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超声靶向破坏微泡技术介导shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK1基因表达
目的 探讨应用超声靶向破坏微泡(UTMD)技术介导shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK1基因表达的能力.方法 构建并筛选shRNA佳表达载体.体外培养肝癌细胞Hca-F,共分为5组:A组为空白对照组;B组为shRNA质粒组;C组为脂质体组;D组为超声微泡+超声辐照组;E组为脂质体+超声微泡+超声辐照组.应用倒置荧光显微镜观察转染率;荧光定量PCR检测JNK1的mRNA水平;Western-Blot检测JNK1的蛋白质表达.结果 获得了shRNA干扰效果好的表达载体.各组转染率比较:E组均大于B、C、D组(P均＜0.05);C、D组之间差异无统计学意义(P＞0.05).荧光定量PCR和Western-Blot检测各组JNK1mRNA和蛋白表达比较:E组的JNK1mRNA和蛋白表达水平均低(P均＜0.05).结论 脂质体转染法与UTMD技术结合可以提高小鼠肝癌细胞株JNK1 shRNA的转染效率,并能够增强基因表达的抑制效果.
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超声微泡造影剂介导小鼠骨骼肌基因转染实验研究
目的探讨微泡造影剂在超声作用下是否可增加小鼠骨骼肌基因转染效率.方法 40只昆明小鼠随机分为4组,每组10只,第一组:在胫前肌注射造影剂与绿色荧光蛋白(GFP)质粒的混合溶液;第二组:注射与第一组相同的混合溶液后立即加超声辐照;第三组:注射GFP;第四组:在注射GFP后立即用超声辐照.7天后取小鼠胫前肌观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果第一组与第二组有较多GFP表达,部分肌纤维绿色荧光较明亮,部分较暗淡;第三组和第四组GFP表达量较少.第一组与其余各组间的差异有显著性意义,P＜0.05;第二组与其余各组间的差异有显著性意义,P＜0.05;第三组与第四组间的差异无显著性意义,P＞0.05.结论超声微泡造影剂在超声作用下可明显增强小鼠骨骼肌的基因转染效率;未加超声波作用时,直接肌注携基因的超声微泡造影剂亦可增加小鼠骨骼肌的基因转染效率.
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裸鼠模型的人钠/碘转运体基因转染人大细胞肺癌介导放射性核素显像
目的 在动物体内实验观察人钠/碘转运体(hNIS)基因转染人大细胞肺癌介导放射性核素显像是否可行.方法 ①利用重组质粒以脂质体转染法将hNIS基因转染人人大细胞肺癌H460细胞系中,获得稳定表达hNIS的细胞株(hNIs-H460).②用hNIS-H460细胞株建立大细胞肺癌荷瘤课鼠模型,进行放射性核素99m TcO4-显像和131I显像.结果 ①体外实验表明hNIS-H460细胞株可以摄取碘.②裸鼠大细胞肺癌(hNIS-H460)移植瘤的99m TcO4和131I显像结果较清晰.结论 转染后的hNIS-H460细胞具有一定的摄碘能力.裸鼠大细胞肺癌(hNIS-H460)移植瘤可以进行99m TcO4和131I显像;99mTco4-显像的质量优于131I显像.
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超声空化脂质体微气泡促反义寡核苷酸转染的体外实验研究
目的: 探讨超声空化脂质体微气泡转染反义寡核苷酸HA2741的有效性与安全性.材料和方法: 12孔板培养人乳腺癌细胞并分为: (1)单纯超声照射;(2)单纯造影剂;(3)单纯HA2741;(4)超声照射+HA2741;(5)造影剂+HA2741;(6)造影剂+HA2741+超声照射;(7)脂质体+HA2741;(8)脂质体+HA2741+超声照射.声波发射强度-18.0～0 dB,照射时间5～240 s,给予实验刺激后,荧光显微镜观察HA2741的转染率及细胞的活性,免疫组化检测HER-2蛋白的表达.结果: 第(6)组HA2741转染率显著高于其余各组,约94.6%,造影剂浓度2%、5%时转染效率高,提高造影剂浓度,转染效率无改变,但细胞活性显著下降.声波发射强度-3.0～-6.0dB,照射时间30～60s,细胞转染效率高.乳腺癌细胞的HER-2蛋白表达下调,其程度与HA2741转染率呈正相关.结论: 超声空化微气泡造影剂显著增加了基因的转染,安全、简便具有良好的靶向性.
