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人巨细胞病毒对药疹病情发生发展的影响
目的 探究人巨细胞病毒对药疹病情发生发展的影响.方法 选取2012年9月-2014年6月在我院就诊的50例药疹患者作为观察组,同期选取50例体检健康者作为对照组,采用Taqman实时荧光定量PCR检测外周血单一核细胞中巨细胞病毒(CMV) DNA阳性率及载量,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中CMV IgM阳性率,对结果进行对比分析.结果 观察组中出现32例CMV DNA阳性患者,阳性率为64％.对照组中出现13例CMV DNA阳性患者,阳性率为26％,两者相比.观察组阳性率显著高于对照组,其差异具有统计学意义(P＜0.05);观察组中CMV DNA载量为28188.824±19525.632拷贝,对照组中CMV DNA载量为3018.9532±1 761.958拷贝,观察组显与对照组比较差异显著,具有统计学意义(P＜0.05);观察组中出现11例CMV IgM阳性患者,阳性率为22％,对照组中出现5例阳性患者,阳性率为10％,两者相比.观察组CMV IgM阳性率显著高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 药疹患者中存在CMV感染,其在药疹的发生和发展过程中可能起到一定的促进作用,是药疹发病的因素之一.
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感染性腹泻患者弯曲菌感染的实验室检测及监测
目的 了解我国腹泻患者弯曲菌的感染现状.方法 采用体外分离培养以及特异核苷酸检测法对某医院腹泻患者粪便标本进行持续8个月的弯曲菌感染的监测.2013年4-11月持续收集北京某医院感染性腹泻门诊患者粪便标本278份,分别采用直接划线培养、增菌培养以及实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)的方法检测感染性腹泻患者弯曲菌的感染现状.结果 278份感染性腹泻患者粪便标本使用分离培养和特异核苷酸检测共有16份标本为空肠弯曲菌阳性.其中直接划线培养分离到6株空肠弯曲菌,阳性率为2.2％ (6/278),增菌培养分离到2株空肠弯曲菌,阳性率为0.7％(2/278);特异核苷酸检测获得14份阳性标本,阳性率为5.0％(14/278).分离培养、real-time PCR方法检测感染性腹泻患者粪便标本中弯曲菌的阳性率差异有统计学意义(x2=36.425,P=0.039).结论 本次检测结果表明感染性腹泻患者中弯曲菌的检出率显著低于国内新报道7.1％.与直接分离培养相比,增菌培养法检测粪便中弯曲菌的灵敏度显著降低.real-time PCR法能够快速检测腹泻患者弯曲菌的感染情况,其灵敏度(14/16,87.5％)高于分离培养(6/16,37.5％).
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TaqMan实时荧光定量PCR检测艰难梭菌
目的 建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于艰难梭菌的快速检测;评价基于纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌的2种标准曲线;并应用该荧光定量PCR法对急性艰难梭菌感染(CDI)的小鼠进行粪便含菌量检测评价.方法 针对艰难梭菌基因组中16S rRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套快速检测艰难梭菌含量的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、灵敏性;绘制艰难梭菌纯菌浓度梯度稀释标准曲线和粪便中同浓度梯度艰难梭菌的标准曲线,比较两者的差异;用艰难梭菌高毒株NAP1/027感染用抗生素处理的C57BL/6小鼠,建立CDI小鼠模型,同时应用该荧光定量PCR和活菌培养法定量检测小鼠粪便中的艰难梭菌含量变化.结果 建立的TaqMan实时荧光定量PCR具有较高的灵敏性和特异性,生成标准曲线的相关系数为0.999 8,斜率为-3.400 4;用纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌分别制备标准曲线,结果表明2种标准曲线定量检测结果差异无统计学意义.建立CDI小鼠模型,应用该荧光PCR能有效、准确的检测出粪便中艰难梭菌的含量,可替代费时费力的活菌培养计数法.结论 用纯培养艰难梭菌来制备标准曲线不影响对含菌粪便标本的准确定量检测,荧光定量PCR能准确快捷地检测CDI小鼠粪便中的艰难梭菌含量,比活菌计数更快速和方便,可用于艰难梭菌感染小鼠模型中小鼠肠道内艰难梭菌定植的定量检测.
