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复制型埃博拉病毒样颗粒的表达和鉴定
为了研究埃博拉病毒的生物学特性及其与宿主的相互作用,构建无致病基因的复制型埃博拉病毒样颗粒(Transcription and replication competent virus-like particles,trVLPs)成为在BSL-2实验室中进行研究的理想途径.本研究目的是表达和鉴定复制型埃博拉病毒样颗粒(trVLPs).本研究利用埃博拉病毒7个蛋白的基因组片段(VP40、VP24、GP、VP35、VP30、L、NP)和一个报告基因片段重组构建了表达质粒,瞬时转染293T细胞,通过荧光素酶检测系统测定报告基因的表达活性确定了复制型埃博拉病毒样颗粒(trVLPs)的成功表达.进一步通过超离转染细胞的上清纯化得到病毒样颗粒(trVLPs),在透射电子显微镜下观察到了典型的丝状结构.对病毒样颗粒进行荧光标记并感染Vero细胞,在荧光显微镜下观察到细胞中出现点状和丝状的荧光信号.复制型埃博拉病毒样颗粒的成功表达为进一步研究埃博拉病毒的生物学特性以及与宿主相互作用机制提供了基础.
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扎伊尔型埃博拉重组糖蛋白GP-Fc基因疫苗构建及免疫原性研究
本实验将基于埃博拉病毒表面糖蛋白抗原GP基因序列,按照哺乳动物密码子使用频率优化,并与人IgG恒定区构建融合蛋白GP-Fc基因序列,重组蛋白序列插入基因疫苗载体pVR中,构建重组蛋白基因疫苗pVR-modGP-Fc.通过基因疫苗导入系统免疫小鼠,用间接ELISA和间接免疫荧光对抗体效价进行评估.实验结果显示,重组蛋白GP-Fc的基因疫苗可以很好的刺激小鼠产生特异性抗体,免疫周期结束后,小鼠血清中结合效价终点达到高剂量组1∶300 000及低剂量组1∶180 000,同时血清中的抗体可以很好地结合表达GP抗原的细胞表面,表现出很强的荧光信号.通过该研究我们验证重组蛋白基因疫苗pVR-modGP-Fc可以很好地诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的抗原特异性IgG,具有较好的免疫原性.
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中塞友好生物安全实验室埃博拉病毒核酸检测质量控制体系的建立
详细地阐述了中塞友好生物安全实验室实施埃博拉病毒核酸检测整个质量控制的过程,全面地展示固定P3实验室第一批检测队在埃博拉病毒病实验室检测中表现出的科学、严谨、准确与高效,为实验室检测工作提供参考和依据.首先描述了质控体系要点,包括了组织和人员管理、质量管理文件体系、仪器设备、检测试剂和耗材、审核、实验室空间和功能、实验室维护与安全保障等各个方面的质控要点.其次,从埃博拉病毒核酸检测前、检测中到检测后过程,分述了质控在埃博拉病毒检测整个流程的各个环节中的应用.技术精良的专业检测队伍和实行人性化管理是援非抗埃成功的基石;做好生物安全防护是有效质控和完成检测任务的前提;配备专业的后勤保障确实非常必要;中塞友好生物安全实验室的建立对于中塞友谊具有划时代的意义,该实验室将成为塞拉利昂今后为重要的埃博拉病毒实验室检测基地.
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埃博拉病毒重组膜蛋白Gp-Fc表达及免疫原性研究
本研究利用HEK293F细胞表达了埃博拉病毒重组膜蛋白,并通过免疫小鼠初步研究了其免疫原性.按照人密码子使用频度优化编码埃博拉病毒膜蛋白胞外区基因,合成后将其插入到真核表达载体pXG-Fc中,构建埃博拉病毒糖蛋白和人IgG Fc片段融合蛋白表达质粒pXG-modGP-Fc.利用瞬时转染技术,将融合蛋白表达质粒转染到高密度培养的悬浮HEK293F细胞中,实现了分泌表达.通过Protein A亲和层析,得到了纯化的重组蛋白.将纯化的融合蛋白免疫小鼠,并通过间接ELISA对小鼠抗体效价进行评价.蛋白纯化及分析结果表明,本研究构建的真核表达系统能够有效表达埃博拉重组蛋白GP-Fe,细胞培养上清中重组蛋白以二聚体形式存在.通过间接ELISA分析,纯化的重组蛋白免疫实验动物后,可以在血清中检出高滴度的抗原特异性IgG,显示该重组蛋白具有良好的免疫原性.通过该研究,我们得到了具有良好免疫原性的重组蛋白,同时,该工作为研制基于重组蛋白的埃博拉疫苗以及筛选单克隆抗体打下基础.