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重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定
目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体,为进一步的基因转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165,并克隆入穿梭质粒pAdTraek CMV.构建的质粒pAdTrack CMV-VEGF165经酶切及测序鉴定正确后,通过pAdeasy 1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrack CMV.VEGF165共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrack CMV.VEGF165.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,测定病毒滴度.结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF,病毒滴度为0.5×10"pfu/ml.结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础.
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HBx蛋白对人T细胞抗炎性细胞因子分泌的影响
目的 探讨HBx蛋白对人T细胞抗炎性细胞因子分泌的影响.方法 构建HBx蛋白的绿色荧光蛋白真核表达载体HBx-pEGFP-C1,双酶切(HindⅢ和Kpn Ⅰ)、DNA测序鉴定.利用脂质体转染技术将质粒HBx-pEGFP-C1瞬时转染人T细胞系Jurkat细胞株,荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP,RT-PCR方法检测X基因的表达情况.PHA(10 μg/ml)刺激活化预转染的Jurkat细胞6 h、24 h和48 h后,采用RTPCR技术在mRNA水平检测Jurkat细胞分泌IL-4、IL-10、IL-13和IL-14等抗炎性细胞因子的变化.结果 成功构建HBx-pEGFP-C1真核表达载体,并成功转染Jurkat细胞；与对照组相比,转染HBx蛋白组Jurkat细胞分泌IL-4、IL-10、IL-13和IL-14均明显降低(P＜0.05).结论 HBx蛋白即时高表达可降低人T细胞抗炎性细 胞因子的表达.
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干细胞生长因子反义寡核苷酸对肝癌细胞中原癌基因蛋白质c-kit及碱性成纤维细胞生长因子表达的影响
目的 探讨干细胞生长因子(SCF)反义寡核苷酸对肝癌HepG2细胞中原癌基因蛋白质c-kit、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响及意义.方法 以脂质体作为转染载体,转染SCF反义寡核苷酸于HepG2细胞.实验分三组:(1)空白对照组;(2)转染SCF反义寡核苷酸组;(3)转染SCF错义寡核苷酸组.Western blot方法检测转染前后肝癌细胞中SCF、bFGF蛋白的表达,RT-PCR检测转染前后肝癌细胞中c-kit与bFGF mRNA的表达,用流式细胞仪检测转染SCF反义寡核苷酸后HepG2细胞凋亡率.结果 与转染错义寡核苷酸组相比,SCF反义寡核苷酸对HepG2细胞中c-kit、bFGF的表达有明显抑制作用,转染SCF反义寡核苷酸可明显增加HepG2细胞凋亡率(P<0.01).结论 SCF在肝癌细胞凋亡中有重要调节作用,SCF/c-kit有可能作为PI3K/Akt信号通路的上游对肝癌细胞bFGF的表达起重要调控作用.
关键词： 肝肿瘤 干细胞因子 寡核苷酸类 反义 原癌基因蛋白质C-kit 成纤维细胞生长因子2 转染 -
超声对腺病毒载体在大鼠心肌内转染的影响
目的 观察超声对腺病毒载体在大鼠心肌内转染的影响.方法 取成年雄性SD大鼠40只,随机分为5组:心肌转染3 d组、5 d组、7 d组、20 d组和30 d组,腺病毒载体转染后分别在不同时间点观察心肌转染面积.另取成年雄性SD大鼠40只,随机分为超声干预组和对照组,转染5d后取材,冰冻病理切片下测定心肌组织转染面积百分比,分离心肌细胞,测定细胞转染率.结果 在心肌转染术后第5天,心肌组织转染面积大,以后呈现逐渐下降趋势.超声干预组心肌组织转染面积百分比显著高于对照组[(9.58±2.95)%vs.(5.13±0.90)%,P<0.05],超声干预组分离心肌细胞转染率也显著高于对照组[(9.00±2.96)%vs.(5.20±1.95)%,P<0.05].结论 超声波可以提高腺病毒载体在大鼠心肌内的转染效率.
