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PR8F/NS1不同位点突变株对小鼠致病性的比较研究
为了探索NS1不同位点突变对流感病毒毒力的影响以及NS1毒力相关位点的作用机制.分析流感病毒NS1蛋白的毒力相关关键基因区段和关键位点,以实验室保存的H1N1亚型流感病毒PR8F为模板,对其NS1基因的第42、81、149位氨基酸分别进行定点突变.利用反向遗传操作技术,成功拯救出突变毒株PR8F-42、PR8F-81、PR8F-149.将获救病毒接种SPF鸡胚,连续传代5代,至病毒能够稳定扩增后,通过血凝效价分析病毒复制效率.并将获救病毒与PR8F均以106 TCID50/100μL感染BALB/c小鼠,观察各组小鼠临床表现、体重变化及存活率.剖检攻毒后死亡小鼠,观察病理特征,制作肺组织病理切片.并提取小鼠肺脏RNA,通过qPCR检测各组小鼠肺脏的病毒载量.结果表明,PR8F的NS1蛋白第42位氨基酸由丝氨酸(Ser)改变为脯氨酸(Pro)对小鼠的致病性无明显改变.第81位、149位氨基酸突变则都能减弱突变株对小鼠的致病性,进而为研究NS1毒力相关位点的作用机制提供平台.
关键词： H1N1亚型流感病毒 定点突变 NS1蛋白 实时荧光定量PCR 致病性 -
一种通用的基于NSP5基因的A组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
建立一种通用的检测不同物种来源A组轮状病毒的逆转录实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR).根据轮状病毒保守的NSP5基因的保守序列设计引物和探针,建立并优化RT-qPCR检测体系;同时通过9份轮状病毒毒株和96份临床标本的检测对该方法和目前常用的基于NSP3基因的2种RT-qPCR方法进行灵敏度和检出率的比较.新建立的RT-qPCR方法特异性高,重复性好;与基于NSP3基因的方法相比:(1)在临床标本检测中,检出率无差异;(2)9株培养病毒检测中,NSP5体系可全部检出,两个NSP3对照体系NSP3-1和NSP3-2的检出率分别为78.78％(7/9)和88.89％(8/9);(3)NSP5体系与对照NSP3-1体系灵敏度相当,检测下限比NSP3-2体系低100倍.本研究建立的基于NSP5的荧光定量PCR体系灵敏度高,可检测毒株范围广,为检测不同物种来源的A组轮状病毒提供一种新的选择.
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6319例高危型人乳头瘤病毒核糖核酸定量检测的结果分析
目的 探讨女性高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染亚型分布情况及年龄特点.方法 采用双通道实时荧光定量PCR检测方法,对6319例女性高危型HPV-DNA 16型、HPV-DNA 18/45型、HPV-DNA31型、HPV-DNA 33/52/58/67型进行定量分析,比较不同年龄组HPV-DNA阳性率及不同型别HPV-DNA的分布.结果 6319例女性中检出HPV-DNA阳性患者794例,总阳性率为12.6％.51～60岁组与≥61岁组的阳性率均为15.8％,且高于其他年龄组差异有统计学意义(P＜0.05),其次为21～ 30岁组阳性率为13.8％.不同类型HPV - DNA阳性率从高到低依次为HPV- DNA 33/52/58/67型(69.3％)、HPV-DNA 16型(21.5％)、HPV-DNA 18/45型(12.1％)、HPV-DNA 31型(6.9％).结论 高危型人乳头瘤病毒核糖核酸定量检测可用初筛女性宫颈癌的人群,更应作为年龄在38～58岁的女性健康体检时的必选项目,且对宫颈癌的诊断和药物治疗具有重要意义.
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ELISA法和RT-PCR法在麻疹病毒检测中的应用比较分析
目的 探讨酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)对疑似麻疹病例的麻疹病毒的检测,为疾病的尽早确诊及治疗提供实验依据.方法 以上海市宝山区2014年4月至2015年12月的250例疑似麻疹病例为研究对象,采集其血清标本和咽拭子标本,分别应用ELISA法检测患者血清中的麻疹特异性的免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)抗体和RT-PCR法检测咽拭子中麻疹病毒的核酸.结果 250例疑似麻疹病例,排除风疹病毒阳性的34例病例,其中麻疹病毒(measles virus,MV) IgM抗体呈阳性的有80例,阳性率为37.04％;MV RT-PCR呈阳性的有128例,阳性率为59.26％.RT-PCR的检测阳性率显著高于IgM检测(x2=41.14,P＜0.001).结论 RT-PCR法可快速诊断麻疹病毒的病原学,且对出疹初期麻疹IgM呈阴性的病例可进～步确诊,是一种有效可靠的方法.