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TaqMan探针实时荧光定量PCR检测聚集性细菌性腹泻病原的初步应用
目的 应用TaqMan探针实时荧光定量PCR,对聚集性细菌性腹泻便标本提取的DNA,进行多项病原初筛检测,结合常规培养以提高工作效率.方法 应用TaqMan探针实时荧光定量PCR对3起聚集性细菌性腹泻便标本提取的DNA进行多项病原检测,初筛阳性者再进行相应阳性病原的常规培养.结果 第1起疫情22件便标本,6件沙门菌核酸阳性中有5件检出鼠伤寒沙门菌;第2起疫情16件便标本,4件肠致泻性大肠杆菌核酸阳性中有1件检出肠致病性大肠杆菌0142∶K86(B)和产耐热肠毒素的肠产毒性大肠杆菌;第3起疫情2件便标本,2件产气荚膜梭状芽胞杆菌核酸阳性中有1件检出产气荚膜梭状芽胞杆菌.TaqMan探针实时荧光定量PCR阳性检出率为30.0％ (12/40),常规培养法阳性检出率为17.5.0％ (7/40).结论 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测聚集性细菌性腹泻病原,阳性检出率高于常规培养法,有初筛作用,为腹泻疫情的处置提供可靠的病原学检测数据.
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实时荧光定量PCR检测妊娠晚期孕妇B族链球菌感染的临床价值
目的 评价实时荧光定量PCR技术检测妊娠晚期孕妇B族链球菌(GBS)感染的临床效能,探讨 GBS感染与不良妊娠结局的关系. 方法 对 3565 例妊娠 35～37 周孕妇的阴道分泌物和直肠分泌物,采用实时荧光定量 PCR法和细菌培养法进行 GBS检测;根据 GBS携带者意愿将其分为干预治疗组和未干预治疗组,干预治疗组进行预防性应用抗菌素,未干预治疗组不作处理;观察各组产妇的妊娠结局. 结果 3565 例孕妇中,GBS携带率为 9.87%;实时荧光定量 PCR 法诊断GBS感染的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比和准确度分别为 98.30%、99.50%、95.58%、99.81%、196.6、0.017 和99.38%;未干预治疗组的胎膜早破、早产、宫内感染、胎儿窘迫和新生儿感染的发生率显著高于GBS阴性组和干预治疗组(P＜0.05),而干预治疗组与 GBS阴性组无统计学差异(P＞0.05);各组新生儿均出现不同程度的 GBS、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等感染,未干预治疗组发生 GBS感染数显著增高(P＜0.05),而干预治疗组与 GBS阴性组无统计学差异(P＞0.05),其余菌种感染组间均无统计学差异(P＞0.05). 结论 实时荧光定量PCR是一种快速准确筛查妊娠晚期 GBS的方法;妊娠晚期孕妇 GBS感染会导致胎膜早破、早产、宫内感染、胎儿窘迫和新生儿感染的发生率升高,及时采取干预措施可有效降低不良妊娠结局的发生.
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Spyda基因过表达转基因小鼠品系的建立
目的 建立Spyda基因过表达转基因小鼠品系用于深入研究Spyda基因的功能. 方法 利用Gateway技术构建Spyda表达载体,通过DNA显微注射的方式获得Spyda基因过表达的首建鼠.首建鼠与野生型鼠杂交,所得子代中的阳性鼠同窝交配,已传3代以后的阳性小鼠经SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测外源基因的起始模板量,通过与杂合子比较来预测小鼠的基因型,再用传统育种方式验证SYBR Green实时荧光定量PCR的结果. 结果 获得7只首建鼠,通过与野生型鼠杂交获得阳性子代,进行同窝交配,传至第3代,经实时荧光定量PCR方法筛选出4只纯合子的小鼠,经测交验证,其与正常小鼠交配所生的后代均为阳性,证明实时定量PCR的结果是正确的.建立了2个独立的Spyda转基因小鼠纯合子品系. 结论 建立了稳定遗传的纯合子Spyda基因过表达转基因小鼠品系,可作为工具鼠进一步深入研究Spyda基因的功能.
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PARP-1及其相关因子在适应性反应中的表达改变
目的探讨PARP-1在适应性反应中的作用.方法低剂量甲醛预处理人胚肺成纤维细胞(MRC-5)后,观察细胞对高剂量甲醛攻击的适应性反应.在MTT法检测细胞存活率的基础上,荧光定量PCR技术测定不同组细胞中PARP-1及其相关因子表达的变化.结果用低剂量甲醛预刺激可提高细胞对继后大剂量甲醛攻击的抵抗力;低剂量甲醛能引起PARP-1及其相关因子表达增加,产生适应性反应时这种增加尤为突出,其中PARP-1的表达量是对照组的147倍.结论低剂量的甲醛可使PARP-1活化,进而调节其相关因子DNA-PK、P53、NF-κB的表达,促使细胞免疫功能增强,启动适应性反应的产生.
