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检测甲型流感病毒的绿色荧光蛋白报告系统的构建与鉴定
目的 构建pDZ-EGFP的真核表达重组质粒,转染MDCK细胞,建立增强型绿色荧光蛋白稳定转染的报告细胞系,提供更为直观、快速的检测甲型流感病毒的新途径.方法 将PCR扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入到pDZ载体中,将获得的pDZ-EGFP重组质粒用lipo-fectamine 2000转染MDCK细胞,通过G418进行选择培养,建立稳定转染的细胞系.传至3代,提取细胞总DNA,用EGFP的特异性引物进行PCR扩增及测序,鉴定细胞报告系统的稳定性；接种标准甲型流感毒株,用荧光显微镜和蛋白免疫印迹法检测EGFP的表达情况验证其应用性；另外,接种临床样本100份,用EGFP细胞报告系统检测的结果与Real-time RT-PCR检测结果进行比较,鉴定细胞报告系统的特异度和灵敏度.结果 稳定细胞系经传至3代,特异性EGFP引物利用PCR扩增到816bp的目的条带,测序结果与扩增的EGFP基因序列100％符合；稳定细胞系接种标准甲型流感毒株,24h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的增强表达,72h后用细胞裂解产物与EGFP的特异性抗体反应,获得目的条带；EGFP细胞报告系统检测的100份临床样本与Real-time RT-PCR检测结果相比,其特异度和灵敏度分别为88.52％和89.74％.结论 成功构建了pDZ-EGFP真核表达载体及稳定转染的MDCK细胞系,为甲型流感病毒的细胞培养鉴定及后期的致病机制的研究奠定了基础.
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NSPc1是维持HeLa细胞正常增殖的必要因子
目的 研究多梳蛋白家族成员NSPc1对HeLa细胞增殖的影响.方法 运用生物信息学设计并合成敲低NSPc1表达的siRNA序列,用半定量RT-PCR、Real-time PCR及Western blot等检测siRNA序列在HeLa细胞中敲低NSPc1的有效性;将相应有效序列构建到pSUPER载体中,观察其瞬时转染对HeLa细胞BrdU掺入的影响;用G418筛选并建立稳定敲低NSPc1的HeLa细胞系,观察敲低NSPc1对HeLa细胞体外增殖能力的影响.结果 (1)设计的siRNA序列可显著敲低NSPc1的表达;(2)瞬时敲低NSPc1阻碍了HeLa细胞BrdU的掺入;(3)成功构建稳定敲低NSPc1的HeLa细胞系,其增殖速度较对照组明显变慢.结论 NSPcl的正常表达是维持HeLa细胞正常增殖能力所必需的,稳定敲低NSPcl的HeLa细胞群可作为进一步研究NSPc1相关信号通路的有效模型.
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通过真核细胞表达系统获得重组人釉原蛋白
目的 构建重组人釉原蛋白基因的真核表达系统,并建立稳定表达该蛋白的细胞系.方法 取 26 周龄引产胎儿的牙胚组织,提取总 RNA,用 RT-PCR 技术扩增釉原蛋白基因片段,插入中间表达载体 pGEM*9誖-T.经双酶切后,再与真核表达载体 pcDNA3.1TM/myc-His(-)B 相连接,构成终的表达质粒,将该重组表达质粒转染至 HEK 293A 细胞,用 G418 筛选出阳性细胞克隆,并建立稳定表达釉原蛋白的细胞系.结果 通过测序表明,人釉原蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上.将该表达系统转染 HEK 293A 细胞后,进行 Western Blot 检测,证明有相对分子质量约 32 000 的釉原蛋白表达.结论 本实验成功构建了重组人釉原蛋白真核表达系统,建立了稳定细胞系,为获得高纯度的釉蛋白,进一步研究蛋白质功能奠定了基础.
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c-Abl/Arg靶向RNA干扰对细胞周期的影响
目的:探讨非受体酪氨酸激酶c-Abl/Arg对细胞周期的影响.方法:用si-STRIKE-c-Abl/Arg siRNA表达载体转染乳腺癌细胞MCF-7,筛选具有潮霉素(hygromycin)抗性的c-Abl/Arg双敲低的稳定细胞系(c-Abl/Arg-DKD),用流式细胞仪检测其细胞周期.结果:筛选获得的c-Abl/Arg-DKD稳定细胞系中c-Abl/Arg的表达被有效抑制,且在S/G2期产生显著的细胞周期阻滞效应. 结论:c-Abl非受体酪氨酸激酶在S/G2周期转换过程中发挥调节作用.