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RhoA基因转染对QZG肝细胞生物学行为的影响及其机制的研究
目的 探讨RhoA基因转染QZG肝细胞系后细胞骨架和体外侵袭能力的变化.方法 构建持续激活型的RhoA真核表达载体,以脂质体介导转染肝细胞系QZG,用RT-PCR检测RhoA mRNA表达水平,观察细胞骨架的变化和体外侵袭能力.结果 RT-PCR表明稳定转染细胞株中有RhoA mRNA高表达,而且在荧光显微镜下可见到细胞株绿色荧光,细胞形态和骨架发生变化.Boyden 小室体外侵袭试验中实验组比空白对照组侵袭能力增加41.4%(P= 0.006).结论 RhoA影响细胞的骨架变化和侵袭能力,在肝癌发生和发展中发挥重要作用.
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腺病毒介导p27基因转染对HeLa细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察p27基因对人宫颈癌细胞HeLa增殖及凋亡的影响.方法 将已构建成功的腺病毒载体Ad-p27转染至宫颈癌细胞系HeLa细胞,Western blotting法检测病毒转染后p27蛋白在不同时间点表达;噻唑兰(MTT)法检测其对肿瘤细胞增殖的影响;流式细胞术检测其对肿瘤细胞凋亡的影响.结果 HeLa细胞成功转染进Ad-p27;在各观察的时间点内,与对照组比较,同一时间点的细胞中p27蛋白水平均显著增加(P<0.01),细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞凋亡率则显著增加(P<0.01).结论 p27基因抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,腺病毒构建p27基因有望成为宫颈癌治疗的一个新方法.
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增强绿色荧光蛋白标记腺病毒、腺相关病毒体内转染新西兰兔软骨细胞效果比较
目的 通过绿色荧光蛋白标记,比较腺病毒、腺相关病毒对新西兰兔膝关节软骨的转染效果.方法 制作含增强绿色荧光蛋白(eGFP)基因的5型腺病毒重组体(rAd5)和2型腺相关病毒重组体(rAAV2).分别在正常新西兰兔和骨关节炎动物模型的新西兰兔膝关节腔内注射rAd5和rAAV2,分别在转染后1、3、5周处死,肉眼观察关节腔内软骨及关节滑液改变,抽取关节液测量关节液中自细胞数目,计算关节软骨中软骨细胞的转染率和转染强度,抽取动物静脉血,培养293细胞,流式细胞仪检测eGFP表达情况.结果 rAAV2转染组1周后非骨关节炎模型转染率为(6.3±1.7)%,转染强度为1.6±0.6,骨关节炎模型转染率为(19.8±2.1)%,转染强度为5.2±1.3.3周后非骨关节炎模型转染率为(7.9±0.8)%,转染强度为1.9±0.4,骨关节炎模型转染率为(18.1±1.5)%,转染强度为4.2±1.1.5周后非骨关节炎模型转染率为(5.4±0.7)%,转染强度为1.5±0.4,骨关节炎模型转染率为(14.0±2.2)%,转染强度为3.6±1.2.tad5转染组3 d后非骨关节炎模型转染率为(3.6±1.5)%,转染强度为1.6±1.0,骨关节炎模型转染率为(17.2±2.3)%,转染强度为9.3±1.8.1周后非骨关节炎模型转染率为(1.2±0.4)%,转染强度为0.3±0.1,骨关节炎模型转染率为(7.5±2.3)%,转染强度为1.8±0.5.3周后非骨关节炎模型转染率为(0.5±0.3)%,转染强度为0.2±0.1,骨关节炎模型转染率为(1.0±0.5)%,转染强度为O.2±0.1.在转染高峰期,无论是非骨关节炎模型,还是骨关节炎动物模型,rAAV2转染的转染强度和转染率均要显著优于rAd5转染(P<0.01).rAd5转染后关节腔内白细胞数目较rAAV2转染明显增高(P<0.01).在各组血液中均未见病毒重组体表达.结论 两种病毒重组体应用体内转染方法均可在关节腔内得到良好的转染效果,但rAd5组早期高度表达,效果维持差,对关节腔内毒性作用较大,而rAAV2组转染效果比较温和,维持效果较好,毒性作用小,rAAV2对体内转染关节软骨细胞是一种良好的载体.