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埃博拉病毒包膜蛋白GP基因DNA疫苗诱导小鼠产生高滴度中和抗体
目的 探讨埃扎伊尔-埃博拉病毒(Zaire Ebolavirus)包膜蛋白(GP)DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的特性及研制埃博拉病毒DNA疫苗的可行性.方法 构建埃博拉病毒包膜蛋白GP真核表达质粒Peak13CD5LGP,采用100μg剂量的质粒免疫小鼠,以纯化的埃博拉病毒包膜蛋白亚单位融合蛋白(GP1-Fc)作为抗原,通过ELISA检测及Western blot验证测定血清抗体滴度及特异性.结果 100μg质粒免疫小鼠3次后,小鼠血清中GP中和抗体滴度达到1:2 000.结论 编码埃博拉病毒包膜蛋白GP的DNA疫苗(pEAK13CD5LGP)能够诱导小鼠产生高滴度和持久的中和抗体,作为埃博拉病毒疫苗具有潜在的应用价值.
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埃博拉病毒VP40蛋白的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 以埃博拉病毒(EBOV) VP40基因原核表达产物为抗原建立检测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法. 方法 在分析EBOV VP40基因稀有密码子(大肠埃希菌系统)的基础上去除5 '和3'端稀有密码子,合成VP40基因,构建VP40蛋白原核表达载体pET22b-VP40,并转化至BL21 (DE3)菌,在1.0 mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.以纯化蛋白为抗原,建立检测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法. 结果 成功构建重组质粒pET22b(+)-VP40,表达的VP40蛋白经SDS-PAGE鉴定分子质量单位为40 ku,与预期值相符；Western blot检测证实VP40重组蛋白能被抗VP40单克隆抗体识别.以该蛋白为包被抗原建立监测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法,其敏感性和特异性均为100％. 结论 成功构建了pET22b(+)-VP的重组质粒,并诱导表达VP40蛋白.该蛋白具有免疫反应性,以该蛋白为抗原建立的ELISA方法具有较高的特异性和稳定性,可用于埃博拉出血热的诊断和流行病学调查.
关键词： 埃博拉病毒 原核表达 VP40蛋白 Western blot 间接ELISA -
埃博拉病毒检测与分型Real-time PCR方法的建立
目的 建立一种致死性埃博拉病毒(EBOV)的快速检测与分型方法. 方法 根据苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因的保守区序列,设计一对通用引物及特异性TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释质粒pblue-SG,pblue-ZG为标准品,进行Real-time PCR扩增,制作标准曲线,并进行重复性、准确性检验及特异性检测. 结果 Real-time PCR检测苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒标准曲线相关系数均大于0.99,灵敏度可达1.0×101拷贝,高于常规PCR方法的106～107；7种其他对照烈性病病原体检测均呈阴性. 结论 用建立的Real time PCR方法检测埃博拉病毒快速、灵敏、特异,重复性好,为埃博拉出血热的快速确诊奠定了基础.
