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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林耐药表型与femB基因表达水平关系研究
目的 了解金黄色葡萄球菌femB基因表达水平与其对苯唑西林不同耐药表型的关系.方法 从临床送检标本中分离71株非重复金黄色葡萄球菌,琼脂对倍稀释法测定苯唑西林的低抑菌浓度,产色头孢菌素纸片法测定菌株产β-内酰胺酶情况；将28株非产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌株按对苯唑西林的低抑菌浓度分为敏感组、低耐组、高耐组,采用实时荧光定量PCR法检测femB基因表达量,分析对苯唑西林不同耐药表型的femB表达水平与耐药表型之间的关系.结果 71株金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药率为66.20％,产β-内酰胺酶率为60.56％.甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)产β-内酰胺酶率为58.33％,高耐组产β-内酰胺酶率为63.15％,低耐组为55.56％.10株苯唑西林敏感株的femB的表达量为1.0245(0.4830,3.3636),4株苯唑西林低耐株的femB的表达量为1.3648(0.4204,3.3636),14株苯唑西林高耐株的femB的表达量为2.6888(0.0718,16.0000).苯唑西林敏感株与低水平耐药株、高水平耐药株之间femB表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 非产酶金黄色葡萄球菌对于苯唑西林耐药性与femB的表达水平无关.
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干燥综合征抗原B基因在大鼠早期心肌缺血组织中的表达及其意义
目的 探讨干燥综合征抗原B基因(SSB)在早期心肌缺血组织中的表达及其意义.方法 健康SD大鼠随机分为手术组、假手术组和正常对照组,并将手术组心肌标本按缺血区和非缺血区又分为手术缺血组和手术非缺血组,手术组和假手术组老鼠根据设定的时间段又分为0 min、15 min、30 min、60 min和120 min 5个亚组,通过实时荧光定量PCR测定每个样本的目的 基因的表达水平(mRNA),同时以大鼠β-actin 基因片段作为内参对照以消除样本误差.结果 SSB基因表达在急性心肌缺血早期呈下调趋势,缺血120 min组SSB mRNA表达降低,与0 min组及正常对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),其它组间SSB mRNA表达差异无统计学意义(P0.05).结论 SSB基因可能参与早期缺血心肌的病理生理的调节过程.
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缺氧条件下体外培养血管内皮细胞AQPl表达的变化
目的 研究缺氧对体外培养血管内皮细胞AQP1表达的影响.方法 采用脐静脉内皮细胞株,复苏传代后计数稀释,接种于6孔培养板中,细胞贴壁后分组:常氧对照组(5%CO2+95%空气),缺氧(1%O2+5%CO2+94%N2)3 h,6 h,12 h,24 h组,应用免疫细胞化学半定量检测AQP1蛋白水平的表达以及实时荧光定量-PCR法检测AQPl mRNA的表达.结果 AQPl蛋白和AQPl mRNA的表达在缺氧后呈先升高后降低的趋势.结论 缺氧在蛋白和转录水平对脐静脉内皮细胞AQP1的表达有调节作用.
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实时荧光定量PCR检测职业砷暴露人群p53基因损伤
目的 探讨云南某砒霜厂工人p53基因第5和第8外显子损伤与砷的代谢转化关系;建立实时荧光定量PCR检测人群基因特异DNA损伤的方法.方法 选择云南某砒霜厂一线工人37例(高暴露组)、管理和后勤人员16例(低暴露组)和当地近期无毒物接触人员25例(对照组)为研究对象,应用实时荧光定量PCR检测人群p53基因第5和第8外显子损伤,同时检测尿中总砷和有机砷含量,评价人群对砷的代谢转化与p53基因损伤的相关性.结果 高、低暴露组男性尿有机砷浓度分别为(1.18±0.76) mg/L、(0.32±0.28) mg/L,女性分别为0.23 mg/L、(0.53±0.30) mg/L;高、低暴露组男性尿总砷浓度分别为(0.48±0.37) mg/L、(0.08±0.05) mg/L,女性分别为0.11 mg/L、(0.30±0.24) mg/L.男性尿总砷和有机砷高暴露组均高于低暴露组(P＜0.05),对照组均低于检出值下限0.02 mg/L.p53基因第5外显子实时荧光定量PCR检测的Ct相对值,男性高暴露组高于男性对照组(P＜0.05),Ct相对值随尿中有机砷含量上升有升高趋势(rs=0.355, P=0.011);p53基因第8外显子Ct相对值,男性低暴露组高于对照组(P＜0.05),但男性高暴露组与低暴露组、对照组比较,差异均无统计学意义,Ct相对值与尿中有机砷含量无相关性.结论 职业砷暴露可能致p53基因第5和第8外显子损伤,砷的代谢转化可能在第5外显子损伤中起关键作用;实时荧光定量PCR用于检测人群基因特异DNA损伤切实可行.
