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黄病毒的感染性克隆和嵌合突变体
感染性克隆技术已广泛应用于深入阐明黄病毒致病机理、构建病毒载体等研究领域,其中利用感染性克隆构建嵌合突变体是黄病毒疫苗研究中很有希望的新途径.本文就该研究的新进展作一简要综述.
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过氧化物酶体增殖物活化受体γ短发夹状核糖核酸抗肝癌增殖
过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferators activated receptor γ,PPARγ)在肝癌中过表达或处于较高的活性状态[1].RNA干扰能高效阻断目的基因表达,可作用于肿瘤发生、发展过程中基因异常高表达的环节[2].本研究构建靶向PPARγ基因的短发夹状RNA干扰表达载体(pshPPARγ),转染HCCLM3细胞,挑选阳性克隆构建裸鼠肝癌模型,观察PPARγ基因静默对肝癌生长的影响.
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构建逆转录病毒pQCXIH-HA-FBXL11表达质粒及稳定转染细胞
目的:构建pQCXIH-HA-FBXL11逆转录病毒表达质粒,鉴定表达,在牙髓间充质干细胞建立过表达FBXL11的稳定转染细胞.方法:以牙髓干细胞的cDNA为模板,利用PCR方法扩增目的基因FBXL11,PCR产物纯化回收、连接、酶切、测序鉴定,构建pQCXIH-HA-FBXL11质粒.利用FuGENE6转染293T细胞,蛋白质免疫印迹法和实时荧光定量PCR法在蛋白及mRNA水平检测HA-FBXL11的表达.利用逆转录病毒感染牙髓间充质干细胞.结果:成功构建了逆转录病毒表达质粒pQCXIH-HA-FBXL11,蛋白及mRNA水平检测证实其在293T细胞可以有效的表达.成功建立了过表达HA-FBXL11的牙髓间充质干细胞稳定转染细胞.结论:通过构建pQCXIH-HA-FBXL11表达质粒及在牙髓间充质干细胞建立过表达FBXL11稳定转染细胞,为进一步研究FBXL11对间充质干细胞的功能调控奠定了基础.
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细胞角蛋白19基因的克隆构建与重组表达
目的:构建肿瘤标志物细胞角蛋白19(CK19)基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,以获取低成本、高产量、高纯度的CK19蛋白.方法:根据基因库CK19的基因序列,设计多条用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技术扩增CK19基因,用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET28a中,PCR和DNA测序鉴定.将重组质粒CK19-pET28a转化大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,使用镍柱亲和层析纯化蛋白,并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定.结果:成功扩增出CK19基因片段,克隆到表达载体后经菌落PCR和DNA测序鉴定正确.重组质粒CK19-pET28a在大肠埃希菌中经诱导和纯化后获得纯度较高目的条带,蛋白质印迹结果证明目的蛋白有反应性.结论:成功构建了肿瘤标志物CK19原核表达载体,经过诱导表达和蛋白纯化获得了高纯度有活性的目的蛋白.
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PENK基因过表达克隆载体构建及其功能意义
目的 构建人前脑啡肽(homo sapiens proenkephalin,PENK)基因过表达克隆载体,研究其功能意义.方法 用HIV载体质粒与PENK基因连接,构建成功后用双酶切及测序验证PENK克隆重组体的成功构建.用293Ta包装慢病毒后转染HT1080以测定慢病毒滴度.用PENK-HIV慢病毒颗粒转染PC12细胞,同步设立对照组(未转染PENK),对两组细胞转染后48 h采集图片并经行细胞计数,收集细胞,用RT-PCR检测各组中PENK mRNA表达变化.结果 PENK克隆载体酶切及测序结果都验证了克隆构建成功.PENK-HIV慢病毒成功转染PC12细胞48 h后,对照组细胞数为88.60±2.55,而PENK转染组细胞数为127.93±2.48,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 用HIV载体质粒成功构建的PENK克隆重组体可能会促进PC12细胞的生长.
