首页 > 文献资料
-
含不同启动子的重组9型腺相关病毒载体转染大鼠心肌细胞表达效率的差异
9型腺相关病毒( AAV9)作为基因治疗心脏疾病的佳载体之一而成为近年来研究的热点[1],但影响AAV9转导效率的因素很多,其中载体上的启动子和受体细胞是否合适是直接影响到目的基因的转录效率和表达水平的重要因素[2],本研究分别选用含CMV启动子和CBA启动子的rAAV9携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染心肌细胞,比较两个启动子在心肌细胞的转录活性以及对细胞生长的影响,从而为AAV9携带靶基因高效转染心肌细胞以及应用于心脏疾病的基因治疗提供实验资料.
-
O139群霍乱弧菌中溶原性噬菌体CTXФ的诱导及转染性研究
目的探讨新出现的O139群霍乱弧菌中溶原性噬菌体CTXΦ的来源及其是否可产生感染性的噬菌体颗粒,从而造成毒素基因的水平转移. 方法用DNA破坏剂丝裂霉素C诱导噬菌体CTXΦ基因组被四环素抗性基因标记的O139菌株BJ30, 继而体外转染古典型标准菌株569B和O395,对获得的四环素抗性的转导菌株进行转染噬菌体基因组的鉴定. 结果序列同源性分析表明,BJ30菌株中的rstR基因与O1群El Tor型菌株的rstR基因完全一致;丝裂霉素C诱导获得了感染性噬菌体颗粒 (CTX-TcΦ), 并成功感染O1群霍乱弧菌569B和O395,转染率分别为1.04×10-4和3.27×10-6. 结论 O139群霍乱弧菌能产生感染性CTXΦ颗粒,El Tor型菌株不是产生CTXΦ的唯一来源.
-
质粒介导的RNAi技术对截短HCMV IE2基因表达的抑制作用
目的应用质粒介导的RNA干扰技术研究siRNA抑制截短HCMV IE2基因的表达的作用.方法以pLL3.7质粒为模板,采用半套式PCR的方法扩增出含U6启动子的siRNA表达片段,连接pMD-T simple vector构建效应质粒表达重组体pMD-T-shRNAR1和pMD-T-shRNAR2.同时采用RT-PCR方法从HCMV AD169株基因组中调取目的截短基因IE2,定向克隆到带有绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上,构建HCMV AD169株截短IE2基因重组表达质粒pEGFP-C1-IE2;用脂质体共转染效应质粒和靶基因表达重组体至Hep-2细胞中,荧光显微镜下观察效应质粒的RNA干涉作用,并观察RNA干扰的时效和量效改变.结果三组质粒重组体构建成功,克隆到的2个shRNA表达载体对截短IE2基因的表达都有干涉作用.在与靶基因质粒量比为1:1和1:2时,其中pMD-T-shRNAR1 48～72 h间干涉效应为100%,可完全封闭IE2的表达;pMD-T-shRNAR2使IE2处于极低水平表达,48～72 h间干涉效应达到98.4%～99%.结论通过质粒介导的RNAi技术能够有效地抑制HCMV IE2基因的表达,为治疗HCMV感染的药物开发提供了思路.
-
表达HIV Vpr细胞株的建立及其促细胞凋亡作用的研究
目的 建立稳定表达人免疫缺陷病毒(HIV)Vpr蛋白的细胞株,观察Vpr蛋白促进感染细胞凋亡的特性,以及Vpr变异后对其致凋亡作用的影响.方法 以携带野生株HIV Vpr基因和突变株HIV vpr-FS基因的质粒分别转染HeLa细胞,建立稳定表达HIV Vpr蛋白的细胞株,以流式细胞仪和细胞内DNA片段分析法检测细胞凋亡效果,观察Vpr蛋白促细胞凋亡的特性,以及两者致凋亡作用的区别.结果 重组质粒pcDNA3.1-vpr和pcDNA3.1-vpr-FS经酶切后均可获得342bp产物,DNA测序结果与目的 基因已知序列完全一致;上述质粒转染的HeLa细胞,RT-PCR检测到目的 基因vpr或vpr-FS的表达,Western blot检测到明显Vpr或Vpr-FS蛋白的表达.流式细胞仪和细胞内DNA片段分析法分别检测细胞凋亡,显示野生株HeLa pcDNA3.1-vpr组的凋亡率明显高于对照组,而变异株HeLa pcDNA3.1-vpr-FS的凋亡率与对照组无明显差别.结论 成功建立了表达HIV Vpr和HIVVpr-FS蛋白的感染细胞株.实验显示HIV Vpr蛋白能促进感染细胞的凋亡,而Vpr蛋白的变异可能使其促进细胞凋亡作用减弱.实验结果为下一步研究提供了基础资料.
