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卵子体外成熟对胞质线粒体DNA拷贝和功能的影响
目的 研究卵子体外成熟(IVM)过程对胞质内线粒体的数目、功能及卵子质量的影响,进而探讨IVM卵子低发育潜能的可能机制.方法 实验小鼠随机分为IVM组和体内成熟(IvO)组;应用Real-time-PCR、免疫荧光和荧光-荧光素酶测定法,分别检测IVM和IVO来源卵子的线粒体DNA(mtDNA)拷贝数、线粒体膜电位强度、ATP含量、线粒体分布、胞质ROS水平、卵子骨架和染色体结构.结果 相对于IVO卵子,IVM卵子的mtDNA拷贝数显著降低;而胞质ROS生成和纺锤体及染色体结构异常率则显著增加.胞质线粒体分布模型和氧化磷酸化活性在IVM和IVO卵子间差异无显著意义.结论 非生理性IVM过程显著抑制了胞质mtDNA的复制,并增加了ROS生成和纺锤体和染色体结构异常,继而可能影响卵子细胞质的成熟进程,这可部分解释IVM卵子低发育潜能的机制.
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荧光定量PCR检测查菲埃立克体
依据查菲埃立克体16S rRNA基因序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,以克隆的查菲埃立克体16S rRNA基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法.与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其30倍;用荧光定量PCR检测其他相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0.2%～2.0%之间.结果证明本研究建立的荧光定量PCR方法具有种特异性和良好的重复性,可用于检测感染样本中的微量查菲埃立克体DNA.
关键词： 查菲埃立克体 实时荧光定量PCR 16S rRNA基因 埃立克体感染 -
致倦库蚊卵黄羧肽酶基因与溴氰菊酯抗性关系的研究
本文通过对不同抗性株致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus卵黄羧肽酶基因(Vitellogeniccarboxypeptidase,VCP)表达量的比较,探讨VCP基因与溴氰菊酯抗药性的相关性.通过幼虫生物测定方法,分别得到致倦库蚊敏感株、野外株和抗性株,半数致死浓度分别为0.00057、0.38900和42.26250 mg/L.采用SYBR荧光定量方法,以致倦库蚊核糖体蛋白L8(ribosomal protein L8)基因作为内参,获得VCP基因在致倦库蚊敏感株、野外株和抗性株校正后(拷贝/l×109RPL8)表达量分别为5.80×10 7、4.53×107、3.07×10 7.致倦库蚊敏感株、野外株和抗性株的抗药性从低到高,而VCP基因表达量却是从高到低,推测两者之间存在着负相关关系.进一步推测VCP基因为致倦库蚊抗性相关的新基因,为研究致倦库蚊的抗药性提供了新的方向.
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荧光定量PCR检测感染登革2型病毒C6/36细胞和埃及伊蚊复制动态研究
本研究采用实时荧光定量PCR (FQ-PCR)方法,检测感染登革病毒C6/36细胞1～7d及感染埃及伊蚊1、3、5、7、9、11、13 d后,病毒在细胞和蚊虫体内增殖的动态变化.结果显示,随着时间增加,登革病毒增殖出现规律性变化.登革病毒在感染细胞1～2d后增殖不明显,3d后病毒开始大量复制达到高峰,但6d后有所下降.在蚊虫体内1～7d病毒增殖不明显,9d开始快速复制达到高峰,但11～13 d后下降至病毒载量稳定.实验表明登革病毒在细胞内复制增殖的佳时间在接种病毒3d后,在蚊虫体内9d开始快速复制达到高峰增殖,到11 ～13 d后蚊虫体内病毒增殖稳定波动.