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实时荧光定量PCR和RT-PCR检测宫颈癌细胞株HPV-16 E6和E7基因的实验研究
目的 探讨实时荧光定量PCR和RT-PCR检测HPV-16 E6和E7基因的实验方法.方法 将制备的含HPV-16 E6和E7基因的质粒作为标准品,建立实时荧光定量PCR和RT-PCR方法,分别对3种宫颈癌细胞株进行HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA拷贝数的定量检测.结果 建立的实时荧光定量PCR标准曲线相关系数大于0.99,PCR效率在90%以上.HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA拷贝数在宫颈癌细胞株 CaSki、SiHa和HeLa中从高到低依次是CaSki＞SiHa＞HeLa.结论 用实时荧光定量PCR和RT-PCR方法研究HPV-16 E6和E7基因的DNA和RNA含量结果可靠,为进一步研究两个基因与宫颈病变的关系奠定了基础.
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基质金属蛋白酶及其抑制物与子宫内膜异位症关系的研究
目的研究基质金属蛋白酶-2、3(MMP-2,3)、金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)蛋白及其mRNA在正常子宫内膜、子宫内膜异位症(EMS)妇女正位及异位内膜的表达.方法采用免疫组织化学法半定量分析MMP-2、MMP-3、TIMP-2在正常子宫内膜、EMS妇女正位内膜及异位内膜的表达,使用实时荧光PCR法进行MMP-2、MMP-3、TIMP-2的mRNA的定量分析.结果MMP-2、MMP-3在EMS妇女异位内膜组阳性表达高于正常对照(P＜0.05),TIMP-2在EMS妇女异位内膜组织阳性表达低于正常对照(P＜0.05),而且MMP-2、MMP-3在异位内膜标本阳性染色范围有向间质浸润的趋势.在不同的组织学周期,MMP-2、MMP-3、TIMP-2的表达情况相似,差异不具有统计学意义.EMS妇女异位内膜的MMP-2、MMP-3、TIMP-2 mRNA含量均高于正常对照(P＜0.05).在不同的组织学周期,正常妇女子宫内膜组的MMP-2 mRNA含量、EMS妇女正位内膜组的MMP-3mRNA含量的差异有统计学意义(P＜0.05).结论EMS妇女的异位内膜具有更高的侵袭性可能与异位内膜MMP-2、MMP-3的过高表达及TIMP-2的低表达有关.
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宫腔粘连子宫内膜中肿瘤坏死因子-α基因的表达及意义
目的 探讨肿瘤坏死因子-α (tumour necrosis factor,TNF-α)基因在宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)患者子宫内膜中的表达水平及其与IUA发生机制的关系.方法 提取40例不同程度IUA患者子宫内膜组织和30例育龄妇女无宫腔粘连的正常子宫内膜组织的RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测TNF-αmRNA的表达情况,结合内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)管家基因进行相对定量分析,比较IUA子宫内膜和正常子宫内膜中TNF-α mRNA表达的差异.结果 实时荧光定量PCR检测不同程度IUA患者子宫内膜组织中TNF-α mRNA的表达高于正常无粘连的子宫内膜组织(P＜0.05);不同程度IUA的子宫内膜组织间TNF-αmRNA表达差异无统计学意义.结论 TNF-α mRNA的高表达可能在IUA的发病机制中起重要作用,而在IUA的发展中TNF-α可能不是重要的影响因子.
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不同双歧杆菌标准品制备法的比较研究
目的 比较不同的双歧杆菌标准品制备法,筛选适用于实时荧光定量PCR检测的双歧杆菌标准品.方法 以双歧杆菌标准菌株作为实验菌株,分别采用菌株DNA法、PCR产物扩增纯化法、质粒DNA法制备梯度浓度标准品,运用紫外分光光度计和实时荧光定量PCR技术进行检测,并对数据进行统计学处理.结果 实时荧光定量PCR检测发现,3种不同的双歧杆菌标准品制备法的标准曲线均R2＞0.990;不同制备法的双歧杆菌标准品DNA浓度和纯度检测比较,质粒DNA制备法所制的双歧杆菌标准品浓度和纯度较另外两种方法高,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 双歧杆菌质粒DNA制备法制备的标准品质量较高,适用于实时荧光定量PCR检测,可以为双歧杆菌分子生物学检测提供参考依据.
