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登革病毒NS1蛋白在病毒致病与免疫中的作用
登革病毒可引起人类登革热、登革出血热以及登革休克综合征,其在世界范围内均有流行.至今登革出血热的发病机制仍未明确,也没有可用的疫苗和特效药物.近年来对登革病毒非结构蛋白NS1的研究逐渐增多,认为它与登革出血热的发病机制有一定关系,它在登革病毒感染的诊断以及亚单位疫苗的研制等方面也有一定的价值.本文就登革病毒NS1蛋白与病毒复制和致病的关系以及其在临床诊断和疫苗研制中的意义作一综述.
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乙型流感病毒NS1基因的进化
NS1蛋白是由流感病毒第8个RNA片段(丙型流感病毒NS1由第7个片段)编码的RNA结合蛋白[1].研究表明,NS1蛋白与流感病毒宿主存在复杂的相互作用[2-5],是流感病毒主要的毒力因子[6].乙型流感病毒是导致流感暴发的主要病原之一,目前为止只发现一个亚型,宿主特异性较强[7].探讨乙型流感病毒NS1蛋白的变异规律,分析其起源和进化过程,对于监控流感病毒感染人群毒力的变化,预测流感病毒流行趋势以及流感减毒活疫苗株的筛选具有重要的参考意义.
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B型流感病毒NS1蛋白羧基端缺失对病毒致病性的影响分析
本研究利用基因工程技术探索B型流感病毒NS1蛋白羧基端缺失对病毒致病性的影响,并利用反向遗传学技术从体外拯救NS1蛋白羧基端缺失的B型流感病毒,评估去除NS1蛋白羧基端对B型流感病毒致病性的影响,探究B型流感病毒致病性变异的分子基础.通过全基因合成和反向遗传学技术从体外拯救NS1蛋白羧基端发生171个氨基酸缺失的B型流感病毒B/Yamagata/16/88株,命名为B-L5.将实验室之前拯救的母本株B/Yamaga-ta/16/88(以下简称B-S9)和B-L5以3×105EID50的攻毒剂量分别人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒滴度等方面进行致病性分析.成功构建了B型流感病毒B/Yamagata/16/88 NS1蛋白羧基端缺失株反向遗传平台.母本株B-S9和NS1蛋白羧基端缺失株B-L5均能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠均呈现低致病性;B-S9感染小鼠后,从攻毒后第3d至第7d,体重持续下降,相反,B-L5感染小鼠后,只在攻毒后第2d出现体重下降,攻毒后第3d体重开始回升;B-S9和B-L5感染小鼠后均能在小鼠肺部进行复制,但攻毒后第3d,B-L5感染小鼠肺脏滴度要比B-S9低7 900倍,攻毒后第6d,B-L5感染小鼠肺脏已检测不到病毒复制.实验结果表明,NS1蛋白羧基端缺失可以明显降低B型流感病毒对小鼠的致病性.B型流感病毒致病性变异的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统的建立为B型流感病毒分子机制的研究奠定了基础,同时也为B型流感减毒活疫苗的研究开辟了新途径.
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抗登革病毒NS1单抗的制备及检测NS1方法的建立
制备抗登革病毒NS1蛋白单克隆抗体,建立检测NS1的ELISA方法.表达1～4型登革病毒NS1蛋白,将1型NS1蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体.经ELISA、Western blotting、间接免疫荧光筛选和鉴定单克隆抗体,进行纯化和HRP标记.通过鉴定每两株单抗之间是否存在竞争作用,选择非竞争单抗组合并建立NS1捕获法ELISA.结果获得7株高滴度抗NS1单抗,捕获法ELISA可以检出10ng/mL NS1.原核表达登革病毒NS1蛋白制备的单抗可以和天然病毒抗原反应,NS1捕获法ELISA可以用于登革病毒感染检测.