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POLH基因实时荧光定量PCR检测条件的建立
研究表明,环境化学污染物可以引起各种类型的DNA损伤,而POLH基因与DNA损伤所引起的细胞内反应即DNA的跨损伤合成(translesion synthesis,TLS)有关.因此,有必要寻找出一种敏感度极高的方法来检测POLH基因在mRNA水平上的表达变化,从而为探讨POLH基因在环境化学污染物所诱导的跨损伤DNA合成中的分子作用机制提供相应的线索.
关键词： SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR POLH -
奶液模拟标本中单增李斯特菌real-time PCR检测方法的建立
目的 建立了基于TaqMan探针的real-time PCR技术针对奶液模拟标本中单增李斯特菌的快速检测方法.方法 用单增李斯特菌hlyO基因的部分片段作为靶基因,制作标准曲线,定量检测奶液中的单增李斯特菌.结果 通过对不同李斯特菌及一些较为常见的致病菌的DNA进行扩增,只有单增李斯特菌能够产生扩增曲线,其余菌株均不产生扩增曲线.单增孛斯特菌的检测灵敏度可以达到9copies/反应体系.结论 该方法特异性好,灵敏度高,整个实验可在1.5h内完成,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测和疫情暴发时的相关病原调查.
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氢醌对人L-02肝细胞泛素结合酶Rad6B表达的影响
目的 研究氢醌(HQ)对人L-02肝细胞中泛素结合酶Rad6B表达的影响.方法 将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80和160pmol/L)的HQ处理24h之后,采用实时荧光定量PCR技术检测R且d6B在mRNA水平上的表达;采用Western blot方法检测Rad6B在蛋白质水平上的表达.结果 在0～160gmol/L的范围内,HQ可诱导Rad6B在mRNA和蛋白质水平上表达的增加,具有随着剂量的增加而升高的趋势;并且各染毒剂量组(5、10、20、40、80和160μmol/L组)肝细胞Rad6B在mRNA和蛋白质水平上的表达均明显地高于对照组(Oμmol/L组)(P＜0.01);当HQ的作用浓度达到160pmol/L时,Rad6B的表达水平达到大值,其mRNA和蛋白质表达的相对定量值分别为4.35和0.85.结论 HQ可使L-02肝细胞的Rad6B表达增加.
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实时荧光定量PCR快速检测大肠埃希菌的方法研究
目的 基于TaqMan探针建立产肠毒素大肠埃希菌实时荧光定量PCR检测方法.方法 针对编码大肠埃希菌耐热肠毒素STI、不耐热性肠毒素LTI基因片段设计引物、探针,采用外标法,绘制标准曲线,进行荧光定量PCR检测.结果 引物、探针特异性良好,该方法的灵敏度可达到每反应1DNA拷贝,特异性强,检测范围在10°～107拷贝每反应,重复性及稳定性好,整个过程只需要2h.结论 该方法能快速、灵敏、特异检出产肠毒素大肠埃希菌.
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高脂饮食对幼年大鼠小肠组织FABP2mRNA表达的影响
目的 检测幼年大鼠在应答高脂饮食时,小肠组织FABP2 mRNA的表达情况,探讨FABP2的表达与幼年大鼠肥胖发生、发展的相关性.方法 建立幼年大鼠肥胖模型,采用SYBR Green Ⅰ荧光染料实时荧光定量PCR方法检测、分析幼年大鼠十二指肠、空肠和回肠组织中FABP2 mRNA的表达情况;全自动生化分析仪检测血清生化指标的变化.结果 无论是对照组还是肥胖组大鼠,FABP2 mRNA的表达水平在回肠高,空肠次之,十二指肠低,差异具有统计学意义(P＜0.05);与对照组比较,肥胖组大鼠十二指肠、空肠和回肠组织中FABP2 mRNA表达水平均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);且肥胖组大鼠血清TG和血糖水平显著升高(P＜0.05).结论 FABP2基因在小肠组织不同区段表达量不同;高脂饮食使幼年大鼠小肠组织FABP2 mRNA表达水平降低,体重增加,血清TG水平升高,提示FABP2参与了脂类代谢,与幼年肥胖的发生、发展可能具有一定的关系.