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鸭疱疹病毒1型实时荧光定量PCR方法的建立
目的 建立检测鸭疱疹病毒1型(鸭瘟病毒)的实时荧光定量PCR方法,为快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等奠定基础.方法 根据病毒DNA聚合酶基因的序列,设计引物和探针,采用TaqMan探针技术进行实时荧光定量PCR,用含有125 bp扩增产物的pMD 18-T载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,对该方法的特异性、可重复性、敏感性进行评价,同时与传统PCR方法进行比较研究.结果 标准曲线表明在2.3×105～2.3×10拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR少可检测到23个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为1.22～6.69以及2.09～8.84,说明有较好的重复性;对非鸭瘟病毒DNA无扩增,说明有很好的特异性;在对病毒DNA的检测方面,比传统PCR的敏感性高出104倍.结论 成功建立了针对鸭瘟病毒的特异、敏感、重复性强且可准确定量的实时荧光定量PCR方法.
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人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平检测方法的建立
目的:建立实时荧光定量PCR检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平的检测方法,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础.方法:提取人肠系膜动脉组织总RNA,采用RT-PCR方法获取sGCα、sGCβ、GAPDH基因片段,与pNID-18T vector连接,并转化到大肠杆菌DH5α细胞,通过PCR和测序鉴定重组质粒.提取含目的基因的质粒作为标准品,采用SYBR Green Ⅰ法检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达和构建标准曲线.结果:人肠系膜动脉平滑肌存在sGCα和sGCβ基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与数据库公布的序列完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2>0.99.结论:建立了稳定的定量检测方法,并成功用于检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达,构建质粒标准品能用于后续实验.
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慢性心房颤动患者心房肌mink亚单位基因mRNA水平的定量检测
目的:心房颤动是目前为常见的快速性心律失常之一.mink是心肌细胞延迟整流钾通道(Iks)的重要辅助亚单位,在Iks发挥正常功能中起着重要的作用,同时参与心肌细胞其它离子通道电流的调控.本研究采用实时荧光定量PCR技术通过对房颤时mink基因mRNA水平进行定量研究,探讨mink在房颤中的作用和潜在调控机制.方法:①16例风湿性心脏病(rheumatic heart disease,RHD)患者分为2组:窦性心律组(SR组)8例、房颤心律组(AF组)8例,取其常规切除的右心耳组织作为研究对象;②提取心房肌组织总RNA,通过RT-PCR和TA克隆技术构建含有目的基因片段的质粒标准品;③以GAPDH为内参照基因,采用SYBR Green Ⅰ法实时荧光定量PCR技术检测慢性心房颤动和窦性心律息者mink基因mRNA水平.结果:①标准曲线和熔解曲线:标准曲线线性关系良好,相关系数R2>0.99.熔解曲线呈明显单峰状,退火温度与预测值基本一致;②SR组和AF组mink/GAPDH比值分别为0.1890±0.0721(n=8)和0.1413±0.0954(n=8),AF组mink基因mRNA水平低于SR组,P<0.05.结论:与窦性心律患者相比,心房颤动患者mink基因明显下调,mink基因表达量的改变可能参与房颤重构的分子基础.
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I-Aβ1基因表达与小鼠膜性肾小球肾炎
目的:探讨I-Aβ1基因与实验性小鼠膜性肾小球肾炎发病之间的相关性.方法:复制并鉴定小鼠膜性肾小球肾炎动物模型,提取实验组和对照组总RNA,实时荧光定量PCR检测I-Aβ1基因mRNA表达量.结果:模型组I-Aβ1基因mR-NA表达量明显高于N-BSA组、NS组和空白对照组(P<0.01)差异有统计学意义;N-BSA组、NS组和空白对照组彼此之间的差异无统计学意义.结论:I-Aβ1基因过量表达参与了实验性小鼠膜性肾小球肾炎发病过程,可能是通过I-Aβ1基因转录、翻译活性上调使小鼠对外源性抗原反应性增强,促进了小鼠膜性肾小球肾炎发生.