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PR8F/NS1不同位点突变株对小鼠致病性的比较研究
为了探索NS1不同位点突变对流感病毒毒力的影响以及NS1毒力相关位点的作用机制.分析流感病毒NS1蛋白的毒力相关关键基因区段和关键位点,以实验室保存的H1N1亚型流感病毒PR8F为模板,对其NS1基因的第42、81、149位氨基酸分别进行定点突变.利用反向遗传操作技术,成功拯救出突变毒株PR8F-42、PR8F-81、PR8F-149.将获救病毒接种SPF鸡胚,连续传代5代,至病毒能够稳定扩增后,通过血凝效价分析病毒复制效率.并将获救病毒与PR8F均以106 TCID50/100μL感染BALB/c小鼠,观察各组小鼠临床表现、体重变化及存活率.剖检攻毒后死亡小鼠,观察病理特征,制作肺组织病理切片.并提取小鼠肺脏RNA,通过qPCR检测各组小鼠肺脏的病毒载量.结果表明,PR8F的NS1蛋白第42位氨基酸由丝氨酸(Ser)改变为脯氨酸(Pro)对小鼠的致病性无明显改变.第81位、149位氨基酸突变则都能减弱突变株对小鼠的致病性,进而为研究NS1毒力相关位点的作用机制提供平台.
关键词： H1N1亚型流感病毒 定点突变 NS1蛋白 实时荧光定量PCR 致病性 -
登革病毒2型NS1蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果观察
目的以登革病毒2型(dengue virus 2, DV2)非结构蛋白(non-structrul protein 1, NS1)为靶基因,构建DV2-NS1的候选DNA疫苗;并探讨其在小鼠体内诱导特异性体液免疫和细胞免疫的作用. 方法将登革病毒2型NS1/NS2a基因片段克隆至含AG强启动子的真核表达载体pCXN2上,构建成重组体pCXN2-NS1/NS2a.在体外将重组质粒转染Cos-7细胞,间接免疫荧光检测其在真核细胞中的表达.大量提取空质粒和重组质粒,进行动物免疫实验. 结果重组质粒可在真核细胞中有效地表达NS1蛋白.免疫接种小鼠后可诱发机体产生针对NS1蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫.末次免疫前已有抗体产生,4周后达高峰.抗体依赖补体介导的溶细胞作用(antibody-dependent complement-mediated cytolysis,ADCC)试验结果显示产生的抗体在体外具有特异的杀细胞作用.淋巴细胞增殖实验结果显示,实验组小鼠的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异有显著性.流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4+、CD8+ T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4+、CD8+ 细胞水平有较大升高(P<0.01).动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,有66.6%的免疫鼠受到保护. 结论 NS1/NS2a基因重组质粒免疫小鼠可以诱发小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答.这些结果为进一步研制登革病毒DNA疫苗提供了参考依据.
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登革2型病毒43株NS1基因的克隆及在真核细胞中的表达
目的：研究含登革2型病毒43株（D2-43）NS1基因的重组质粒DNA在幼地鼠肾细胞BHK-21的表达。方法：将含信号肽的NS1基因片段插入到pcDNA3.1的KpnⅠ位点和EcoRⅠ位点之间，获得重组表达载体pcDNA-NS1。用电穿孔法将其导入BHK-21细胞，G418选择培养。挑取单细胞克隆，RT-PCR及蛋白质印迹法鉴定NS1基因的稳定表达。结果：在随机挑取的5个单细胞克隆中，有4个克隆的RT-PCR鉴定为阳性，蛋白质印迹结果表明NS1基因获得表达。结论：构建的pcDNA-NS1质粒在BHK-21细胞中有稳定表达，因此含NS1基因的该重组质粒DNA可用作核酸免疫。
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西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体.方法:以原核表达的重组NS1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合.以真核表达的重组NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞.并利用Western blot和IFA试验对所获得的单克隆抗体进行鉴定.结果:共获得了2株稳定分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为WN-1C10和WN-3D10,其亚类鉴定分别属于IgG2a和IgG1.这2株单克隆抗体均能与西尼罗病毒NS1蛋白和病毒抗原发生特异性反应,而与日本脑炎病毒无交叉反应.结论:本实验成功制备出针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体,为我国建立西尼罗病毒与日本脑炎病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础.