关键词： 埃博拉病毒 Real-time PCR TaqMan探针 检测方法 -
埃博拉疫苗研究新进展
埃博拉病毒是一种高致病性病原体,致死率高达90％.目前尚未有批准的疫苗用于其暴露前后的预防.近年来一些自然感染的埃博拉病例数增加,且埃博拉病毒被视为生物战剂,对公共安全构成威胁,因此研究埃博拉疫苗具有十分重要的意义.近年来埃博拉疫苗研究取得了明显的进步,一些候选疫苗证实可以保护非人灵长类动物.这些疫苗包括复制缺陷型腺病毒载体、可复制VSV、HPIV-3载体疫苗,以及病毒样颗粒疫苗.由于暴露后免疫十分重要,尤其是用于自然偶发感染,保护实验室相关人员,以及应对生物攻击.因此,当前的研究主要集中在高效的暴露后疫苗,特别是一次注射即可完全保护的疫苗.
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埃博拉病毒进入抑制剂筛选模型的建立与应用
目的：旨在以埃博拉病毒（EBOV）包膜糖蛋白（GP）为靶点，建立埃博拉病毒进入抑制剂高通量筛选模型，应用该模型筛选具有特异性抑制埃博拉病毒进入的活性样品。方法利用细胞水平重组病毒技术，分别用两株不同爆发时间的 Zaire-EBOV的 GP与 HIV核心质粒（pNL4-3.Luc）共表达，制备重组病毒 EBOV-GP-Old/HIV-luc和 EBOV-GP-New/HIV-luc。利用 ELISA和荧光素酶检测技术，优化病毒产量、感染性、感染剂量及荧光活性测定时间等因素，建立药物筛选模型。利用统计学参数及阳性化合物评估该模型的稳定性和灵敏性。应用该模型，对242个样品进行初步筛选，并通过与水泡性口膜炎病毒包膜蛋白包装的重组病毒 VSVG/HIV-luc进行比较，以判断样品的特异性。结果该模型可用于靶向 GP蛋白的埃博拉病毒进入抑制剂的高通量筛选，并获得4种具有特异性抗埃博拉进入活性的样品。结论该模型可用于抗 EBOV进入药物的高通量筛选，应用该模型获得的阳性样品有助于抗 EBOV药物的发现。
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4株埃博拉病毒核蛋白特异性单克隆抗体抗原结合表位研究
目的 分析鼠埃博拉病毒核蛋白(NP)特异性单克隆抗体抗原结合表位,了解其免疫学特性.方法 经生物信息学分析后,将NP分段重组表达,并分别以之为抗原,通过免疫印迹和竞争ELISA的方法对4株埃博拉病毒核蛋白特异性单抗的抗原结合表位进行分析.结果 经生物信息学表位分析后将埃博拉病毒全长核蛋白分为rNP1-418,rNP419-639和rNP640-739三段进行重组制备,免疫印迹法分析表明4株鼠单抗均识别线性表位,结合位点位于C端100 aa.通过对C端100 aa即rNP640-739 N端连续截短20 aa的方法进行鉴定,4株鼠单抗抗原表位位于埃博拉核蛋白C末端20 aa,但其中2株单抗无明显竞争.结论 明确了具有不同结合位点的埃博拉核蛋白特异性单抗,为免疫学快速检测试剂的研究奠定基础.
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TRIzol(或TriPure)试剂结合QIAamp Viral RNA Mini试剂盒用于血标本中病毒RNA提取的研究
目的 建立一种安全、简便、可靠的适用于血标本中有包膜RNA病毒核酸提取的方法,保证埃博拉病毒核酸筛查的实验室安全,提高标本的核酸检测效率.方法 根据已发表可完全灭活埃博拉病毒的方法,通过实时荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)方法,比较分析QIAamp Viral RNA Mini试剂盒、TRIzol(或TriPure)试剂裂解样本并用或不用氯仿萃取后结合QIAamp Viral RNA Mini试剂盒等3种方法提取核酸的效率,优化反应步骤,建立一种安全、简便的血标本中病毒RNA提取方法.结果 血标本经TRIzol(或TriPure)试剂处理后,不经氯仿萃取,与QIAamp Viral RNA Mini试剂盒结合,提取病毒RNA,RNA提取效率优于QIAamp Viral RNA Mini试剂盒和美国CDC推荐的方法.结论 采用TRIzol(或TriPure)试剂裂解病毒,结合QIAamp Viral RNAMini试剂盒提取病毒RNA的方法简便、可靠,可用于埃博拉出血热相关标本的核酸检测.
