胞直径、ANF及β-MHC mRNA水平较肥大+si1053组、肥大+si1539组有明显减低(P＜0.05).结论 成功构建CaN Aβ mRNA的小发夹RNA表达质粒,siRNA抑制CaN Aβ mRNA的表达,可抑制细胞水平醛固酮诱导的心肌细胞肥大；其中1280(21 bp)为RNA干扰的相对更有效片段.
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hPARP-1蛋白缺陷细胞株建立及生长特性
目的建立hPARP-1蛋白缺陷细胞株,观察该缺陷所引起的生物学效应.方法用构建的hPARP-1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-P)转染人胚肺成纤维细胞(HLF),用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hPARP-1基因的表达水平.同时观察转染细胞生长形态,绘制生长曲线,用流式细胞术观察细胞周期,软琼脂培养法鉴定转染细胞恶性程度.结果pEGFP-C1-P载体在转染细胞内可较稳定表达,hPARP-1蛋白缺陷细胞株hPARP-1基因的蛋白表达水平比HLF下降了47%,比绿色荧光蛋白载体(HLFC)低45%,HLFC比HLF仅少3%.转染后hPARP-1蛋白缺陷细胞生长形态、生长速度无明显变化,软琼脂培养未见细胞集落.hPARP-1缺陷细胞生长形态无明显变化,细胞倍增时间为0.89 d,与HLF细胞0.93 d接近,软琼脂培养未见细胞集落.结论成功建立和鉴定了hPARP-1蛋白缺陷细胞株,在正常生长环境中,该缺陷不足以单独引起可观察的生长特性改变.
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hMTH1缺陷细胞株建立及生物学特性研究
目的建立hMTH1缺陷细胞株,观察该缺陷所引起的生物学效应.方法用hMTH1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-T)转染人胚肺成纤维细胞(HLF),半定量RT-PCR鉴定其对hMTH1基因mRNA表达的抑制效果.同时观察转染细胞生长形态,绘制生长曲线,用流式细胞术观察细胞周期,软琼脂培养法鉴定恶性程度.结果 pEGFP-C1-T载体在转染细胞内可较稳定表达,缺陷细胞株hMTH1 mRNA表达水平比HLF细胞下降了47%.hMTH1缺陷细胞生长形态无明显变化,细胞倍增时间为0.89 d,与HLF细胞0.93 d接近,细胞周期各时相未受影响,软琼脂培养未见细胞集落.结论 hMTH1缺陷细胞株成功建立,该缺陷不足以单独引起可观察的生物学效应.
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影响聚乙烯亚胺体外转染细胞效率的因素研究
将外源基因导入真核细胞是分子生物学研究中的一项重要技术。转基因载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体系统转染效率高，是体内基因治疗的主要工具，但安全性存在隐患，且有免疫原性，体内不能反复应用，制备较复杂，而且所能装载的外源DNA大小有限，使其应用受到很大限制。
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人谷胱甘肽硫转移酶A1基因在CHO细胞中的表达
目的 构建人谷胱甘肽硫转移酶A1(GSTA1)的CHO细胞表达体系.方法 重组质粒pDNA3.1-GSTA1用lipofectamineTM 2000转染CHO细胞,用G418筛选细胞的阳性克隆,并用PCR、RT-PCR和Western blot进行鉴定,测定GSTA1酶活性.结果 将pDNA3.1-GSTA1转染CHO细胞,用G418筛选,用PCR、RT-PCR和Westem blot进行鉴定,表明GSTA1基因已转染到CHO细胞的基因组,并转录表达,生成GSTA1蛋白质,经测定活性达到35mmol/(mg·min蛋白).结论 CHO-GSTA1细胞表达,为基因工程生产具有完整功能GST A1的进一步纯化提供了材料.
关键词： 谷胱甘肽硫转移酶A1 CHO细胞 转染 转移酶 -
MTB线粒体翻译控制28蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化
对MTB线粒体翻译控制(mitochondrial translation control,MTC) 蛋白MTC28基因进行克隆, 构建真核表达质粒并在昆虫细胞中表达MTC28蛋白.采用PCR技术从MTB H37Rv 标准株基因组中扩增MTC28基因片断,MTC28基因片断和质粒pFastbac1经EcoRI和XhoI双酶切,T4 DNH连接酶连接,构建重组质粒pFastbac1-MTC28,转染DH5α感受态细菌,在含有氨苄青霉素溶菌肉汤(lysogeny broth,LB)固体培养基中筛选阳性克隆,挑选生长的菌落进而在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中进行细菌克隆.PCR鉴定目的基因插入质粒后,阳性克隆细菌进行质粒(pFastbac1-MTC28)的提取.pFastbac1-MTC28质粒转染DH10 Bac感受态细菌构建重组杆状质粒(Bacmid-MTC28),用含有庆大霉素、卡那霉素和四环素的液体LB培养基进行细菌克隆,采取蓝白斑技术筛选阳性菌落.PCR鉴定为阳性的细菌进行杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)的提取.利用脂质介导的转染技术,将杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)转染sf9昆虫细胞中,包装重组杆状病毒,并表达蛋白质.结果成功构建了MTC28真核表达质粒,建立了杆状病毒表达MTC28蛋白的表达体系,并表达MTC28蛋白,通过纯化获得了高纯度且均一化的MTC28蛋白.