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荧光定量PCR检测子宫内膜异位症病人基质金属蛋白酶基因的方法
目的:探讨基质金属蛋白酶-2、3(matrix metalloproteinase-2、3)、金属蛋白酶组织抑制物-2(tissueinhibitor of metalloproteinase-2)TIMP-2的mRNA的定量检测方法,以及它们的检测对研究子宫内膜异位症的发生的意义.方法:使用实时荧光PCR( real-time PCR)法在正常妇女子宫内膜、子宫内膜异位症妇女正位内膜及异位内膜进行MMP-2、MMP-3、TIMP-2的mRNA的定量分析.结果:实时荧光定量PCR法可以较准确地检测出正位内膜及子宫内膜异位症妇女的宫内膜囊肿的MMP-2、MMP-3、TIMP-2 mRNA的相对含量.子宫内膜异位症妇女异位内膜的MMP-2、MMP-3、TIMP-2 mRNA含量均高于正常对照(P＜0.05).结论:实时定量PCR方法是一种较准确地检测基因含量的方法,检测MMPs、TIMPs的mRNA表达具有灵敏度高、相对定量方法简便易行的优点,可以为子宫内膜异位症的发病机制的研究、治疗方法的评估、新药的研制及筛选提供更准确的基因水平信息,有望成为临床应用的检测手段.
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人心房肌KCh1P2和SK2基因表达检测及方法研究
目的 检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础.方法 提取人心房肌组织总RNA,采用RT-PCR方法获取KChIP2、SK2、GAPDH、β-actin目的 片段,与pMD-18T vector连接成重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和测序鉴定.提取含目的 基因的质粒作为标准品.采用Taqman探针法与SYBR Green Ⅰ法分别检测人心房肌SK2与KChIP2基因表达和构建标准曲线.结果 人心房肌存在KChIP2和SK2基因表达.质粒标准品经过PCR鉴定并测序.与Pubmed数据库完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2>0.99.结论 成功检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,构建的质粒标准品能用于后续实验.
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SOCS-3在大鼠慢性肝损伤中的表达研究
目的：通过研究细胞因子信号转导抑制因子-3(Suppressor of cytokine signaling-3, SOCS-3)在慢性肝损伤中的表达,为阐明其在慢性肝损伤中的作用提供实验基础。方法采用CCL 4法构建大鼠慢性肝损伤模型,通过实时荧光定量PCR、免疫组化检测大鼠肝脏组织SOCS-3的表达。结果慢性肝损伤组SOCS-3 mRNA相对表达量及SOCS-3蛋白高于对照组,差异有统计学意义(P<0．05)。结论在慢性肝损伤中,随着肝脏损伤加重,因炎症因子持续刺激,SOCS-3表达逐渐增加,提示SOCS-3在慢性肝损伤发生发展过程中起重要作用。
关键词： 细胞因子信号转导抑制因子-3 慢性肝损伤 实时荧光定量PCR -
MMP9/TIMP-1在雷公藤甲素干预肺动脉高压动物模型中的作用
目的 观察并探讨雷公藤甲素对肺血管重构模型的影响是否与影响基质金属蛋白酶MMP9/TIMP-1有关.方法 建立大鼠左肺切除加野百合碱所致肺动脉高压模型,行雷公藤甲素连续和延迟两种治疗方案.通过心导管术测得血流动力学指标,荧光定量PCR(FS-PCR)行肺组织MMP9和TIMP-1的定量.结果 ①雷公藤甲素连续和延迟两种用药方案均能降低模型组平均肺动脉压(m PAP)和心室重量变化RV/(LV+S)%(右室与左室加室间隔比),阻止大鼠肺动脉高压的发展,且连续治疗比延迟治疗效果更好(P＜0.05).②MMP9和TIMP-1在模型组肺组织中表达均增高,在两治疗组肺组织中表达均降低(P＜0.05),但增高和降低的程度MMP9较明显.结论 雷公藤甲素能延缓大鼠左肺切除加野百合碱注射诱导的肺动脉高压和右心室肥厚,影响MMP/TIMP-1的平衡可能起了重要作用.
关键词： 肺动脉高压 雷公藤甲素 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶抑制剂 实时荧光定量PCR -
UVB诱导人皮肤成纤维细胞改变后β-catenin基因表达水平的研究
目的 研究经过不同剂量紫外线中波(UVB)照射正常人皮肤成纤维细胞(HSF)不同时间后β-链蛋白(βcatenin)基因的表达改变,探讨UVB诱导HSF衰老可能的机制.方法 未经UVB照射的HSF为对照组;经过不同剂量(100、200、300) mJ/cm2 UVB处理不同时间(1、2、3)天后的HSF为实验组.实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)检测实验组和对照组中β-catenin基因的表达;四唑盐比色法(MTT)观察HSF的生长活性改变,流式细胞仪检测HSF的凋亡率变化.结果 UVB照射对HSF细胞的生长有明显抑制作用,并且随着UVB照射时间延长和剂量的增加,HSF细胞生长率逐渐下降;UVB处理后实验组中β-catenin基因的相对表达水平明显低于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05);β-catenin基因的表达水平随着UVB作用的时间和剂量的不同而变化,存在较为明显的时间依赖性和剂量依赖性.结论 经过UVB处理的HSF细胞中调控皮肤衰老的基因β-catenin表达明显降低,大剂量长时间UVB照射可诱导HSF发生衰老改变.