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Poly（A）加尾实时荧光定量PCR检测血清微RNA-122的表达及其临床初步应用
目的：建立Poly（A）加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR法检测血清微RNA?122（miR?122）水平，并初步探讨其临床应用价值。方法选取2013年9月至2014年9月本院就诊的糖尿病患者和健康体检者120例为研究对象，分为糖尿病脂质代谢紊乱组（n=40）、糖尿病非脂质代谢紊乱组（n=40）和对照组（n=40）。提取血清总RNA，miR?122 Poly（A）聚合酶加尾逆转录获得cDNA，进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增。制作C.elegans?miR?39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线定量检测血清miR?122水平，进行3组血清miR?122水平的组间比较。结果该方法可定量检测血清miR?122水平，PCR扩增产物特异性好，熔解曲线呈单峰；检测灵敏度为102拷贝/μl，检测线性范围102~107拷贝/μl。高、中、低浓度样本重复性检测的批内变异系数（CV）分别为2.23%、2.48%和2.75%，其批间CV分别为5.35%、5.88%和5.72%，显示该方法具有较好的重复性和稳定性。该方法检测糖尿病脂质代谢紊乱组、糖尿病非脂质代谢紊乱组和对照组的血清miR?122水平分别为（4.85±3.68）×103拷贝/μl、（3.06±1.86）×103拷贝/μl和（1.03±0.82）×103拷贝/μl，糖尿病脂质代谢紊乱组血清miR?122水平高于糖尿病非脂质代谢紊乱组和对照组（均P<0.01），糖尿病非脂质代谢紊乱组血清miR?122水平高于对照组（P<0.05）。结论成功建立Poly（A）加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测血清miR?122水平，该方法的灵敏度高、特异性和重复性均较好。
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非肌层浸润性膀胱癌环形RNA位点差异性表达
目的 初步探讨非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)中环形RNA(circRNA)的异常表达.方法 2014年10月至2015年6月收集在广州医科大学附属第二医院泌尿外科经病理确诊的NMIBC患者标本,通过基因芯片对3例人NMIBC组织较癌旁正常组织差异表达的circRNA进行初筛,随机选取2个表达异常的circRNAs,在10对NMIBC及其配对正常组织采用实时荧光定量PCR检测.结果 与癌旁正常组织比较,在NMIBC组织中,表达上调的有3个,分别是:hsa_circ_102339、hsa_circ_103730、hsa_circ_104160,表达下调有4个,分别是:hsa_circ_100617、hsa_circ_104738、hsa_circ_103093、hsa_circ_105038.基因芯片提示hsa_circ_104738在NMIBC组织中表达明显低于癌旁正常组织.实时定量PCR测定hsa_circ_104738的表达水平与基因芯片结果一致.结论 NMIBC组织中存在circRNA表达异常,hsa_circ_104738尤为明显,有待进一步分析其可能机制.
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KRAS基因突变与结直肠癌Ki-67、p16表达的相关性
结直肠癌是消化道恶性肿瘤之一,近年在我国结直肠癌的发生率呈明显上升趋势.如何早期发现、早期诊断以及早期采取多种多样的、更有效的治疗手段,使结直肠癌患者获得更高的生存率和更长的生存期,一直是国内外学者重要的研究方向.
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Van-clear在实时荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌驱动基因突变中的应用研究
随着非小细胞肺癌个体化治疗的发展,精准医疗正逐渐成为肿瘤治疗的新方向,而“伴随诊断”作为精准医疗的基石也日益受到关注[1].与癌症发生、发展相关的重要基因称为驱动基因.研究发现,表皮生长因子受体(EGFR)及KRAS等驱动基因突变状态与非小细胞肺癌(NSCLC)靶向治疗密切相关[2].《中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识》指出,所有NSCLC患者必须在病理确诊的同时明确EGFR基因热点突变状态[3].然而,迄今为止临床上依然缺乏EGFR、KRAS等驱动基因突变的金标准方法,使用二甲苯透明脱蜡制作切片的同时应用Sanger法检测是传统的参考方法,但是该方法灵敏度低、实验耗时、成本高;甲醛、二甲苯具有明显的致畸性、致癌性[4,5].因此,探索新型环保透明脱蜡液与高效准确的检测方法越来越重要.