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蚊虫体内共生菌沃尔巴克氏体研究进展
沃尔巴克氏体(Wolbachia)是一类广泛存在于节肢动物和线虫体内的革兰氏阴性共生菌,能够通过细胞质不亲和、雄性雌性化、杀雄、孤雌生殖和增强雄性或雌性的生殖力等多种机制调控宿主的生殖行为.近年来的研究还发现Wolbachia在蚊虫及蚊媒病防治、抗病毒和物种进化等方面具有重要作用.本文综述了国内外有关蚊虫体内共生菌Wolbachia的分布、感染情况、检测方法、体外培养及转染等方面的研究进展,并对Wolbachia在蚊虫及蚊媒病防治领域的应用进行阐述.
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《分子佐剂C3d增强hCG-β基因避孕疫苗Th2型体液免疫效应》通过专家鉴定
目前,hCG疫苗研制与应用已取得进展,但其免疫原性弱、体内存留时间短等问题仍待解决.复旦大学附属妇产科研究所于2000年6月～2002年12月,将分子佐剂C3d引入基因避孕疫苗,构建了pCMV4-hCG β-C3d和pCDNA3-hCG β-C3d表达质粒并转染了真核细胞,成功表达了hCG β-C3d融合蛋白.
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化学合成小干扰RNA体外转染大鼠支持细胞的实验研究
目的:观察化学合成siRNA阻断大鼠支持细胞内源性基因表达的可行性,并优化转染条件.方法:体外取SD大鼠睾丸,分离、培养支持细胞,应用化学合成的不同浓度siRNA在阳离子脂质体Lipofectamice TM 2000介导下转染原代支持细胞.RT-PCR检测大鼠支持细胞中GAPDH mRNA水平的变化,MTT法检测支持细胞的活性.结果:转染终浓度为150nmol/L的siRNA能特异性有效的阻断GAPDH基因的表达,细胞毒性随浓度提高而增强,终浓度为200nmoL/L的siRNA对细胞有明显毒性.结论:siRNA能在大鼠支持细胞内启动RNA干扰,150nmol/L的siRNA能特异有效地阻断内源基因表达并保持较高的细胞活性.
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阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70在体转染大鼠心肌的实验研究
目的:探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70在体转染大鼠心肌的安全性和有效性.方法:应用原子转移自由基聚合(ATRP)法合成具有高度生物相容性的双嵌段磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70,并对材料的溶液进行表征;将22只雄性SD大鼠随机分为4组:Ⅰ组(生理盐水组,n=4),Ⅱ组(低剂量PC组,n=6),Ⅲ组(中剂量PC组,n=6)和Ⅳ组(高剂量PC组,n=6).采用心肌局部注射方式实施在体心肌转染,各组在转染7天后处死大鼠,取心肌组织作快速冰冻切片;应用荧光显微镜(FM)、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察PC聚合物的转染情况及在心肌细胞内的分布、定位.结果:在荧光显微镜下观察PC聚合物转染情况,生理盐水组隐约可见淡绿色荧光,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组均可见明显绿色荧光,并与PC聚合物浓度呈剂量依赖性;共聚焦激光扫描显微镜观察PC聚合物可以转染进入心脏细胞,大部分分布于细胞质及核周围,少部分可以进入到细胞核内;各转染组荧光强度与阴性对照组相比,其差异均有统计学意义(P＜0.001),其中Ⅳ组平均荧光强度高,且与其他两组比较均有统计学意义(P＜0.001).结论:磷酸胆碱聚合物可以在体转染进入大鼠心脏组织,是一种安全有效的非病毒类药物运输裁体.
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反义寡核苷酸体外抗乙型肝炎病毒研究
目的探讨反义寡核苷酸的体外抗病毒作用,为基因水平上防治乙型肝炎病毒(HBV)感染及HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据.方法用PCR方法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区、DR2区、ENⅡ区的反义寡核苷酸(AsON)及无关序列,其中针对ENⅡ设计的AsON,目前尚未见互补于该区段反义寡核苷酸的报道.以HBV DNA转染的HepG2.2.15细胞为靶细胞,ELISA法检测AsON作用前后细胞上清中的HBsAg和HBeAg分泌情况.结果当AsON的佳作用浓度为10 μmol/L时,3种反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg抑制率分别为:57%、60%、52%和56%、45%、56%,AsON 对HBV抗原的抑制作用具双峰现象.无关序列无明显抑制作用(<12%).利用锥虫蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色试验观察到当AsON作用浓度为40 μmol/L时,对细胞代谢无明显毒副作用.结论反义寡核苷酸封闭HBV X基因区的关键区段,可有效抑制HBV抗原的分泌.