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支气管肺泡灌洗液与咽拭子荧光定量PCR法检测成人肺炎支原体感染的对比研究
目的 用实时荧光定量PCR方法对肺部感染危重患者的咽拭子样本和支气管肺泡灌洗液(BALF)进行检测,探讨不同样本对检测结果的影响.方法 450例肺部感染危重患者纳入临床研究,用实时荧光定量PCR方法检测患者咽拭子样本和BALF样本,对检测结果进行比较.结果 在450例肺部感染危重患者中,肺炎支原体肺炎(MPP)患者1 15例,占25.6％.BALF样本检测的阳性率为69.56％,咽拭子样本检测的阳性率为13.04％.肺炎支原体(MP)感染的年龄段主要在20～39和50 ～59岁,以50-59岁年龄段人数多.结论 MP是肺部感染主要病原体之一,采集BALF标本用实时荧光PCR检测MPP阳性率更高,是MPP诊断的有效手段.
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实时荧光定量PCR技术在致病菌检测中的应用
目的 本文将实时荧光定量PCR (Real-time Q-PCR)法检查致病菌与细菌培养法作比较,探讨对指导临床诊断治疗的意义.方法 采用Real- time Q- PCR法和细菌培养法对100份标本进行6个微生物项目的检测,并比较两种方法的灵敏度、特异性和准确性.结果 Real-time Q-PCR法检测结果与细菌培养法,除完全符合的19例标本之外,另有8例用细菌培养法为阴性的标本,用Real- time Q- PCR法检测为阳性.结论 Real-time Q-PCR法较细菌培养法具有准确性好、灵敏度高、特异性强和检测快速等优点,是快速筛查致病菌的理想检测方法之一.
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罗氏Light Cycler480实时荧光定量PCR系统检测HBV-DNA性能验证
目的 探讨适合本实验室的荧光定量PCR检测HBV-DNA的性能验证方法,评估其是否能满足临床使用要求.方法 参考GB/T 20470-2006《临床实验室室间质量评价要求》,应用实验室检测患者标本、第三方质控品、卫生部临检中心室间参考物质等,按方法学性能评价指标设计验证试验,对检测结果的精密度、准确度,线性范围和参考区间等参数进行性能验证.结果 本检测系统批内精密度和总精密度CV均小于＜5％;分析NCCL发放的高低水平的室间质评参考物,检测结果与靶值的偏倚分别为0.25IU/mL、0.23IU/mL,检测结果偏倚在-0.4～ 0.4IU/mL范围内;线性范围验证结果显示,线性回归方程为Y=0.998X-0.056,R2=0.998,斜率在0.95～ 1.05之间,截距接近于0;参考区间评价结果显示20例健康体检者HBV-DNA定量检测结果均在参考区间内(＜500IU/mL),说明引用的参考区间有效.结论 罗氏Light Cycler 480实时荧光定量PCR系统检测HBV-DNA性能指标均达到规定要求,能满足临床预期要求.
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实时荧光定量PCR在细胞因子mRNA检测研究中的应用
RR-FQ-PCR技术是一种新PCR技术,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点.本文就RT-FQ-PCR概念、原理、方法、研究进展及其在细胞因子mRNA检测中的应用等作一综述.
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N-乙酰半胱氨酸改善高游离脂肪酸所致大鼠外周胰岛素抵抗
目的 探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对高游离脂肪酸(FFA)导致的外周胰岛素抵抗的影响及机制.方法 SD大鼠随机分为对照组(NS组,12只)、脂肪乳输注组(FFA组,13只)和脂肪乳+NAC组(NAC组,12只).输注48 h,(1)测血浆硝基酪氨酸,丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平;(2)高胰岛素正糖钳夹试验,评价外周胰岛素抵抗程度;(3)实时荧光定量PCR方法测定肌肉组织胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)mRNA表达.结果 (1)FFA组硝基酪氨酸,MDA高于NS组,GSH低于NS组,NAC分别改善28.6%,33.1%,22.9%(P＜0.05);(2)FFA组葡萄糖输注率(GIR)比NS组降低(P＜0.05),用NAC后GIR升高36.6%(P＜0.05);(3)FFA组肌肉组织IRS-1、IRS-2 mRNA表达比NS组降低87.7%、50.7%(P＜0.05);NAC组肌肉组织IRS-1、IRS-2表达比FFA组增加370.1%、46.2%,(P＜0.05).结论 NAC干预能改善高FFA所致的外周胰岛素信号传导障碍,逆转外周胰岛素抵抗,可能与NAC纠正机体氧化及抗氧化失衡有关.