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埃博拉病毒及治疗药物和疫苗的研究进展
埃博拉出血热是由埃博拉病毒（EBOV）引起的一种急性传染病，病死率高达90%。由于埃博拉病毒高传染率和高死亡率，严重危害公共卫生安全，被世界卫生组织定义为高生物安全威胁病毒；但迄今尚未找到高效的应对措施和有效的治疗手段。针对埃博拉病毒的疫苗和药物正在加紧研发，并有部分已经进入临床试验，如治疗性药物 ZMapp、BCX-4430、GS-5734和 DNA 疫苗、腺病毒载体疫苗等。2014年底，美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）宣布其研发的一种疫苗已成功通过临床试验，而我国首个抗埃博拉病毒药物亦已获批，但仅限于紧急情况下使用。本文重点对 EBOV 的治疗性药物和疫苗的研究进展进行综述。
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埃博拉病毒病的研究进展
埃博拉病毒病（Ebola virus disease，EVD），既往称为埃博拉出血热（Ebola haemorrhagic fever，EHF），是由埃博拉病毒感染引起的一种致死性极高的严重传染病，平均病死率为50％，以往疫情出现的病死率为45％～90％［1］。2014年3月暴发的西非埃博拉疫情，是自1976年首次发现埃博拉病毒以来严重的一次疫情［2］。截止到2014年12月3日，全球共报告确诊、可能和疑似埃博拉病毒感染者17145例，死亡6070例，暴发疫情的国家主要集中在西非的几内亚、利比里亚和塞拉利昂，此外，马里、塞内加尔、尼日利亚、美国、西班牙等国家也有少数病例发生。此次疫情的显著特点之一是医务人员感染严重，其中仅几内亚、利比里亚、塞拉利昂就有605名医务人员感染，死亡339人，病死率为56％，这对本来即缺少医疗设施和药品的西非国家控制疫情极为不利。至2014年12月，利比里亚疫情呈稳定或有下降趋势，几内亚疫情轻度上升，而塞拉利昂疫情仍在快速增加，EVD的防治形势不容乐观［3］。
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解放军援塞医疗队护理人员自身防护的组织管理及效果
目的：探讨援塞护理人员实施自身防护的组织管理方法及效果，为其他到非洲执行抗击“埃博拉”任务的护理同仁提供参考。方法对医疗队护理人员强化安全防护意识，规范防护流程，建立完善的规章制度，加强身心保健。结果本医疗队共收治留观埃博拉出血热患者274例，其中确诊145例，护理人员无一例感染，为战胜“埃博拉”提供了重要保障。结论科学、有效的组织管理，是收治埃博拉出血热患者期间护理人员预防感染的关键。
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对塞拉利昂埃博拉留观中心护理人员进行防护培训的效果
目的：探讨对塞拉利昂埃博拉留观中心护理人员采取防护培训的效果。方法对埃博拉留观中心的塞方护理人员47名进行防护培训，于培训前后采用问卷进行调查，并分析其结果。结果培训前，塞方护士埃博拉知识的合格率为17．0％、穿脱防护服合格率为4．2％、自我防护知识合格率为12．7％；培训后，分别为70．2％，100．0％，87．2％，培训前后差异有统计学意义（χ2值分别为27．036，86．327，52．128；P＜0．05）。结论防护培训前，塞方护理人员埃博拉知识掌握、穿脱防护服、自我防护基础较差；防护培训后，护理人员的疾病知识掌握、防护服的穿脱以及自我防护技能有了较高的提升，防护措施实施效果良好。
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护理埃博拉出血热患者医务人员的防护措施
埃博拉出血热是病死率极高的急性出血性传染病，如何科学防护，保证临床一线的医务人员自身安全是我们面临的巨大问题。笔者通过近2个月在塞拉利昂抗击埃博拉的亲身实践，总结出一套自身的防护措施：严格遵循穿脱防护用品的基本原则和流程；预防和处理多层防护引起的不适症状；生活规律、饮食合理，增强自身抵抗力；适度紧张，保持良好心态等，可有效避免医务人员感染埃博拉。