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人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白的原核表达及纯化
目的 表达并纯化人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白.方法 用RT-PCR法从人甲型流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)中扩增NS1基因,克隆人原核表达载体pTXB1,构建重组原核表达质粒pTXB1/NS1,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达形式和表达量.经几丁质柱亲和层析纯化表达蛋白,串联飞行时间质谱仪检测其相对分子质量.结果 所构建的重组表达质粒pTXB1/NS1序列完整,插入的基因片段全长690 bp.以1.0 mmol/L IPTG37℃诱导4 h,重组蛋白表达量高,占菌体总蛋白的50%以上.破菌上清及沉淀中均有目的蛋白表达.纯化的NS1蛋白纯度达95%以上,相对分子质量约为26 000.结论 已成功表达并纯化了人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白,为其进一步的研究奠定了基础.
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A型流行性感冒病毒非结构蛋白1与宿主细胞凋亡信号转导关系的研究进展
流行性感冒(流感)病毒基因组的非结构(NS)蛋白基因是其基因组中小的基因节段,它转录成的线性mRNA共编码两种蛋白质,即NS1和NS2蛋白.早期研究表明,这两种蛋白质仅存在于被流感病毒感染的细胞中,而在病毒粒子内则无,所以被称为NS蛋白.NS1蛋白主要表达于感染细胞核内[1],在感染早期大量合成;NS2蛋白主要在胞质内表达,后期才会合成产生,在成熟的病毒粒子中仅少量存在.NS1蛋白参与调节病毒RNA的合成,前mRNA的运输、剪切及mRNA的翻译过程.早期研究提示,NS1蛋白在流感病毒感染的不同阶段或同时具有抑制宿主细胞蛋白合成、加强病毒蛋白合成的作用,被广泛认为是A型流感病毒对抗机体免疫反应的毒力因子之一,对流感病毒的毒性发挥非常重要的作用.
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甲型流感病毒NS1蛋白应用研究进展
流感病毒是引起急性流感的病原体,具有传染性强、变异快和宿主范围广的特点.随着对流感病毒研究的深入,人们对流感病毒的认知度不断提高,对其的开发利用也随之启动,其中对短的NS基因及其编码蛋白(NS1和NS2)的研究开发更令人注目.NS1蛋白虽在病毒出芽时未被包装,但在感染细胞中发挥了多种生物功能,如对宿主细胞IFN的调节、与病毒RNA转录和蛋白的表达有关等.人们利用NS1蛋白这些生物特性,进行研究开发利用.此文对NS1蛋白开发应用及其研究进展作一综述.
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甲型流感病毒NS1蛋白影响细胞凋亡的研究
近年来的研究发现,甲型流感病毒NS1蛋白在流感病毒影响宿主细胞凋亡中发挥了重要的作用.开展对NS1蛋白的研究,可以进一步了解流感病毒的致病机制,这对流感病毒其他方面的研究具有重要意义,该文就NS1蛋白基本结构及其影响宿主细胞凋亡的研究进展作了介绍.
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H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白研究进展
禽流感(avian influenza ,AI) 为A型流感病毒(avian influenza virus ,AIV)引起的禽类流行性感冒.根据是否引起流感及症状的不同,通常将禽流感分为高致病性(highly pathogenic avian influenza,HPAI)、低致病性(low pathogenic avian influenza,LPAI) 和非致病性禽流感(no pathogenic avian influenza,NPAI).
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2型登革病毒NS1蛋白单克隆抗体的生物学特性研究
目的 制备抗2型登革病毒NS1蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性. 方法 以重组NS1蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb,采用间接ELISA方法 和western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法 鉴定mAb相对亲和力. 结果 获得9株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6 and Ⅲ 3D2;相对亲和力均在106以上.Western blot显示9株mAb能特异识别重组NS1蛋白. 结论 成功地制备出抗登革病毒2型病毒NS1蛋白的9株mAb,为建立快速特异检测臀革病毒的实验方法 提供了有力的工具.
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重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备
目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.