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雌激素下调人乳腺癌细胞系MCF-7高迁移率蛋白的表达
目的 探讨雌激素与其拮抗剂他莫昔芬对人乳腺癌细胞系MCF-7高迁移率族蛋白(HMGB1)表达的影响.方法 在培养的MCF-7细胞中分别加入无水乙醇、不同浓度的17-beta-雌二醇(E2)和他莫昔芬培养4 d后.用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测HMGBl Mrna和蛋白水平.结果 17-beta-E2浓度在10-6和10-4moL/L时,HMGBI Mrna和蛋白的表达均显著低于对照组(P<0.05).他莫昔芬浓度在10-6和10-4moL/L时,HMGB1 Mrna和蛋白的表达显著高于对照组(P<0.05).结论 雌激素能够下调HMGB1的表达,而其拮抗剂他莫昔芬则相反.
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急性髓系白血病患者化疗后微小残留病与多药耐药基因表达相关
目的：明确急性髓系白血病（ AML）中微小残留病（ MRD）与多药耐药基因表达的相关性。方法收集初诊AML患者骨髓52例，用real-time PCR检测患者化疗前ABCB1、ABCC1、ABCC4及ABCG24种多药耐药基因的表达，同时用多参数流式细胞术（ MFC）检测患者诱导化疗后和化疗3、6和9个月后的MRD表达水平。结果52例AML患者MRD表达水平与ABCB1（P＜0.01）、ABCC1（P＜0.01）、ABCC4（P＜0.01）和ABCG2（P＜0.01）的mRNA表达水平具有明显相关性。持续监测9个月后，MRD再次转阳者ABC基因表达水平显著高于持续阴性者：ABCB1（ P＜0.05）、ABCC1（P＜0.05）、ABCC4（P＜0.01）和ABCG2（P＜0.01）。结论 MRD表达水平与多药耐药基因表达水平显著正相关。
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C57小鼠肝、肾、脾、胸腺组织时钟基因的表达特点
目的 探测不同脏器组织中时钟基因的表达水平及其波动性.方法 用实时荧光定量PCR方法检测C57小鼠肝、肾、脾和胸腺中4种重要时钟基因mBMAL1、mPER1、mCRTY1和mCRY2的表达.结果 肝和肾中4种时钟基因的表达水平均有显著波动(P＜0.01);而脾中仅mBMAL1、mPER1、mCRY1的节律性表达明显(P＜0.01,P＜0.001,P＜0.05),并且波动振幅较为平和;胸腺中4种时钟基因的表达均不具备昼夜波动的特征,同时表达水平也与其他3种组织存在显著差异(P＜0.01).时钟基因所构成的环路在不同组织中也不尽相同,mPER1的负反馈效应在肝中较为主要,mCRY1和mCRY2的负反馈效应在肾和脾中较为主要.结论 不同周围组织的分子时钟存在着显著的差异,其相关正负反馈元件和环路有待进一步研究阐明.
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非特异性精神发育迟滞患者外周血miRNA的差异表达及临床诊断价值
目的:研究非特异性精神发育迟滞患者外周血miRNA的差畀表达及其诊断价值.方法:检索国内外文献筛选与非特异性精神发育迟滞相关的10种miRNA,按照病历号随机选取30例非特异性精神发育迟滞患者作为病例组,同时按照体检号入组30例身心健康者作为对照组,入组后抽取静脉血5ml,运用实时荧光定量PCR技术检测病例组和对照成员10种miRNAs的表达水平.结果:①病例组与对照组比较年龄、性别、城乡、独生子女无统计学差异(P＞0.05);②病例组与对照组比较miRNA—125b、miRNA—132、miRNA—222、miRNA—223和miRNA—363表达水平有统计学差异(P＜0.05);③ROC分析发现,miRNA—222(AUC=0.786,P—0.043)、miR-NA—223(AUC=0.833,P=0.008)对特异性精神发育迟滞有一定的诊断价值.结论:miRNA—222和miRNA一223的异常表达对非特异性精神发育迟滞有一定的诊断作用,可能与非特异性精神发育迟滞的发病机制有明显关联.