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含临床病毒株聚合酶逆转录酶区的乙肝病毒DNA稳定复制细胞系的构建
目的 构建含有临床病毒株聚合酶逆转录酶(RT)区的乙肝病毒(HBV) DNA稳定复制细胞系.方法 采用巢式PCR从患者血清扩增HBV DNA片段,利用片段置换反应将该片段克隆到HBV DNA复制载体,并在该载体上引入新霉素抗性基因,在确认该重组DNA体外可复制后,将其转染HepG2细胞,G418筛选,采用real-time PCR结合ELISA及Southern blot检测初筛和鉴定HBV DNA稳定复制细胞系.结果 从患者血清扩增出的HBV DNA片段nt55～1654被成功置换到HBV复制质粒pLL相应区域,得到质粒p11;新霉素抗性基因表达片段被克隆到p11中HBV DNA下游,获得质粒p11-neo,Southern blot检测证实p11-neo可支持体外复制；p11-neo转染HepG2后,经筛选鉴定,获得了可支持HBV DNA稳定复制的细胞系3-10.结论 建立了含有临床病毒株聚合酶RT区的HBV DNA稳定复制细胞系,real-time PCR结合ELISA有助于HBV DNA稳定复制细胞系的快速初筛鉴定.
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稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系的构建
目的 构建稳定表达GFP-LC3的人急性单核细胞白血病细胞(THP-1).方法 采用pCDH-CMV-GFP-LC3-EF1α-puro转染293T细胞构建慢病毒质粒系统,获取的慢病毒感染THP-1细胞,用嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定表达GFP-LC3蛋白的细胞系.通过Western blot和流式细胞术检测THP-1细胞中GFP-LC3蛋白的表达,并利用该稳定表达细胞系观察饥饿和雷帕霉素诱导时细胞发生的自噬变化.结果 筛选得到稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光.Western blot和流式细胞术检测证实了GFP-LC3融合蛋白的表达.激光共聚焦法和Western blot均证实饥饿和雷帕霉素可以诱导自噬的发生,且GFP-LC3融合蛋白可以反映内源LC3蛋白的变化,包括蛋白聚集和发生剪切修饰.结论 应用慢病毒质粒系统成功构建了高效稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系,从而为后续利用GFP-LC3融合蛋白研究自噬变化提供了细胞模型.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A稳定细胞系的建立及其对乙型肝炎病毒复制的影响
HBV和HCV的急、慢性感染是造成肝细胞坏死、炎性反应,以及原发性肝细胞癌(HCC)的重要原因.由于HBV和HCV有共同的感染途径,故HBV和HCV共感染的情况屡见不鲜.
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高表达p55PIK细胞株的建立及其对结肠癌LoVo细胞周期的影响
目的 构建p55PIK高表达的质粒,筛选稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系,检测其对LoVo细胞周期的影响.方法 以基因组cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,通过限制性核酸内切酶进行酶切,T4 DNA连接酶将目的片段插入pcDNA3.1质粒中;将携带p55PIK基因的pcDNA3.1质粒转染LoVo细胞,加入适量的G418筛选(500μg/mL),并通过实时定量PCR(qPCR)和Western blot方法检测p55PIK mRNA水平和蛋白水平,进一步通过BrdU/PI掺入法检测p55PIK对LoVo细胞周期和DNA合成的影响.结果 成功构建了p55PIK高表达的质粒,并筛选出稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系;在LoVo细胞中高表达p55PIK能够促进细胞S期的进程和DNA的合成.结论 成功构建了pcDNA3.1-p55PIK质粒,并筛选出p55PIK稳定高表达的LoVo细胞系,高表达p55PIK能够促进LoVo细胞S期的进程和DNA的合成.
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miR-143在鼻咽癌细胞系中的表达及其对高转移细胞株5-8F的影响
目的 检测鼻咽癌细胞系中miR-143表达情况,建立稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,为研究其在鼻咽癌的发生和发展中的作用机制提供可靠的细胞模型.方法 采用QPCR方法检测鼻咽癌细胞系CEN1、CNE2、HONE1、5-8F、6-10B及人永生化鼻咽上皮细胞NP69中miR-143的表达水平.构建重组逆转录病毒质粒pMSCV-puro-miR-143,包装逆转录病毒pMSCV-miR-143和pMSCV-Vector并感染鼻咽癌细胞,建立稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,并应用细胞黏附实验检测过表达mir-143后,鼻咽癌细胞对胞外基质的黏附性.结果 鼻咽癌细胞系中miR-143的表达水平均低于对照组NP69细胞,其中高转移潜能细胞株5-8F的表达量低,仅为对照组的3.03％,成瘤但不转移细胞株6-10B表达量高,为对照组的63.59％.实时荧光定量PCR显示筛选后第7代细胞miR-143的表达水平比对照组高出达1080倍(P＜0.05).细胞黏附实验结果显示,过表达mir-143可降低5-8F细胞对胞外基质的黏附性.结论 miR-143在鼻咽癌细胞系中表达失常,其作用可能与鼻咽癌细胞的侵袭和转移相关；成功建立了稳定高表达miR-143的鼻咽癌细胞系,并初步确定miR-143能抑制5-8F细胞的黏附能力,为探索miR-143在鼻咽癌的发生和发展中的作用机制奠定了实验基础.