-
乙肝病毒核心启动子部分缺失对其活性及X蛋白转式激活作用的影响
目的研究乙型肝炎病毒(HBV)20/21bp缺失(nt1 748/1 747～nt 1 767)的核心启动子(CP)的活性及CP部分缺失对X蛋白转式激活作用的影响. 方法将HBV CP nt 1 601～1 860区段克隆到氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因表达载体(pCAT3-Basic)上,构建重组pCAT3质粒(20d-pCAT3、21d-pCAT3、wt-pCAT3)转染HepG2细胞以检测CP活性.将wt-pCAT3与野毒株型或CP 20/21bp部分缺失的含1.2拷贝HBV全基因重组质粒(P3.8Ⅰ、20d-P3.8Ⅰ、21d-P3.8Ⅰ)共转染HepG2细胞以检测X蛋白的转式激活作用.ELISA方法检测CAT表达量. 结果 PCR扩增和双酶切初步筛选的克隆株,经测序终鉴定重组质粒克隆成功.重组pCAT3质粒转染HepG2细胞表明,CP缺失的重组表达载体(20d-pCAT3、21d-pCAT3)较野毒株型CP的重组表达载体(wt-pCAT3)产生的CAT量明显下降,均仅为后者的14.2%;共转染试验表明,wt-pCAT3 可被P3.8Ⅰ产生的完整X蛋白转式激活,而分别不能或仅能较弱地被共转染的20d-P3.8Ⅰ、21d-P3.8Ⅰ产生的截短的X蛋白所改变. 结论 HBV 20/21bp缺失的CP活性较野毒株型CP活性显著下降;CP20/21bp缺失株的X蛋白难以发挥转式激活作用.
-
一种新型的乙型肝炎病毒剪接变异体
目的证实乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)前基因组RNA在458nt～1308nt(nt,核苷酸)之间可发生剪接并产生相应的基因组剪接变异体. 方法对1株分离自慢性乙型肝炎患者血清的亚基因组HBV DNA(2366bp)进行测序并以Vector NTI6.0软件进行分析.将全基因组HBV DNA(3215bp)理论上可能的剪接供体及受体内的核苷酸进行定点突变并将突变株转染HepG2细胞,以位于HBV DNA 458nt及1308nt两侧的特异引物检测转染后的细胞内HBV核心颗粒DNA,并以相同引物检测458nt～1308nt发生缺失的HBV DNA在不同病程的乙型肝炎患者血清中的存在情况. 结果2366bp HBV DNA在458nt～1308nt之间发生缺失并符合GT-AG剪接模式.3215bp全基因组HBV DNA在459nt及1306nt分别发生G→A及A→C突变后均不能产生458nt～1308nt缺失.458nt～1308nt发生缺失的HBV DNA在慢性乙型肝炎、肝硬化及原发性肝细胞癌患者血清的检出率分别为80%、75%及70%,显著高于HBV无症状携带者10%的检出率. 结论 HBV前基因组RNA在458nt～1308nt之间可发生剪接并产生长度为2366bp的基因组剪接变异体.该类型基因组剪接变异体基因结构特点及在HBV相关性肝病中广泛存在提示它与HBV致病性密切相关.
-
乙脑病毒prME蛋白编码基因表达分析及不同DNA免疫方法比较
将构建的含流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV) prME蛋白编码基因的重组质粒(pJME)以不同浓度(10μg、5μg以及3μg)分别转染于HepG2细胞中,Western blot法分析重组质粒表达特点,肌肉与基因枪注射方式将pJME免疫BALB/c鼠,二次免疫后3周,腹腔注射乙脑病毒JaGAr-01株,105 PFU/100μl作为病毒攻击观察21 d.