关键词： 非特异性精神发育迟滞 微小RNA 实时荧光定量PCR 外周血 -
重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织p21、cyclin D1及CDK4表达的影响
目的 观察重组人内抑素(rhEndostatin)对佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜组织p21,细胞周期素D1(cyclin D1)及细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)基因表达的影响,探讨rhEndostatin抑制AA大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖的分子机制. 方法 雄性SD大鼠36只,随机分为正常组(n=12)、AA模型组(n=12)和rhEndostatin(2.5mg/kg)治疗组(n=12).制备AA大鼠模型,分别采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法,定量分析rhEndostatin对AA大鼠滑膜组织p21、cyclin D1、CDK4 mRNA及cyclin D1蛋白表达的影响. 结果 rhEndostatin治疗组大鼠滑膜组织p21、cyclin D1 mRNA和cyclin D1蛋白表达水平降低,CDK4 mRNA表达水平增加,与AA模型组比较,差异均有统计学意义(P< 0.01). 结论 rhEndostatin降低AA大鼠滑膜组织 cyclin D1表达水平可能是其抑制AA FLS增殖的分子机制之一.
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ENPP1基因在人卵巢的定位表达及其与多囊卵巢综合征的关系
目的 胰岛素抵抗及其伴随的高胰岛素血症是多囊卵巢综合征(PCOS)重要的病理生理改变,核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ENPPI)表达异常与胰岛素抵抗有关,本研究拟了解ENPP1基因在卵巢颗粒细胞中的表达及其与PCOS的关系,为进一步研究ENPP1在卵巢中的生理功能及PCOS的发病机制打下基础.方法 收集PCOS患者(PCOS组)12例,以及排卵功能正常的单纯输卵管因素不育及男性不育的正常体重妇女(非PCOS组)22例患者的卵巢颗粒细胞.利用mRNA RT-PCR、原位杂交和实时荧光定量PCR的方法检测ENPP1在育龄期妇女及PCOS妇女颗粒细胞中的表达.结果 RT-PCR的方法及原位杂交结果均显示,ENPP1在颗粒细胞胞浆中表达.ENPPl在PCOS组的2-△C1值为1.67±0.89,高于非PCOS组的2-△C1值0.94±0.76,两组间差异有统计学意义(P=0.017).结论 ENPP1在卵巢颗粒细胞中的表达差异提示,ENPP1参与了颗粒细胞的生理功能及卵巢中PCOS发病的病理机制.
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神经再生素促大鼠背根神经节生长作用的研究
目的研究神经再生素(NRF)对体外培养新生大鼠背根神经节生长及NF-H表达的影响.方法体外大鼠背根神经节(DRG)培养;免疫荧光细胞化学、实时荧光定量PCR和Western blot等方法.结果免疫荧光细胞化学结果提示,NRF能促进背根神经节神经突起的生长,浓度为2.0 mg/L时生长状况佳;实时荧光定量PCR和Western blot结果提示,NRF能增加体外培养的背根神经节NF-H mRNA和蛋白的表达,在浓度为2.0mg/L时表达高.结论NRF能促进体外培养背根神经节神经突起的生长和NF-H的表达,表明NRF对发育期感觉神经元具有神经营养作用.
关键词： 神经再生素:背根神经节 神经丝蛋白 实时荧光定量PCR 免疫荧光细胞化学 大鼠 -
牛膝多肽促大鼠海马神经元突起的生长
目的 研究牛膝多肽(ABPP)对体外培养的大鼠海马神经元突起生长的促进作用及其对生长相关蛋白-43 (GAP-43)和神经丝蛋白(NF-H)mRNA和蛋白表达的影响. 方法 以体外原代培养的胎鼠海马神经元为研究模型,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)检测ABPP对海马神经元细胞活性的影响,通过免疫荧光细胞化学法,采用Image-Pro Express软件测量不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药24h,对海马神经元神经突起生长的影响;通过实时荧光定量PCR法定量分析不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药6h,对海马神经元GAP-43和NF-H基因表达的影响;采用免疫印迹法观察不同浓度ABPP(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)加药24h后,对海马神经元GAP-43 和NF-H蛋白表达的影响.同时应用胞外信号调节激酶(ERK)特异性拮抗剂PD98059与ABPP共培养海马神经元,分析ABPP对海马神经元的作用与ERK通路的关系. 结果 ABPP可有效地促进海马神经元突起的生长,加药后24h浓度为1.0mg/L,作用强;实时荧光定量RT-PCR、免疫荧光细胞化学法和免疫印迹检测的结果表明,ABPP能增加体外培养的海马神经元GAP-43和NF-H的mRNA和蛋白表达,PD98059可抑制该过程. 结论 ABPP能促进体外培养的海马神经元神经突起的生长,其作用与上调GAP-43和NF-H 基因的表达相关,并可能与ERK通路有关.