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Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ胶原基因在泡球蚴感染中期小鼠肝脏中的表达及意义
目的 观察泡球蚴感染中期BALB/c小鼠所致肝纤维化时Ⅰ型胶原(Col1a1)、Ⅲ型胶原(Col3a1)、Ⅳ型胶原(Col4a1)基因的表达及意义. 方法 将雌性BALB/c小鼠随机分为实验组(8只)和对照组(5只).实验组小鼠开腹,肉眼直视下左肝叶内注射泡球蚴混悬液,建立疾病动物模型；对照组以同样方法注射等量生理盐水.于感染中期第12周,颈椎脱臼处死小鼠,实验组取病变组织和病变邻近肝组织,对照组取注射部位所在肝组织以及临近肝组织,用4％甲醛固定,常规石蜡包埋,HE、Masson染色后观察形态学改变和肝纤维化程度.取病变临近肝组织,提取总RNA,反转录合成cDNA,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测Col1a1、Col3a1、Col4a1基因的表达,计量结果用相对单位(AU)表示. 结果 泡球蚴感染组和对照组Col1a1基因表达量分别为(2.155±0.809) AU和(1.000±0.221) AU,差异有统计学意义(t=3.427,P＜0.05)；Col3a1基因表达量分别为(18.641±10.244) AU和(1.000±0.412) AU,差异有统计学意义(t=10.324,P＜0.01)；Col4a1基因表达量分别为(0.894±0.495) AU和(1.000±0.381)AU,差异无统计学意义(t=1.932,P＞0.05).Masson染色检查泡球蚴感染组肝纤维化评分为2.72±1.04,对照组为1.0,差异有统计学意义(t=4.105,P＜0.05). 结论 在泡球蚴感染小鼠中期,引起肝纤维化的胶原主要为Ⅲ型和Ⅰ型.
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幽门螺杆菌多重耐药株hefA基因表达的检测与分析
目的 了解hefA外排基因表达与贵阳市幽门螺杆菌(Hp)多重耐药的关系. 方法 提取耐3种抗生素的多重耐药菌株(10株)、敏感菌株(6株)及质控菌株SS1的基因组DNA,PCR扩增hefA基因片段,PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测后测序,将测序基因片段序列输入NCBI中进行BLAST比对;利用TRIzol试剂提取上述细菌的RNA并逆转录成cDNA,以16 sRNA为内参基因,通过实时荧光定量PCR(Real time PCR)检测hefA基因和内参基因的CT值,通过比较2-△△CT判断多重耐药菌株和敏感菌株hefA基因表达的差异,以两小样本t检验进行统计学分析. 结果 2％琼脂糖凝胶电泳显示,6株敏感菌和10株多耐药菌及SS1 hefA基因PCR产物均约140 bp,测序显示受试菌hefA基因序列与SS1菌株序列的一致性大于96％;RT-PCR检测hefA外排基因的表达,敏感菌株的2-△△CT为0.895±0.540,多重耐药菌株的2-△△CT为3.387±1.597,差异元统计学意义(t=9.399,P＜0.05). 结论 hefA外排基因高表达是贵阳地区Hp多重耐药的机制之一.
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实时荧光定量PCR检测胆囊结石中华支睾吸虫DNA的研究
目的 运用基于Taqman探针实时荧光定量PCR技术检测胆囊结石中的华支睾吸虫DNA. 方法 选取2012年3～4月份40例实施内镜取石保胆手术患者的胆囊结石,通过傅里叶红外光谱法分析结石成分,对结石研磨涂片镜检观察,并提取其DNA,运用实时荧光定量PCR技术检测华支睾吸虫基因. 结果 40例患者的胆囊结石按主要成分可分为胆色素性结石(25例),胆固醇性结石(6例),混合性结石(9例).结石涂片镜检有23例发现华支睾吸虫虫卵(阳性率57.5％),其中胆色素性结石19例,混合性结石4例.实时荧光定量PCR检测华支睾吸虫DNA阳性率为65.0％(26/40),其中包括23例镜检虫卵阳性标本及3例镜检阴性标本. 结论 运用实时荧光定量PCR在胆囊结石中检测出华支睾吸虫DNA,敏感性高于镜检法查虫卵.这不仅为华支睾吸虫感染诱发胆囊结石形成提供了分子生物学证据,同时也提供了一种诊断华支睾吸虫感染的有效手段,对胆囊结石病人的病因诊断、临床治疗以及术后预防复发等具有重要的指导意义.
