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059 大气颗粒物诱发哮喘的免疫调控机制研究进展
大气颗粒物与呼吸系统疾病、心血管系统疾病及肿瘤等密切相关.其中,哮喘因其影响的广泛性和病因的复杂性逐渐成为研究的热点.DC、Th2和Treg 3种细胞在哮喘的免疫应答调控中起着重要作用,但是大气颗粒物诱发哮喘的过程中,DC、Th2和Treg及相关效应分子等的免疫应答机制尚不清楚.本文综述了大气颗粒物诱发哮喘的研究进展,并探讨了其可能的免疫调控机制.
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肺癌抑制免疫功能的靶细胞:树突状细胞
目的:了解肿瘤微环境下肺癌细胞对DC前体细胞产生DC、功能的影响.方法:DC前体细胞为健康人外周血CD14细胞,加入GM-CSF和IL-4,37℃,5%C02培养7-10天收获,肿瘤细胞株CRL-5815、CRL-5826加入DC前体细胞共培养,健康人外周血为正常对照.FITC或PE交链的单克隆抗体标记DC细胞,流式细胞仪分析检测CD14、CD86、CD80、CD1a阳性表达.Annexin V方法,流式细胞仪分析细胞凋亡.混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC刺激T细胞反应的能力.结果:肺癌细胞株可诱导DC形成的不同时期产生凋亡,对DC产生的早期(第1、2天)影响较晚期(第6、7天)更明显.肺癌细胞株CRL-5815和CRL-5826与DC共培养时明显抑制DC细胞表型CD80、CD86、CD83、CD40的表达,与肺癌细胞株共培养DC其刺激T细胞扩增的能力(MLR)显著下降.结论:肺癌细胞株CRL-5815和CRL-5826与DC前体细胞共培养时可导致DC的凋亡显著增加,同时DC细胞表面表型表达下降,刺激T细胞扩增的功能减低.提示肿瘤(肺癌细胞)可通过DC细胞数量减少和功能下降影响机体免疫功能.
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含EBV-LMP2基因重组腺病毒修饰的树突状细胞疫苗体内外特异性抗瘤作用的研究
鼻咽癌(NPC)在东南亚地区,尤其在我国南方地区发病率高达40/10万～60/10万.Epstein-Barr virus(EBV)在鼻咽癌的病因学中有着十分重要的作用,在肿瘤细胞中该病毒的存在为以CTL为基础的免疫治疗提供了一个潜在靶位.
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人FL在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化和生物学活性测定
建立人FL(human flt3 ligand, hFL)在大肠杆菌中的高效表达系统,分离纯化重组hFL为其功能和应用研究打下基础.根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成hFL基因膜外区DNA片段,由PCR方法获得的hFL基因膜外区DNA片段,经测序证明序列正确.构建表达载体pET30a-Trx-hFL并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,hFL融合蛋白的表达占菌体总蛋白的60%以上,并以包涵体形式存在.融合蛋白经离子交换层析、分子筛层析纯化,并用FXa切割,切割效率＞80%.切割产物经亲和层析纯化.纯化产物进行Western blot鉴定.纯化的rhFL(recombinant hFL)与GM-CSF及TNFα联合作用,具有良好的刺激DC增殖活性,其增殖能力是GM-CSF+TNFα的2.5倍左右.本文以大肠杆菌为宿主,成功地表达了融合蛋白Trx-hFL.经纯化的rhFL在体外与GM-CSF及TNFα联合使用能有效地刺激人DC的增殖.