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登革病毒非结构蛋白NS1在检测和免疫预防中的应用
登革热是由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型登革病毒引起的急性传染病,主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,引起广泛流行.登革病毒是一种单股正链的RNA黄病毒,依次编码3种结构蛋白,即包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和衣壳蛋白(C),和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5),NS1蛋白在病毒感染、复制及病理过程中起着重要作用.本文就NS1蛋白在登革病毒检测及免疫预防方面的研究进展作一综述.
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登革病毒NS1蛋白的原核表达及其在登革热快速诊断中的应用
[目的]重组表达1型登革病毒( DENV-1)和3型登革病毒(DENV-3)NS1蛋白,制备多克隆抗体,建立特异、敏感的登革病毒NS1抗原ELISA检测法.[方法]RT-PCR扩增DENV-1和DENV-3 NS1全长基因,经T-A克隆后,将目的基因分别与质粒PET30a(+)连接构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21感受态细胞.阳性克隆经IPTG诱导表达,并对目的蛋白进行纯化.用纯化的NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗NS1多克隆抗体.应用NS1多克隆抗体建立登革病毒NS1抗原双抗体夹心ELISA检测法.[结果]成功构建了高效表达DENV-1和DENV-3 NS1蛋白的原核表达系统,获得纯化的NS1蛋白:用重组NS1蛋白免疫BALB/c小鼠后获得高效价(＞1:30000)的抗DENV-1和DENV-3 NS1的特异性抗体；用NS1多克隆抗体建立了登革病毒NS1抗原双抗体夹心ELISA检测法,该法可特异性检出登革病毒NS1抗原,敏感性达到1 ng/mL,与黄病毒的其它成员无交叉反应,表明具有良好的特异性.[结论]本研究成功构建了DENV-1和DENV-3 NS1蛋白的原核表达系统,高效表达了具有良好免疫原性及免疫反应性的DENV-1和DENV-3重组NS1蛋白;建立了检测登革病毒NS1抗原的双抗体夹心法,并证明该检测法具有较高的灵敏度和特异性,具有良好的应用前景.
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4种血清型登革病毒NS1蛋白序列及B细胞抗原表位特异性分析
目的 比较4种血清型登革病毒NS1蛋白型特异性抗原表位基因序列及氨基酸序列之间的差异,为利用基因差异进行血清学分型及疫苗研究提供新的线索.方法 利用DNAstar数据包中的Editseq程序,从20株登革病毒分离株的全基因组序列中将NS1基因型特异性抗原表位序列截取出来,再用Clustal X软件进行多序列比对,进行同源性分析,找出型内为保守的抗原表位序列.并将比对结果在120株登革病毒序列中进一步验证.结果 NS1蛋白36～45和71～85位氨基酸为型特异性抗原表位,高度保守,型内完全相同,型间不同.结论 NS1蛋白36～45位氨基酸可以作为登革病毒血清分型和研制亚单位疫苗的靶标.
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Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达及其免疫血清的制备
目的 原核表达、纯化II型登革病毒NS1A蛋白(NS1蛋白1～180氨基酸即DENV2 NS1A),将其免疫动物制备免疫血清并鉴定.方法 构建重组融合质粒pET22b-p64K-L-DENV2 NS1A,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG低温诱导表达.表达的融合蛋白经Hitrap Talon crude柱亲和层析纯化后,免疫雌性日本长耳兔获得抗DENV2 NS1A兔抗血清,用Western blot和免疫荧光检测免疫血清对重组麻疹病毒MV(S191)-DENV2 NS16Xhis的识别和结合特性.结果 重组融合质粒pET22b-p64K-L-DENV2 NS1A经双酶切和测序证明构建正确.表达的重组融合蛋白相对分子质量为100000,纯化后蛋白纯度在85％以上,免疫获得的抗DENV2 NS1A兔抗血清可识别重组病毒MV(S191)-DENV2 NS16XHis表达的DENV2 NS1蛋白.结论 原核表达并纯化了DENV2 NS1A蛋白,建立了基于NS1蛋白的重组病毒MV(S191)-DENV2 NS16XHis的Western blot和免疫荧光检测方法,为登革热疫苗研制中重组病毒MV(S191)-DENV2 NS16XHis的质检奠定了基础.