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围着床期小鼠胚卵L-选择素的表达变化及作用
目的 探讨围着床期小鼠胚卵L-选择素的表达规律及其对胚胎着床的影响.方法 1.分别采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)和免疫荧光组织化学方法检测围着床期小鼠胚卵L-选择素mRNA和蛋白的表达,并用免疫荧光组织化学方法检测L-选择素在细胞的定位;2.用子宫角内抗体干预的方法观察并统计小鼠着床胚胎数.结果 1.随着胚卵分化成熟,L-选择素mRNA和蛋白表达均呈逐渐增加趋势,胚泡期表达强(P<0.05).L-选择素在单细胞期和4细胞期有少量表达,桑椹胚周边区L-选择素表达显著增强,胚泡滋养层L-选择素表达强.2.小鼠子宫角实验侧(经抗L-选择素单克隆抗体干预)胚胎着床数较对照侧(经等体积生理盐水干预)明显减少(P<0.05).结论 胚卵可能通过L-选择素信号转导途径及其与子宫内膜的糖蛋白受体结合参与胚胎着床.
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日本沼虾血蓝蛋白基因cDNA全长克隆及表达分析
目的 克隆日本沼虾血蓝蛋白基因,进行生物信息学及时空表达分析. 方法 利用cDNA末端快速扩增技术( RACE)从肝胰腺中克隆血蓝蛋白基因cDNA全长序列,用生物学软件对其序列进行生物信息学分析,时空表达分析采用实时荧光定量PCR方法. 结果 日本沼虾血蓝蛋白基因cDNA全长2 151 bp,包含14 bp的5'UTR、148 bp的3'UTR和189 bp的开放阅读框(ORF).ORF编码663个氨基酸,预测分子量为76.65kD,理论等电点为5.42,含有典型的3个血蓝蛋白结构域和2个保守的铜离子结合位点.与淡水螯虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白相似性分别为70％和63％.该基因在肝胰腺中的相对表达量高,肌肉和血细胞表达较弱,大颚器官、表皮和卵巢几乎不表达:肝胰腺血蓝蛋白基因的表达量在蜕皮间期高,蜕皮后期和蜕皮前期较低；嗜水气单胞菌刺激后肝胰腺中的表达量显著增加. 结论 与其他甲壳动物相似,日本沼虾血蓝蛋白基因具有典型的结构域和保守的铜离子结合位点,在蜕皮间期的肝胰腺中呈高表达,是参与机体免疫防御反应的一种重要分子.
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哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路相关基因对大鼠再生肝8种细胞生长过程的调节作用
目的 从基因转录水平了解哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对大鼠再生肝8种细胞的生长调节作用. 方法 在本实验室建立大鼠2/3肝切除模型,分离和鉴定再生肝8种细胞,采用大鼠Genome230 2.0芯片检测、数据处理及实时荧光定量PCR等方法,构建mTOR的信号通路网络,分析mTOR信号通路的相关基因在以上8种细胞中的表达谱,用系统生物学方法分析基因表达谱预示的细胞生长活动. 结果 mTOR信号通路涉及110个基因和25条途径,99个基因含于大鼠Genome 230 2.0芯片,82个基因与大鼠肝再生相关.其中,在启动阶段,mTOR信号通路主要参与激活、促进肝细胞、陷窝细胞、库普弗细胞、树突状细胞、肝星形细胞和窦内皮细胞的生长过程；在进展阶段,mTOR信号通路明显地促进肝细胞、胆管上皮细胞、卵圆细胞、肝星形细胞、库普弗细胞、陷窝细胞和树突状细胞的生长过程；在终止阶段,mTOR信号通路的大多数途径对肝细胞、库普弗细胞和树突状细胞的生长过程的促进作用减弱,而途径25却对肝细胞、窦内皮细胞、肝星形细胞和陷窝细胞的生长过程有明显的抑制作用. 结论 mTOR信号通路的25条途径和82个基因参与大鼠再生肝8种细胞的生长调控.