关键词： 高脂饮食 幼年大鼠 小肠型脂肪酸结合蛋白 实时荧光定量PCR 肥胖 -
高脂饲料诱导的胰岛素抵抗小鼠肝脏组织差异表达microRNAs的鉴定及生物信息学分析
目的 采用茎环-逆转录实时荧光定量PCR方法,鉴定高脂饲料诱导的胰岛素抵抗小鼠肝脏组织中差异表达的mircoRNAs(miRNAs),即miR-1897-3 p、miR-690和miR-7a-5p,并预测分析miRNAs调控的靶基因和功能,探讨胰岛素抵抗与差异表达的miRNAs的相关性.方法 30只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和高脂饲料诱导的胰岛素抵抗模型组,设计茎环引物和实时荧光定量PCR特异引物,建立茎环-逆转录SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测小鼠肝脏组织中miR-1897-3 p、miR-690和miR-7a-5p的表达.统计学分析小鼠miR-1897-3p、miR-690和miR-7a-5p表达的差异.利用生物信息学软件预测miRNAs调控的靶基因,分析靶基因富集的基因功能(gene ontology,GO)和涉及到的信号转导通路及其靶基因蛋白的相互作用.结果 经实时荧光定量PCR鉴定分析,与对照组相比,胰岛素抵抗组小鼠肝脏组织中miR-1897-3p、miR-690、miR-7a-5p表达下调(P＜0.05).生物信息学分析结果显示,有16种靶基因被两种差异表达的miRNAs调控,其中有8个靶基因可与4种以上的蛋白质相互作用,Rac1、Rhoa、Prkcz、Tgfbr2、Itch和Ube2d3蛋白位于网络的中心节点,且它们与胰岛素信号通路相关或存在交联.结论 肝脏miR-1897-3 p、miR-690和miR-7a-5p可能参与了胰岛素抵抗的病理生理过程,其机制可能通过调节靶基因的表达,影响了胰岛素信号通路的正常级联反应.
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Taq-Man实时荧光定量PCR同时检测O1和O139群霍乱弧菌
目的 针对霍乱弧菌血清群各自编码O抗原的特异性基因建立能够快速、准确地同时检测O1和O139群霍乱弧茵的荧光PCR检测方法,并克服常用PCR检测方法中经常出现的假阳性现象.方法 分别以rfbM和wbfR基因作为O1和O139群霍乱弧菌的模板设计引物和探针,通过优化反应条件建立了能够同时检测O1群和O139群霍乱弧茵的二联实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR).对该方法的特异性、灵敏度进行评估,并对10份模拟食品样品和133份临床样品进行了检测.结果 特异性试验表明,该方法能选择性检测O1和O139群霍乱弧菌,能有效地避免O141群霍乱孤茵和拟态弧茵的假阳性,特异性为100%;灵敏度试验表明,O1群霍乱弧菌和O139群霍乱孤茵检出限分别为92cfu/ml和116cfu/ml;另外,试验建立的检测方法对模拟样品和临床样品检测结果与国标法的检测结果完全一致.符合率为100%.结论 该实时荧光PCR检测方法能够同时检测O1和O139群霍乱弧茵,而且特异性好、灵敏度高,能有效克服假阳性,适用于基层疾病控制、口岸检疫单位日常疫情监测和临床诊断.
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循环miRNA-141在前列腺癌诊断中的价值分析
目的:探究循环miRNA-141在前列腺癌诊断中的价值.方法:选取2016年4月-2017年12月83例在我院接受治疗的前列腺癌患者为观察组,选取同期83例健康体检者为对照组,采用实时荧光定量PCR检测血清miRNA-141表达水平.结果:观察组miRNA-141表达水平为(18.57±3.17),对照组miRNA-141表达水平为(5.63±1.49),观察组高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);血清miRNA141表达水平与格里森得分、临床分期及是否转移有关(P<0.05),且随着临床分期的增加,miRNA别的表达水平增加.结论:循环miRNA-141可作为诊断前列腺癌的分子标志物.