-
剪接导致截短的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白可诱导肝细胞空泡化
目的研究458～1308nt乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体截短的表面抗原大蛋白(large surface antigen, LS)的肝细胞致病性.方法将458～1308nt剪接变异体HBV DNA(基因号为AY238972,长度为2366bp)及全长HBV DNA(基因号AY206390,长度3215bp)中PreS2及S起始密码由ATG定点突变为ACG.以突变后的剪接变异体DNA为模板,PCR扩增剪接产生的截短 LS编码基因(LS-splice)及LS氨基端276个氨基酸的编码基因(LS276);以突变后的全长HBV DNA 为模板,PCR扩增全长LS编码基因.将上述DNA片段克隆至pCDNA3.1/Hyg(-)真核表达载体.重组载体以脂质体转染HepG2及Chang肝细胞,以HE染色观察细胞的空泡病变,并以流式细胞仪检测转染细胞的凋亡率.结果表达LS、LS-splice 、LS276的重组载体转染后均可引起HepG2及Chang肝细胞发生空泡样病变.此外,LS可引起HepG2及Chang肝细胞凋亡,而LS276、LS-splice致肝细胞凋亡作用消失.结论 458～1308nt HBV基因组剪接变异体产生的截短 LS可致肝细胞病变,其作用与其氨基端276个氨基酸有关.该类型HBV基因组剪接变异体在乙型肝炎发生发展中可能具有一定作用.
-
重组9型腺相关病毒载体转染小鼠心脏及对心功能的影响
目的 探讨重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated serotype 9,rAAV9)载体对小鼠心脏的转染效果及对心功能的影响.方法 16只昆明种小鼠经尾静脉将携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的rAAV9(rAAV9-eGFP)转染入小鼠,于7、14、21、28 d留取标本,使用荧光显微镜观察eGFP在心肌、肝、肺、肾、脑、骨骼肌的荧光表达,Western blot法检测eGFP)的蛋白表达.另20只昆明种小鼠随机分为2组,每组10只,分别经尾静脉注射rAAV9-eGFP)和生理盐水,28 d后行心脏超声及血流动力学检查.结果 rAAV9-eGFP经尾静脉注射21 d时eGFP表达在心脏达到高峰,转染效率可达32%,在其他脏器表达量少或无表达.rAAV9-eGFP组较生理盐水组心功能差异无统计学意义(P＞0.05).结论 rAAV9可通过外周静脉注射在心脏较高表达,且对心功能无不良影响.
-
针对S基因的siRNA抑制HepG2 2.2.15细胞中HBV基因的表达
目的构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA(short interfering RNA)表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,观察其对HepG2 2.2.15细胞中的HBV基因表达的影响.方法设计并合成针对HBV S区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG2 2.2.15细胞,经200μg/ml潮霉素抗性筛选,4周后获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,免疫荧光染色检测细胞内抗原的表达,同时用RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果成功构建了针对HBV S基因的siRNA表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,两种siRNA均能明显抑制HepG2 2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为83%和78%,免疫荧光染色显示siRNA能抑制细胞内抗原的合成,RT-PCR结果证实HBV的mRNA表达降低,而无关序列的siRNA和对照则无此作用.结论载体产生的针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达.
-
重组腺相关病毒对大鼠神经干细胞的体外转染及其对细胞生长的影响
目的 研究重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体对原代培养的神经于细胞(neural stem cells,NSC)的体外转染及其对细胞增殖、分化和迁移能力的影响.方法 取新生24 h内的Wistar大鼠的海马进行神经干细胞原代培养,用不同滴度的rAAV为载体,以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因作为报告基因进行体外转染NSC,通过观察有绿色荧光的Nsc的数量,测定rAAV对NSC的体外转染情况;用MTT法测定不同病毒滴度下rAAV对NSC增殖能力的影响,用免疫组化法鉴定NSC、神经元及神经胶质细胞,并在倒置荧光显微镜下直接测定细胞的迁移距离.结果 rAAV对NSC的体外转染效率随着病毒滴度的增加而提高,在转染后的第11天表达水平高,用MOI为104、105、106的rAAV转染后第11天的转导率分别是9.81%、56.30%、64.67%;不同滴度rAAV转染NSC后不同时间点的MTT测定A值随着病毒滴度的增加而明显减小,差异均有统计学意义;但不同滴度rAAV转染NSC,其分化为神经元和神经胶质细胞的比率以及迁移的距离未见差异.结论 较高滴度(MOI为105和106)的rAAV可以在体外有效地转染神经干细胞,且不影响神经干细胞的分化和迁移能力,但对其增殖能力有明显抑制,并表现为病毒滴度依赖性.