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阳离子脂质体微泡与声诺维对大鼠颈动脉造影和 SR-BⅠ基因转染的对比研究
目的制备一种能高效载基因的阳离子脂质体微泡对比剂，与商用超声对比剂声诺维（ SonoVue ）对比分析其在大鼠体内显影效果和携基因转染效率等，旨在提供一种可延长体内循环时间的基因载体。方法采用冻干法制备阳离子脂质体微泡，观察其外观、形态、平均粒径、pH、电位等。与SonoVue对比观察大鼠颈动脉显影效果。将40只SD大鼠随机分成5组，即（1）空白对照组；（2）单纯质粒组；（3）质粒＋超声＋声诺维组；（4）质粒＋阳离子脂质体微泡组；（5）质粒＋超声＋阳离子脂质体微泡组。超声参数设定为：频率1 MHz；占空比50％；强度2.0 W/cm2；时间15 min。于实验干预后2 d处死各组大鼠，取其颈动脉组织。 Western Blot检测大鼠颈动脉SR-BⅠ蛋白的表达。结果阳离子脂质体微泡的粒径范围为0.532～5.16μm，平均粒径1.17μm，pH为7.34，电位（8.10±0.8）mV。造影结果显示阳离子脂质体微泡对大鼠颈动脉显影时间较SonoVue明显延长。 Western Blot结果显示质粒＋超声＋阳离子脂质体微泡组的SR-BⅠ蛋白表达明显高于其他各组（ P＜0.05）。结论阳离子脂质体微泡制备方法简便，与SonoVue相比，体内显影时间明显延长，弥补了对比剂体内显影时间不足的缺陷，可望成为体内长时间实时动态检测的基因载体。超声联合阳离子脂质体微泡能够介导SR-BⅠ基因在颈动脉内高效表达，为动脉粥样硬化的基因治疗提供一种新的基因转染途径。
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转染Cx43人脐血源基质细胞对SUP-B15细胞增殖的影响
目的：探讨转染Cx43(Connexin 43)人脐血源基质细胞（hUCBDCs）对人急性淋巴细胞白血病细胞SUP-B15增殖的影响。方法重组腺病毒转染以上调人脐血源基质细胞Cx43表达，建立人脐血源基质细胞和SUP-B15细胞共培养模型，选取共培养72 h为时间点收集悬浮SUP-B15细胞，采用CCK-8检测SUP-B15细胞的增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。结果人脐血源基质细胞抑制SUP-B15细胞增殖，转染 Cx43后人脐血源基质细胞的抑制作用更明显，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；转染Cx43人脐血源基质细胞对SUP-B15细胞凋亡率为（5.51±0.51）%；明显高于未转染组[（2.26±1.41）%]和阴性对照组[（2.97±1.58）%]（P＜0.05）。结论转染Cx43人脐血源基质细胞具有抑制SUP-B15细胞增殖、诱导凋亡的作用。
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稳定高表达microRNA-218膀胱癌T24细胞系建立
目的：建立稳定高表达microRNA-218膀胱癌T24细胞系。方法构建pHBLV-U6-ZsGreen-Puro质粒，制备慢转录病毒载体pHBLV-U6-ZsGreen-Puro-miR-218和pHBLV-U6-ZsGreen-Puro-vector转染膀胱癌T24细胞系，用嘌呤霉素筛选并荧光显微镜和qRT-PCR检测。结果转染的细胞在荧光显微镜下呈现出绿色荧光，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）显示实验组细胞microRNA-218表达水平比对照组升高250倍。结论该实验成功建立了稳定高表达MicroRNA-218膀胱癌T24细胞系，为进一步研究microRNA-218在膀胱癌中的功能奠定了基础。
关键词： 膀胱肿瘤 细胞系 转染 microRNA-218 -