关键词： 前列腺癌 血清miRNA-141 实时荧光定量PCR 价值 -
实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响及管理
目的探讨实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的准确率，对影响因素进行分析，针对影响因素提出管理措施。方法选取2011年8月至2014年10月医院收治并已确诊的395例乙型肝炎病毒感染患者为研究对象，对本组395例患者空腹状态下抽取肘静脉血，进行实时荧光定量PCR检测，以临床诊断结果为对照标准，对比实时荧光定量PCR检测乙肝DNA结果差异，并对导致两者间差异的影响因素进行分析。结果通过实时荧光定量PCR技术检测乙肝DNA确诊374例，占94.7%，漏诊误诊21例，占5.3%，两者对比差异未见显著性差异(P>0.05)。影响检测结果的因素主要包括实验室条件、标本操作（标本抗凝血操作、标本贮存与溶血和血脂影响）以及核酸提取方法等。结论实时荧光定量PCR在HBV-DNA的检测中准确率较高，具有较高应用价值，但仍有一定的漏诊和误诊率，需加强管理，在多方面进行综合预防。
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天津口岸出入境人员乙型肝炎病毒基因分型研究
[目的]探讨天津口岸出入境人员乙型肝炎病毒(HBV)的基因类型分布特征.[方法]调查天津口岸出入境人员HBV血清学指标,采用实时荧光定量PCR结合Taqman探针技术对180份乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性血清标本中的HBV DNA进行定量检测和基因分型;对非B非C型HBsAg阳性血清标本采用通用引物PCR方法结合序列分析进行基因分型.(结果] 180份HBsAg阳性血清标本中,B型23份(40.35%);C型30份(52.63%);D型4份(7.02%),其余123份血清HBV DNA浓度均低于定量检测试剂盒的下限(500IU/ml).(结论]天津口岸出入境人员中HBV基因型以C型为主,B型次之,D型极少.
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应用实时荧光定量PCR检测鼠类生境样本鼠疫耶尔森氏菌的研究
目的:评价应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测鼠类生境样本中鼠疫耶尔森氏菌的可行性和有效性.方法:优选、评价鼠类生境样本DNA提取方法,提取疫区鼠类洞穴土壤、粪便等生境样本中DNA,应用RT-PCR试剂盒检测鼠疫耶尔森氏菌特异性pla基因.结果:柱式土壤DNAout法提取DNA效果好,回收率是24.54%.联合应用柱式土壤DNAout法和RT-PCR法检测鼠类生境样本,鼠疫耶尔森氏菌pla基因的阳性率为3.44%(10/291).结论:应用柱式土壤DNAout法提取鼠类生境样本DNA,RT-PCR法可以检测到鼠类生境中鼠疫耶尔森氏菌pla基因.
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实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌重组质粒标准的构建
[目的]构建蜡样芽胞杆菌16s-23sITS重组质粒,为实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌提供质粒标准.[方法]选择蜡样芽胞杆菌16s一23sITS特异基因作为目的靶序列,设计、合成引物和探针,采用普通PCR扩增特异靶序列,克隆到pGM-T载体后,转化感受态大肠埃希菌DH5α,经蓝白斑筛选,再分别用EcoRI酶切,普通PCR及测序3种方法证实目的片段已成功重组.建立荧光定量PCR检测蜡样芽胞杆菌的标准曲线.[结果]成功构建目的重组质粒,并以此为标准制作荧光定量PCR标准曲线.重组质粒标准具有较大的线性范围(102copies/μl～108%opies/μl)和灵敏度.[结论]该方法构建的16s-23sITS基因重组质粒能满足实时荧光定量测定对参考标准的要求,为后续实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的推广应用提供了条件.
关键词： 杆菌 蜡样芽胞 TaqManTM探针 重组质粒 实时荧光定量PCR -
实时荧光定量PCR法检测MTHFR C677T基因多态性方法的建立和应用
目的:建立一种准确、快速、自动化程度较高的检测亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T基因多态性的方法,并观察中国北方健康人群中MTHFR C677T基因频率.方法:应用MGB探针的原理建立MTHFR C677T基因多态的检测方法,与传统PCR-RFLP方法作对照,共检测标本88例,并计算各基因型频率.结果:荧光定量方法可以快速完成MTHFR C677T基因多态性的检测,检测结果得到传统PCR-RFLP方法的证实.88例北京汉族正常人群MTHFR基因的各种基因型频率为25%、42%和33%.结论:该方法准确、检测效率高,适用于临床实验室及流行病学调查研究.
关键词： 亚甲基四氢叶酸还原酶 基因多态性 实时荧光定量PCR