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细粒棘球绦虫核糖体蛋白S9基因克隆鉴定及其在不同发育阶段表达分析
目的 克隆鉴定细粒棘球绦虫原头蚴核糖体蛋白S9基因,分析其在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况.方法 从已构建的cDNA文库挑选基因,克隆EgRPS9基因并对编码产物的理化性质、功能位点、蛋白质的结构和功能域进行预测和分析,通过RealTime-PCR检测RPS9基因在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况. 结果 通过各种生物数据库对EgRPS9基因进行预测并测序,显示该基因具有完整开放阅读框,大小为564 bp,编码188个氨基酸,预测分子质量单位为22.0 ku,等电点为10.32.SMART保守功能区域分析发现该基因第107～149个氨基酸为40 S亚基S9结构域S4超家族.通过多序列比对发现该基因具有较高的保守性,进化树结果表明该基因与曼式血吸虫、日本血吸虫及华氏睾吸虫亲缘关系较近.Real time-PCR检测原头蚴和囊泡RPS9基因相对表达量分别为1.16和1.02,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 成功克隆出细粒棘球绦虫40S亚基RPS9新基因,该基因在细粒棘球绦虫不同发育阶段均有表达.
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贝类奥尔森派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
目的 建立一种快速、灵敏、特异的用于检测贝类奥尔森派琴虫的实时荧光定量PCR方法. 方法 根据基因库中奥尔森派琴虫的基因保守序列,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,对采自广西沿海的49份贻贝标本进行检测,并与常规PCR比较. 结果 建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达20个拷贝,比常规PCR灵敏度高100倍.49份贻贝标本的阳性率为16.3%,检测的奥尔森派琴虫基因组DNA含量为2.38×106~9.21×102拷贝/μl. 结论 建立的荧光定量PCR方法可以用于贝类奥尔森派琴虫感染的快速检测.
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基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用
目的 建立一种方便快捷的检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法.方法 根据GenBank公布的微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对引物,通过质粒DNA和卵囊检测标准曲线的绘制及特异性和重复性的研究,建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法,进而对奶牛粪便进行检测.结果 建立的Real-time PCR法对检测微小隐孢子虫具有很高的特异性,质粒DNA和卵囊的检测阈值分别达到1个拷贝和10个卵囊,奶牛粪便阳性率为25.93%(21/81),高于普通PCR检测率20.99%(17/80).结论 建立的Real-time PCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于微小隐孢子虫的快速定量检测.
关键词： 实时荧光定量PCR SYBR Green 微小隐孢子虫 检测 18S rRNA -
应用实时荧光定量PCR检测多亚型EV71的研究
目的 建立SYBR Green实时荧光定量PCR方法,以期用于EV71亚型检测.方法 根据中国大陆手足口病病原,设计多亚型EV71 VP1基因特异性引物,PCR扩增VP1基因片段,并与pEASY-T1载体连接,构建pEASY-T1-VP1重组质粒,以此为标准品进行实时荧光定量PCR,绘制标准曲线,评价方法的敏感性、特异性和稳定性,并利用该方法检测门诊初诊手足口病患者的咽喉拭子标本.结果 建立的实时荧光定量PCR标准曲线线性关系良好(R2=0.993),扩增效率为107.1％;方法的检测下限为(8.48×100)～(8.48×101)拷贝/μl之间,变异系数＜1％;非手足口病病原体无扩增信号,手足口病患者咽喉拭子阳性率为52.3％(45/86).阳性样品测序后与NCBI比对,符合率为100％.结论 建立的SYBR Green实时荧光定量PCR敏感、特异,可用于多亚型EV71感染的检测.
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冠心病患者外周血单个核细胞HCMV-DNA的荧光定量PCR检测
目的 了解冠心病(CHD)患者外周血单个核细胞(PBMCs)人巨细胞病毒(HCMV)-DNA存在情况并探讨其临床意义.方法 应用实时荧光定量PCR(real time FQ-PCR)方法,对62例CHD患者,29例其他心血管疾病患者和30例健康体检者的PBMCs内HCMV-DNA进行定量检测.结果 CHD患者PBMCs的HCMV-DNA检出率41.9％,其他心血管疾病组10.3％,正常对照组10.0％,差异有统计学意义(P＜0.05).CHD组HCMV-DNA载量介于103～105拷贝/ml者为12例,占阳性例数的46.1％(12/26),介于105～106拷贝/ml者为8例,占阳性例数的30.7％(8/26).结论 CHD患者PBMCs的HCMV感染可能在其致动脉粥样硬化性发病过程中发挥重要作用.