硒蛋白S过表达载体的构建及其在肝癌细胞SMMC7721中的表达鉴定
目的：构建硒蛋白S基因（SELS）真核表达载体pCMV-SELS，转染肝癌SMMC7721细胞，实现 SELS 在 SMMC7721中的成功过表达。方法通过基因克隆技术将 SELS 基因的完整ORF插入真核表达载体pCMV-3tag-3a（+），得到阳性真核表达质粒pCMV-SELS，将其瞬时转染到肝癌SMMC7721细胞中，利用RT-PCR与Western blot方法验证SELS的过表达水平。结果成功构建了真核表达质粒pCMV-SELS，将其瞬时转染SMMC7721细胞后24 h，收集细胞进行RT-PCR和Western blot检测，结果显示：与阴性对照组pCMV-3tag-3a（+）转染组相比，实验组pCMV-SELS细胞中SELS的mRNA和蛋白表达水平均有显著升高，两组比较具有统计学差异（P＜0.05）。结论成功构建真核表达载体pCMV-SELS，并实现了SELS基因在SMMC7721细胞中的过表达。
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慢病毒载体介导 GFP 基因转染犬脂肪干细胞的实验研究
目的研究慢病毒载体介导绿色荧光蛋白（GFP）转染犬脂肪干细胞（ADSCs）的理想条件，检测转染后细胞的生物学特性及分化能力。方法酶消化法获取ADSCs ，流式细胞技术检测细胞表面抗原，慢病毒载体介导GFP以50、100、150和200的感染复数（ MOI）作用24 h转染ADSCs，荧光显微镜及流式细胞检测荧光强度和转染效率，CCK-8法检测转染对ADSCs生长和增殖的影响，将转染ADSCs经成肌诱导后，免疫荧光检测成肌细胞特异性抗原结蛋白（desmin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达情况。结果流式细胞仪检测结果CD90、CD44、CD105表达均为阳性，CD34、CD45表达均为阴性，MOI为50、100、150和200，转染效率分别为75.88％、90.99％、97.42％和99.17％。 MOI为150时，转染对ADSCs增殖无明显影响。病毒转染ADSCs经成肌诱导分化后，表达desmin和α-SMA阳性。结论慢病毒载体介导的GFP能高效标记ADSCs，且标记后细胞的增殖分化能力无明显影响。
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腺病毒介导的 β2-AR过表达对心力衰竭大鼠心肌细胞IL-18分泌的影响
目的 研究β2-AR过表达对心力衰竭大鼠心肌细胞IL-18分泌的影响.方法 采用腹主动脉缩窄法建立慢性心力衰竭大鼠模型,胶原酶消化法分离大鼠心肌细胞,用携带β2-AR基因的重组腺病毒转染大鼠心肌细胞,培养48h后,Western blot法检测心肌细胞β2-AR蛋白的表达及ELISA法测定IL-18的含量.经筛选后心力衰竭大鼠随机分为心力衰竭对照组(HF组)、转染EGFP组(HF+EGFP组)、转染β2-AR-EGFP组(HF+β2组);假手术组也相应随机分为对照组(sham组)、转染EGFP组(sham+EGFP 组)、转染 β2-AR-EGFP组(sham+β2组).结果 与假手术组相比,心力衰竭组左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)均升高(P＜0.05),左心室短轴缩短率(FS)及射血分数(EF)均降低(P＜0.05).Western blot结果显示HF+β2组心肌细胞β2-AR蛋白表达量高于HF+EGFP组及HF组(P＜0.05).与sham组相比,HF组IL-18含量显著升高(P＜0.05); HF+β2组IL-18含量明显低于HF+EGFP组及HF组(P均＜0.05).结论 心力衰竭大鼠心肌细胞分泌炎症因子IL-18增加,β2-AR过表达后能抑制心肌细胞IL-18的分泌.