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实时荧光定量PCR HBV-DNA检测系统性能验证方法的探讨
目的 探讨实时荧光定量PCR HBV-DNA检测系统的性能验证方法.方法 根据中国合格评定国家认可委员会(CNAS)有关要求,并参照美国国家临床实验室标准化协会(CLSI)相关EP文件,对本实验室HBV-DNA检测系统的性能验证方法进行试验设计,采用实时荧光定量PCR方法对临床血清标本进行检测.结果 低、高两个浓度水平的重复性精密度(CV批内)分别为1.47％、0.79％,中间精密度(CV批间)分别为2.09％、0.995％.标准定值血清测量值的对数与认定值偏差均≤±0.4.线性范围验证的回归方程为y=1.005x-0.2633,R2=0.9991(P＜ 0.01),范围为(1× 102～5×109)IU/ml.检测下限为100 IU/ml.结论 本实验室HBV-DNA检测系统性能符合要求,设计的性能验证方法可行性好,可为建立有关系统性能验证的标准化操作规程(SOP)提供参考依据.
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血浆循环microRNA-126在非小细胞肺癌诊断中的应用
目的 探讨血浆循环microRNA - 126浓度与非小细胞肺癌(NSCLC)的相关性及其诊断价值.方法 采用实时荧光定量PCR方法检测130例NSCLC患者和作为对照的170例健康人的血浆循环microRNA - 126浓度.结果 对照组血浆循环microRNA - 126浓度显著高于NSCLC组(P＜0.01).血浆循环microRNA - 126浓度ROC曲线下面积(area under the ROC curve,AUC)为0.758,95%CI为0.704~0.811(P＜0.01).当血浆microRNA - 126浓度为1051 fmol/L时,血浆microRNA - 126对NSCLC诊断的特异度为90.0%,灵敏度为46.4%.其浓度与患者的年龄、性别、吸烟,病理分型和分期均无显著的相关性(P＞0.05).结论 血浆循环microRNA - 126浓度对NSCLC有一定的临床诊断意义,联合其他血浆microRNA或肿瘤标志物,如神经元特异性烯醇化酶、癌胚抗原和细胞角蛋白片段21 - 1,可以弥补单一检测的局限性,以提高肺癌的阳性检出率,为临床提供可靠的依据.
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PreS1Ag、HBeAg和HBV-DNA的对比检测与分析
目的:通过对比检测和分析739份血清中preS1蛋白、HBeAg和HBV-DNA的检测阳性率,为临床正确选用实验室指标防治乙型肝炎提供依据.方法:应用ELISA法对739份血清进行PreS1Ag和HBV血清标志物检测,并与实时荧光定量PCR检测HBV-DNA结果进行比较.结果:所有739份血清中,PreS1Ag阳性率为34.6%(256/739),HBeAg阳性率为30.7%(227/739),HBV-DNA阳性率为58.9%(435/739).227份HBeAg阳性血清中,PreS1Ag阳性率55.9%(127/227),HBV-DNA阳性率96.0%(218/227);512份HBeAg阴性血清中,PreS1Ag阳性率25.2%(129/512),HBV-DNA阳性率为42.4%(217/512).HBeAg、HBV-DNA和PrES1的阳性率有显著差异(P＜0.05),阳性率高低依次为HBV-DNA＞PreS1＞HBeAg;HBeAg阳性血清中PreS1Ag(55.9%)阳性率显著高于HBeAg阴性血清PreS1Ag(25.2%)阳性率(χ2=33.5,P＜0.01);HBV-DNA阳性血清的PreS1Ag检出率58.9%(256/435)显著高于HBV-DNA阴性血清的PreS1Ag检出率18.4%(56/304)(P＜0.01);PreS1抗原与HBV-DNA阳性符合率为(200/256)78.1%,阴性符合率为(248/483)51.3%.598份HBsAg阳性血清(阳性率为80.9%,598/739)中HBeAg、PreS1和HBV-DNA阳性数(率)分别是224(37.5%)、253(42.3%)、417(69.7%).结论:PreS1Ag、HBV-DNA、HBeAg的阳性率有显著性差异(P＜0.05).作为HBV感染和复制的指标,以检测HBV-DNA为可靠,而PreS1Ag可能较HBeAg更敏感.在HBV感染的不同时期,如何理解和使用上述指标对防治乙型肝炎有重要意义.