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着丝粒蛋白-H对人胃癌细胞增殖的影响
目的 检测着丝粒蛋白-H(CENP-H)基因在人胃癌细胞系中的表达情况,研究CENP-H对胃癌细胞增殖的影响.方法 采用QPCR、Western blot检测7株胃癌细胞系及永生化人胃粘膜上皮细胞中CENP-H的mRNA和蛋白表达水平.用重组逆转录病毒感染胃癌细胞,建立稳定干扰内源性及高表达外源性CENP-H的胃癌细胞系,并利用Western blot及QPCR检测进行鉴定,后采用MTT、平板克隆形成实验分析CENP-H对胃癌细胞增殖能力的影响.结果 人胃癌细胞系中CENP-H蛋白及mRNA表达水平均高于永生化人胃粘膜上皮细胞.Western blot及QPCR鉴定结果表明成功建立稳定沉默内源性及高表达外源性CENP-H的胃癌细胞系.MTT、平板克隆形成实验显示干扰CENP-H后对胃癌细胞增殖能力起到抑制作用,过表达CENP-H后能促进胃癌细胞增殖.结论 CENP-H对胃癌细胞的增殖具有重要的作用,在胃癌的发生发展中可能扮演重要角色.
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可诱导稳定表达DLX4细胞系的构建及其表达分析
目的:建立一种可诱导稳定表达方法,并构建DLX4细胞系.分析DLX4细胞系的表达调控.方法:将DLX4全长基因克隆入pcDNA5/FRT/TO表达载体,将其转染入宿主细胞Flp-InTMT-RExTM-293细胞系,潮霉素B筛选或者阳性克隆.采用不同剂量的DOX或者不同作用时间对pcDNA5/DLX4细胞系进行诱导表达,用Western blotting检测DLX4表达情况.结果:构建了可被Doxycline (DOX)诱导的稳定表达pcDNA5/DLX4的细胞系.0.001μg/ml的DOX即可诱导pcDNA5/DLX4细胞系的表达,0.1 μg/ml DOX即可诱导该细胞系表达达到高峰；DOX对该细胞系作用1h后即可诱导该细胞系表达,对其作用16h后该细胞系表达明显增强.结论:构建了可被DOX诱导稳定表达的DLX4细胞系,不同剂量的DOX和不同作用时间对DLX4细胞系表达有不同的影响.该细胞系的建立为深入探索DLX4的功能提供了一种新的有效方法和实验材料.
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稳定表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞株的建立及其免疫原性分析
目的:建立表皮生长因子突变体Ⅲ胞外区(EGFRvⅢex)的NIH3T3稳定细胞系并分析其免疫原性.方法:将编码EGFRvⅢex基因的表达质粒pLNCX2-EGFRvⅢex转染NIH3T3细胞后, 用G418筛选阳性克隆, 得到多个细胞克隆.采用免疫组化和Western blot法鉴定这些细胞克隆.选取高表达EGFRvⅢex的细胞株(命名为3T3-vⅢex)免疫BALB/c小鼠, 制备抗血清.用ELISA、Western blot和免疫荧光分别检测抗血清的效价和特异性.结果:成功地构建了真核表达载体pLNCX2-EGFRvⅢex并获得了稳定高表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞系3T3-vⅢex.用3T3-vⅢex免疫小鼠所获得的抗血清效价为10 -5.Western blot和免疫荧光鉴定证明抗血清可以与EGFRvⅢex特异结合.结论:人EGFRvⅢex可在NIH3T3细胞内获得稳定表达, 以其免疫小鼠可以获得高效价、高特异性的抗血清.
关键词： NIH3T3 表皮生长因子受体突变体Ⅲ 稳定细胞系 免疫原性 抗体 -
黑色素瘤抗原MAGE-A9基因在真核细胞中的表达研究
目的:克隆MAGE-A9基因并对其进行真核表达及鉴定.方法:通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从原发性肝癌的细胞中扩增MACE-A9基因片段,将该片段克隆在真核表达载体pEGFP-C3中,转染NIH3T3细胞,经G418筛选,构建稳定表达细胞系,并用荧光显微镜和Western blot对其进行鉴定.结果:经RT-PCR扩增出945 bp基因片段,经测序分析并与GenBank的DNA序列比对分析后,在NIH3T3细胞中表达.G418筛选后,细胞荧光信号较强,Western blot检测,细胞中的融合蛋白能够与抗MACE-A9的多抗结合.结论:成功地扩增了肝细胞肝癌中的MAGE-A9基因全长cDNA并进行真核表达与鉴定.