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JWA基因的蛋白缺陷对苯并(a)芘所致HeLa细胞DNA损伤的影响
目的研究JWA基因表达缺陷对苯并(a)芘诱导细胞DNA损伤与修复的影响及可能机制.方法构建JWA基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-asJWA),用该载体稳定转染人宫颈癌细胞(HeLa)获得JWA蛋白缺陷细胞株(asJWA-HeLa),在含有S9的培养条件下以50 μmol/L苯并(a)芘处理细胞3 h,再恢复不同时间,用碱性单细胞凝胶电泳方法鉴定DNA损伤程度.结果 asJWA-HeLa细胞JWA蛋白表达水平比对照下降了69%.在苯并(a)芘致DNA损伤模型中,asJWA-HeLa细胞的DNA损伤程度重于对照细胞,并且出现明显的DNA修复延迟现象.结论JWA作为一种新的环境应答基因,活跃地参与了苯并(a)芘诱导的HeLa细胞DNA损伤与修复过程,并在其中起着积极的保护作用.
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半边旗中二萜类化合物5F诱导胰腺癌细胞凋亡机制的探讨
目的:观察研究半边旗中二萜类化合物5F(1la-羟基-15-氧-16-烯-ent贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺癌细胞株AsPC-1凋亡的效果及其机制.方法:用脂质体转染法将PUMA/siRNA导入AsPC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆.将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度为8.875μmol·L-1、37.5μmol·L-1、142μmol·L-1的5F中作用72h.RT-PcR检测不同组细胞经5F作用24h后的PuMA表达;MTT检测细胞生长抑制,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,Hoechst33258和PI双染色染色了解细胞凋亡的变化.结果:5F促进AsPC-1细胞凋亡,抑制细胞生长,并有明显的剂量依赖性,在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调;当PUMA表达抑制后,受5F作用的细胞出现PUMA表达的降低,同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞的明显增殖.结论:5F促进体外AsPC-1细胞凋亡,并抑制其生长,其诱导凋亡与上调PUMA有关.
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聚乙二醇化骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达测定
目的:聚乙二醇化骨形态发生蛋白-2基因(PEG/BMP-2)纳米颗粒转染兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs),检测骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在靶细胞中的表达.方法:原代分离培养rBMSCs,分别采用PEG/BMP-2、脂质体/BMP-2转染细胞,采用流式细胞仪检测转染效率,采用Western Blot和real time RT-PCR方法检测BMP-2表达.结果:成功制备出PEG/BMP-2纳米颗粒并将PEG/BMP-2转染至rBMSCs,转染细胞中BMP-2呈高表达,且与脂质体转染法相比,具有更高的转染效率.结论:PEG/BMP-2纳米颗粒转染rBMSCs可高表达BMP-2,为骨缺损治疗修复提供新的治疗方法.
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敲减SOX9基因对骨髓间充质干细胞表达的影响
目的:构建小鼠S0X9基因干扰的慢病毒载体,体外转染小鼠骨髓间充质干细胞,观察小鼠SOX9基因在小鼠间充质干细胞中的表达影响.方法:针对小鼠SOX9基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的双链DNAoligo连入酶切后的RNA干扰载体上,构建Lenti-SOX9-siRNA-EGFP载体,鉴定扩增.利用SOX9基因沉默载体体外转染小鼠骨髓间充质细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染是否成功,并通过流式细胞仪测定转染效率.同时利用RT-PCR和Western Blot检测小鼠SOX9基因的表达.结果:成功构建了Lenti-SOX9-siRNA-EGFP,SOX9基因沉默慢病毒载体,能高效转染小鼠骨髓间充质细胞.RT-PCR和Western Blot检测显示经SOX9基因转染的小鼠骨髓间充质细胞基因表达沉默.结论:利用慢病毒结合RNA干扰技术敲减小鼠SOX9基因成功地转染小鼠骨髓间充质干细胞,且SOX9基因在小鼠骨髓间充质干细胞中发生了沉默,这为SOX9修复软骨损伤的进一步研究奠定了基础.
关键词： Sox9 慢病毒属 转染 骨髓间充质干细胞细胞 -
大鼠中枢神经系统体内基因转染及功能蛋白表达的实验研究
目的:通过实验进一步探讨局部应用神经生长因子的途径和方法.方法:24只SD大鼠共分为实验组和对照组(每组12只).腹腔麻醉后,俯卧位切开胸椎椎板.用微量注射器,分别对其进行经DOTAP转染的含报告基因质粒(实验组)和空载体-脂质体粒(对照组)的鞘内直接注射.术后2用处死动物,取相应节段脊髓组织行RT-PCR及免疫组化检测.结果:免疫组化发现,在实验组脊髓组织胶质细胞及神经元中可见beta-半乳糖苷酶阳性染色.同样,在相同组织RT-PCR检测到Lac Z mRNA.而对照组无上述阳性发现.结论:外源性基因于体内神经组织中有效转染是目前治疗脊髓损伤的热点.通过上述技术将特定神经生长因子输入局部损伤区域,有助于促进中枢神经再生,避免早期继发损伤.