-
HCV准种的结构蛋白在真核表达系统中的表达
本实验从1份HCV持续性感染者血标本中随机筛选的8个C/E1/E2克隆序列亚克隆入真核表达载体pCI-neo,并转染大肠杆菌DH5α,经氨苄青霉筛选、酶切鉴定及DNA测序,构建为插入C/E1/E2的重组质粒.将1μg重组质粒、0.36 mCi/ml H3-亮氨酸加入TNT/T7 Couple Reticulocyte Lysate Systems (含有25μl TNT Lysate、4U T7 RNA聚合酶、20μmol/L不含亮氨酸的氨基酸混合物、40U RNA酶抑制剂),总反应体积50μl.取5μl反应液进行12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,抽干凝胶,-70℃放射自显影3 d.
-
El Tor型霍乱弧菌疫苗候选株IEM108抗CTXΦ转染的生物安全性试验
CTXΦ超免疫是由rstR介导的,rstR抑制后转染进入CTXΦ中rstAB基因表达所引发的基因组复制与整合.Davis等[1]以rstR抑制携带CTXΦ基因组的重组自杀质粒在菌细胞内的复制来研究rstR的作用,我们简化了rstR对rstAB转录表达抑制的实验模型,采用比较克隆有RS区的重组自杀质粒接合转移频率的方式来进行安全性评价.
-
CTLA4-Ig重组腺相关病毒载体的构建及转染表达效果
重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体是目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一.本研究通过构建CTLA4-Ig基因重组腺相关病毒载体(rAAV-CTLA4-Ig),研究其对大鼠转染的表达效果及规律.
-
靶向核糖核酸酶在体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究
目的观察HBV靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease,TR)的体外抗病毒作用. 方法将包含HBV核心蛋白(HBVc)和人类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN)编码基因克隆入pcDNA3.1(-),构建HBV TR重组真核表达载体p/TR.构建包含HBV核心蛋白、人类嗜酸性粒细胞来源的神经毒素以及突变失活的HBV TR编码基因的重组真核表达载体p/HBVc、p/hEDN、p/TRmut (hEDN的Lys113→Arg,失去其RNase活性)作为对照.脂质体转染p/TR、p/HBVc、p/hEDN、p/Trmut、pcDNA3.1(-)进入2.2.15细胞.转染后,RT-PCR证实转染基因的表达,通过观察转染细胞的形态核MTT法检测转基因表达的细胞毒性.用固相放免法测定转染细胞培养上清HBsAg浓度. 结果转基因在2.2.15细胞内都有表达,且对细胞无毒性.与空转染组相比,pcDNA3.1(-)/TR转染组HBsAg含量下降58%;对照各质粒无此变化. 结论 TR在体外可以抑制HBV复制,同时对宿主细胞无毒性.TR可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗乙肝病毒感染.
-
反义DcR3 RNA转染诱导肝癌细胞凋亡的作用
目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用.方法构建pVAXI-as-DcR3反义表达载体,转染肝癌细胞,Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低,流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化.结果 Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达,同时转染了pVAXI-as-DcR3的肝癌细胞凋亡较对照组增多.结论 DcR3反义RNA可使肝癌细胞凋亡增多.