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过继转移日本血吸虫感染鼠DC调控IL-13抑制过敏性哮喘黏液分泌的机制研究
目的 探讨过继转移日本血吸虫感染鼠DC对IL-13细胞因子调控抑制过敏性哮喘黏液分泌的作用机制.方法 采用MACS磁珠分选方法从日本血吸虫(SJ)感染小鼠及健康对照小鼠脾脏中提取DC,分别过继转移给BALB/c小鼠,并用OVA诱发哮喘.4周后处死小鼠,提取肺组织总RNA并制作病理切片,采取qRT-PCR和PAS染色方法等检测IL-13 mRNA以及蛋白水平.建立DC与CD4+T细胞共培养体系,检测IL-13的表达情况. 结果 肺组织病理学检查显示,与OVA单纯哮喘组比较,过继转移SJ感染DC组(SJ+OVA)过敏性哮喘被抑制.qRT-PCR显示,过继转移SJ感染DC组IL-13 mRNA表达受到抑制.PAS染色显示SJ感染DC组黏液分泌减少,免疫组化检查该组IL-13的表达量降低.DC与CD4+T细胞共培养结果显示SEA处理DC能抑制CD4+T细胞IL-13的表达. 结论 过继转移日本血吸虫感染鼠DC通过下调CD4+T细胞中IL-13细胞因子的释放而抑制过敏性哮喘的黏液分泌.
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含EBV-LMP2基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导CTL应答的初步探讨
目的构建包含EBV-LMP2基因的重组腺病毒疫苗并探讨它在体内外的免疫性质. 方法采用pAdeasy-1系统构建包含EBV-LMP2基因的重组腺病毒疫苗,并用IFA、PCR和TCID50等方法对其特异性进行鉴定.通过重组腺病毒感染人树突状细胞(DC),在体外活化自体T细胞;以及通过重组腺病毒感染小鼠淋巴细胞,皮下免疫同种小鼠,体内活化CTL评价其免疫效果. 结果通过PCR以及间接免疫荧光试验分别证实了病毒目的基因LMP2的存在以及蛋白在293细胞中的表达.采用TCID50方法,测定第6代的病毒滴度为2×108.体内外的免疫实验结果显示通过这两种方式均可以有效地引发针对EBV-LMP2的CTL反应. 结论包含EBV-LMP2基因的重组腺病毒疫苗可以在体内外有效地引发CTL应答,这些资料为下一步临床应用含LMP2的重组腺病毒作为疫苗治疗和预防EBV相关肿瘤奠定了基础.
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VEGF nm23及树突状细胞表达与乳腺癌预后的相关性研究
目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)、nm23和树突状细胞(DC)在乳腺癌组织中的表达及临床意义.方法应用免疫组化方法,检测60例乳腺癌组织中VEGF、nm23和DC的表达情况,并分析其临床意义.结果 VEGF表达依乳腺癌临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的顺序而明显上升(P＜0.05),同时与乳腺癌有无淋巴结转移密切相关(P＜0.05).VEGF阴性表达组5、10年生存率明显高于阳性表达组(P＜0.05).VEGF阴性表达组nm23和DC表达明显高于阳性表达组(P＜0.05).结论 VEGF可作为估计乳腺癌预后、指导制定合理治疗方案的指标.nm23、DC可与VEGF互补,作为判断乳腺癌恶性程度、转移及预后的参与指标.
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DC联合CIK治疗非小细胞肺癌疗效观察
目的 探讨自体肿瘤抗原负载的树突状细胞(DC)联合自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)治疗非小细胞肺癌的疗效.方法 将我院2008 年5 月至2010 年7 月收治的64 例非小细胞肺癌患者分为治疗组和对照组,每组32例,对照组单纯采用自体CIK 细胞治疗,治疗组在对照组的基础上采用DC 疫苗治疗,两组均以21d 为1 个疗程,比较两组患者的治疗效果.结果 治疗组CR 者9 例,PR 者14 例,疗效为71.9%显著高于对照组的56.3%,P<0.05.结论 DC 联合CIK 治疗非小细胞肺癌可显著提高疗效,值得推广.
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树突状细胞的补体攻膜复合物C5b-9模型的建立
目的 建立树突状细胞(DC)的补体攻膜复合物C5b-9模型,为研究补体攻膜复合物对DC的影响奠定基础.方法 诱导人外周血单核细胞分化成为不成熟DC,C5b-9体外组装,激光共聚焦检测C5b-9在DC表面组装情况.结果 成功诱导出不成熟DC,激光共聚焦显示C5b-9完整组装于DC表面.结论 本研究成功建立了DC的补体攻膜复合物C5b-9模型,为将来进一步探讨C5b-9对DC的功能影响奠定了基础.