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肺炎链球菌不同生长时间自溶素lytA基因表达的差异性分析
目的 探讨肺炎链球菌lytA基因在细菌生长的不同时间点的表达差异. 方法 根据GenBank中肺炎链球菌M66株的lytA基因序列(FN 549899.1)设计并合成引物,选取17个生长时间点,分别提取肺炎链球菌的总RNA,采用实时荧光定量PCR技术(QRT-PCR)检测lytA基因在不同生长时间点的相对表达量,利用溶解曲线观察扩增反应特异性,采用双标准曲线法进行数据分析. 结果 经过内参基因16S RNA校正后,肺炎链球菌lytA基因相对表达量从生长的18 h-96 h呈现逐渐升高的趋势,96 h时达到高峰,与其他时间点比较差异有统计学意义(P＜0.05).之后开始下降,144 h生长点出现第二次升高趋势. 结论 不同生长时间点肺炎链球菌lytA基因表达量存在差异,与细菌培养时菌落表现的自溶现象相关,为进一步研究lytA基因与肺炎链球菌自溶现象的相关性奠定了基础.
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西藏尼木县一起动物间鼠疫的实验室判定
目的 对西藏自治区拉萨市尼木县一起动物间鼠疫进行实验室判定. 方法 取病死喜马拉雅旱獭脏器标本进行细菌学检测和抗原检测,采用实时荧光定量PCR检测鼠疫杆菌核酸(chro392基因). 结果 病死喜马拉雅旱獭脏器标本鼠疫杆菌检测阳性、鼠疫F1抗原检测阳性、实时荧光定量PCR检测鼠疫杆菌核酸阳性. 结论 该病死喜马拉雅旱獭实验室检测为鼠疫杆菌感染所致,据此判定尼木县此次事件为动物间鼠疫疫情.
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PCR-反向点杂交基因分型与实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒的研究
目的 评价PCR-反向点杂交基因分型与实时荧光定量PCR在检测人乳头瘤病毒(HPV)的意义.方法 同时采用PCR-反向点杂交基因分型和实时荧光定量PCR对121例女性官颈脱离细胞标本进行HPV检测.其中PCR-反向点杂交基因分型能检测23种HPV亚型,实时荧光定量PCR定量检测常见的13种高危HPV亚型.结果 PCR-反向点杂交基因分型检测HPV的阳性率为28.10％(34/121),实时荧光定量PCR检测HPV的阳性率为16.53％(20/121),差异有统计学意义(P＜0.05)；二者检测的符合率为93.39％(113/121).结论 PCR-反向杂交基因分型适用于HPV感染的筛查,而实时荧光定量PCR适用于HPV感染相关疾病的疗效与预后的判断.PCR-反向杂交基因分型与实时荧光定量PCR联合检测可提高HPV检测的特异性和敏感度,对于生殖道HPV感染以及子宫颈癌的早期发现、预防和治疗具有重要意义.
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新疆乌苏市古尔图地区长尾黄鼠感染巴尔通体情况调查
目的 了解新疆维吾尔自治区(新疆)乌苏市古尔图地区长尾黄鼠的巴尔通体感染状况,为该地区鼠传疾病风险预警与防控措施制定提供科学依据.方法 2017年5-9月采用一日弓形夹法在查岗果勒、布兰布拉克、白石头等地捕获长尾黄鼠86只,无菌采集鼠体肾脏,试剂盒法提取全基因组DNA.应用实时荧光定量PCR法检测样本DNA巴尔通体特异性基因ssrA,计算感染率,分析样本的检测循环阈值(cp值).结果 42只长尾黄鼠的巴尔通体实时荧光定量PCR检测为阳性,阳性率为48.84％;阳性样本cp值低为27.49,高为37.83,其中88.10％阳性样本的cp值在35.00～37.83之间,查岗果勒、布兰布拉克、白石头三地巴尔通体的阳性率分别为48.48％、60.87％和40.00％;布兰布拉克地区巴尔通体感染率、阳性动物染蚤率、蚤指数均高于查岗果勒和白石头地区;三地巴尔通体感染率与动物染蚤率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 新疆乌苏市古尔图地区长尾黄鼠间存在巴尔通体自然感染,传播范围广,但群体带菌量较低.