-
不同免疫策略获得c-erbB2单克隆抗体及其结合特性的比较
人类c-erbB2/HER2原癌基因属于EGFR家族.将c-erbB2真核表达载体转染NIH3T3细胞,可赋予该细胞以恶性表型[1];1998年由鼠源抗erbB2抗体人源化改造而来的Herceptin(商品名)已被美国FDA批准用以治疗c-erbB2高表达的转移乳腺癌,并已获得较好的临床治疗效果[2].本工作采用不同免疫策略获得了数株c-erbB2单抗,并对其与靶分子的结合特性进行了比较分析,提出了相对更易获得能与天然erbB2结合的抗体制备策略,可供后续工作参考.
-
地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应
为了检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因诱导的体液免疫反应.我们采用PCR技术从宫颈癌组织中获得HPV16L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组pcDNA-L1,转染Cos-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达.
-
修饰CⅡTA基因抑制异种器官移植中供体猪SLA的表达
目的构建可抑制猪MHC(SLA)Ⅱ类分子表达的MHCⅡ类分子反式激活因子(CⅡTA)突变体,抑制人CD4+ T细胞对猪细胞株的免疫应答,为异种器官的应用研究奠定基础. 方法用PCR、人工合成寡核苷酸、限制性内切酶等技术构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2、含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3突变体.用脂质体转染法将上述2种突变体及pcDNA3空载体转入猪细胞株PIEC细胞和L23细胞.用流式细胞术和RT-PCR法观察它们对PIEC/L23细胞SLA-DR/DQ分子的诱导性和组成性表达的影响.通过混合淋巴细胞反应观察人CD4+ T细胞对转入突变体及空载体后的猪细胞的免疫应答强度的变化. 结果在细胞和分子水平证实pcDNA3mCⅡTA3对PIEC/L23细胞SLA-DR/DQ的表达起明显抑制作用,而pcDNA3mCⅡTA2和pcDNA3空载体无此作用.SLAⅡ类分子受抑制的猪细胞已基本丧失了对人CD4+ T细胞的刺激能力. 结论转染能抑制SLAⅡ类分子表达的突变体使PIEC细胞丧失了对人CD4+ T细胞的刺激能力,为异种器官的修饰提供了新的思路.
-
RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子拮抗肾脏纤维化的发展
目的 研究RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子(CTGF)对高血压大鼠肾脏纤维化指标的影响.方法 本研究于2006-2008年在武汉协和医院心血管病研究所完成,实验以自发性高血压大鼠(SHR)为动物模型,随机(随机数字法)分为未干预的SHR组(n=10)和RNA干扰组(RNAi组,n=10),并设置WKY大鼠(n=8)为正常对照组.构建并筛选出靶向大鼠CTGF的RNAi质粒重组体,通过升主动脉钳夹冠脉灌注法联合尾静脉注射将质粒转染至大鼠体内,RNA干扰结束后,获取肾脏标本,RT-PCR和Western blotting检测肾脏组织CTGF及纤维连接蛋白(FN)的mRNA和蛋白表达,免疫组化技术分析CTGF及FN在肾脏的空间表达.0.1%天狼星红-饱和苦味酸胶原染色分析肾组织胶原类型及代谢水平(以胶原容积分数CVF表示),比色法测定肾脏组织羟脯氨酸含量.所有数据以(x-±s)表示,多个均数的组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为有统计学意义.结果 RNA干扰使高血压大鼠肾脏组织CTGF的mRNA和蛋白表达分别下调66%和62%(P<0.01),FN mRNA和蛋白的表达也相应降低达56%和51%(P<0.01);免疫组化显示了同样的抑制效应,而且观察到CTGF及FN不同的空间表达,CTGF在肾实质和间质中均可表达,而FN主要在肾脏间质表达.天狼星红染色显示RNA干扰组胶原沉积减少,偏光显微镜下进一步观察到RNA 干扰主要抑制了I型胶原的合成;肾脏组织羟脯氨酸含量在RNA干扰组显著减少[SHR组:(0.596±0.067)μg/mg,RNAi组:(0.368±0.084)μg/mg,P<0.01].结论 C-CTGF靶向性RNA干扰显著下调肾组织中CTGF的表达并相应抑制细胞外基质在肾间质的沉积,且这种效应独立于降压之外.提示CTGF在肾脏纤维化发生及进展中起着关键作用.