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埃博拉出血热患者负性心理体验的质性研究
目的：了解埃博拉出血热（ EHF）患者的负性心理体验，为护理人员制定针对性的心理干预措施提供依据。方法目的性抽样选择20例EHF患者，采用现象学研究方法对患者进行深入访谈，运用Colaizzi 7步分析法和合众法进行资料分析。结果 EHF患者主要有恐惧和焦虑、孤独、自卑、愤怒、悲观和绝望、否认等负性心理体验。结论护理人员应根据EHF患者的负性心理体验及表现提供有针对性的心理护理措施，以改善患者的心理状态，促进疾病的康复。
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对塞拉利昂埃博拉相关人员实施健康教育的方法及效果
目的：探讨对塞拉利昂护理人员、保洁人员和患者进行健康教育的效果，以降低其感染风险。方法将316名塞拉利昂籍人员根据护士、保洁人员和患者等群体的不同进行传染病和埃博拉出血热背景知识分析和分类，针对不同群体人员的特点设计健康教育方案并实施，并对健康教育效果进行评价。结果医疗队于2014年10月1日—11月4日在塞拉利昂共工作36 d，期间所有工作人员和患者未发生院内交叉感染。经过健康教育，塞方护士、保洁人员和留观患者无论对疾病认识还是防护装置使用等掌握情况均得以提高，差异有统计学意义（P＜0．01）。结论健康教育的实施提高了护理人员、保洁人员及留观患者的防护知识，保证了相关工作人员的健康，为避免院内感染的发生发挥重要作用。
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抗击埃博拉疫情一线医务人员心理健康水平与特质应对方式的相关性分析
目的：调查在塞拉利昂执行抗击埃博拉疫情的医务人员的心理健康水平与特质应对方式情况，并分析两者关系。方法于2014年10月在塞拉利昂中塞友谊医院，选择中国和塞拉利昂医务人员共44名，用自制一般资料问卷、汉密尔顿焦虑量表（ HAMA）及特质应对方式问卷（ TCSQ）进行心理健康水平和应对方式调查。结果抗击埃博拉一线医务人员的HAMA得分为（19．45±12．46）分，其中有焦虑症状者占81．82％（36／44）。其应对方式中积极应对方式（ PC）得分为（32．03±7．26）分，消极应对方式（NC）得分为（25．02±3．67）分，与全国常模TCSQ评分比较，积极应对方式差异无统计学意义（t＝1．328，P＞0．05），消极应对方式差异有统计学意义（t＝3．360，P＜0．05）。抗击埃博拉一线医务人员的HAMA得分与NC呈正相关（r＝0．532，P＜0．05），与PC呈负相关（r＝－0．493，P＜0．05）。结论参加抗击埃博拉疫情的医务人员存在不同程度的心理健康问题，尤其具有消极应对倾向者为甚。一线医务人员应进行系统的相关培训和心理干预，以提高心理健康水平。
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情景模拟培训在塞拉利昂医院保洁人员埃博拉出血热防控中的应用
目的：探讨情景模拟培训法对塞拉利昂医院保洁人员防控技能培训的效果。方法对塞方40名保洁人员进行情景模拟演练培训，即针对需解决的防控问题进行情景设计、演练、培训，后按评价和考核标准进行考核。结果经过培训后40名塞方保洁人员在焦虑、紧张、害怕、失眠、抑郁等方面均有减轻，培训前后比较差异均有统计学意义（χ2值分别为16．2，39．7，34．3，15．9，5．2；P＜0．05）。培训前40名保洁人员对环境布局改造满意者7名，培训后工作满意度提高，对环境布局改造满意者39名，培训前后比较差异有统计学意义（χ2＝52．4，P＜0．01）；培训后40名保洁人员对培训效果和培训内容满意度均达100％；考试得分高98分，低68分，合格39人；工作状态良好，未发生院内感染的不良事件。结论分步骤、全流程情景模拟培训是提高保洁人员防控知识和技能的有效途径。