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应用细菌人工染色体技术体外繁殖人巨细胞病毒
目的体外快速繁殖人巨细胞病毒（ HCMV）。方法用试剂盒抽提、纯化重组HCMV细菌人工染色体（BAC），以重组HCMV细菌人工染色体（BAC-HCMV）为模板扩增UL82基因，酶切后连接至pcDNA载体，构建pcDNA-pp71重组质粒，转化感受态宿主菌，抽提及鉴定重组质粒。通过电穿孔技术将BAC-HCMV与鉴定成功的pcDNA-pp71重组质粒共转染人包皮成纤维细胞，通过多重PCR法及观察细胞病变效应、绿色荧光蛋白等方法鉴定培养后获得的HCMV。结果（1）获得pcDNA-pp71重组质粒，经PCR及双酶切后，片段大小与预期相符，进一步测序鉴定成功。（2） BAC-HCMV与pcDNA-pp71共转染人包皮成纤维细胞，出现细胞病变效应，经荧光显微镜观察可见绿色荧光。（3）以培养出的病毒DNA为模板进行多重PCR扩增，获得两条与预期大小相符的条带，鉴定HCMV体外繁殖成功。结论应用BAC技术成功在体外快速繁殖HC-MV，为HCMV研究提供实验材料，也为进一步研究HCMV分子机制奠定基础。
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超声辐照联合微泡转染短发卡状重组质粒诱导裸鼠宫颈癌移植瘤凋亡的研究
目的 探讨超声辐照联合微泡对靶向存活素的短发卡状重组质粒(survivin-shRNA)的转染增效作用及其安全性,分析其凋亡诱导效应和增殖抑制作用.方法 将荷人宫颈癌(Hela)裸鼠18只随机分为3组,每组6只.1组:质粒+超声辐照组,注入质粒溶液后予以超声辐照;2组:质粒+微泡+超声辐照组,注入质粒及微泡复合物后辐照;对照组:不予任何处理.对组织样本行冰冻切片、组织学检查、转染率检测.采用免疫组化SABC法检测移植瘤增殖细胞核抗原(PCNA)及survivin蛋白在各组肿瘤标本中的表达,测定凋亡指数(AI)和增殖指数(PI).结果 2组的移植瘤内荧光表达率显著高于对照组、1组(P<0.01);裸鼠其他器官组织中未观察到基因表达,且未观察到明显的组织损伤;PCNA及survivin蛋白表达下降,AI明显升高,PI明显减少,与对照组及1组比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 超声辐照联合微泡能显著增强基因转染效率,无明显副作用,联合Survivin-shRNAce明显诱导裸鼠体内肿瘤凋亡,抑制细胞增殖.
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声诺维联合超声介导视网膜色素上皮细胞基因转染的辐照条件优化研究
目的 探讨微泡造影剂声诺维联合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染人视网膜色素上皮(RPE)细胞的佳辐照条件.方法 人RPE细胞培养在24孔板,质粒用量为2 μg/孔,分为不处理组、质粒+超声辐照组、造影剂浓度组、超声声强组、辐照时间组、声波形式组6组,每组5个细胞孔数,超声探头紧贴培养板底部辐照,72 h后流式细胞仪测基因转染率,四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测细胞活性.结果 处理组转染率均大于不处理组(P＜0.05).加入浓度为20%的造影剂,以1 W/cm2,50 Hz、100 Hz的脉冲波和连续波分别辐照1 min,细胞生存率逐渐下降.20%的造影剂,50 Hz的脉冲波,声强为3 W/cm2,辐照1 min组转染率高(20.88±3.74)%,而细胞生存率为82.57%.20%的造影剂,50 Hz的脉冲波,声强为2 W/cm2,辐照1 min组转染率为(15.73±2.52)%,细胞生存率为91.32%.结论 20%的造影剂,2 W/cm2,50 Hz脉冲波辐照1 min是RPE细胞基因传染的佳辐照条件.