关键词： DC 补体攻膜复合物C5b-9 激光共聚焦 -
DC-CIK与CIK体外培养对包含HBV基因的HepAD38细胞的杀伤效果研究
目的:研究乙型肝炎病毒抗原致敏的树突状细胞(DC)和CIK细胞共同培养后对HepAD38细胞(含整合HBV基因组)的杀伤作用.方法:从乙肝患者外周血中提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),平均分为两组,研究组培养DC,培养DC第5天加入乙肝抗原并收获DC,然后加入CIK细胞,培养出DC-CIK细胞;对照组单独培养CIK细胞.两组在培养15 d后分别收获DC-CIK细胞与CIK细胞,同时作为效应细胞,把含有乙肝病毒的HepAD38细胞作为靶细胞,分别在5:1、10:1的效靶比时进行杀伤试验,使用LDH释放法测定杀伤活性,并用荧光扩增法检测杀伤试验后培养基内HBV-DNA水平.结果:研究组的DC-CIK细胞的5:1效靶比时的平均杀伤率为(54.4±6.3)%、10:1效靶比时的平均杀伤率为(71.5±4.5)%,均明显高于对照组CIK细胞的(42.4±3.0)%、(59.4±4.5)%,差异均有统计学意义(P<0.05).研究组的DC-CIK细胞5:1效靶比时的培养基内的HBV-DNA平均为(1.20±0.30)×106/mL、10:1效靶比时的培养基内的HBV-DNA平均为(1.64±0.60)×107/mL,均明显高于对照组CIK细胞的(0.90±0.23)×106/mL、(1.28±0.23)×107/mL,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:CIK细胞与DC-CIK细胞对HepAD38细胞均具有杀伤效果,而且随着效靶比的升高,杀伤效果增强.同时,乙肝抗原致敏的DC诱导出的特异性CIK细胞(DC-CIK细胞),能够有效提高CIK细胞对乙肝病毒感染的HepAD38细胞的杀伤作用,其杀伤作用可能与DC被乙肝抗原致敏后诱导出特异性CIK,增强各自疗效有关.
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厄洛替尼联合DC/CIK 在晚期非小细胞肺癌维持治疗中的作用
目的:本实验研究厄洛替尼(Erlotinib,特罗凯)联合DC/CIK生物免疫治疗和单用特罗凯在晚期非小细胞肺癌维持治疗中的作用.方法:收集56例Ⅲb、Ⅳ期的非小细胞肺癌患者,其一线治疗为4个周期的含铂两药方案化疗,将疗效达到稳定或以上患者随机分为两组.一组给予特罗凯和DC/CIK生物免疫治疗,另一组给予特罗凯治疗,评价两组的无进展生存(PFS)时间及不良反应.结果:两组的PFS分别是5.30个月(95%CI 5.02~5.58)和4.42个月(95%CI 4.20～4.63)(P<0.05).两组的不良反应主要为皮疹和腹泻.联合组在DC/CIK输注过程中2例出现胸闷,3例出现乏力,3例出现发热.结论:特罗凯联合DC/CIK在晚期非小细胞肺癌维持治疗中是一种安全有效的方法.
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CIK和CEA负载DC联合化疗治疗胃癌的研究
目的 评价胃癌患者术后应用CIK和CEA负载DC联合化疗的临床疗效.方法 选取行胃癌根治手术治疗的患者30例,随机分为2组,分别给予化疗和CIK-DC/CEA细胞免疫治疗联合化疗的治疗方案,随后观察治疗之后的临床反应,并随访其临床疗效、生活质量情况及生存率等评价指标.结果 免疫细胞回输治疗后,患者未见明显不良反应,血清中Th1类细胞因子水平较治疗前有明显升高,治疗前后比较有显著性差异(P<0.05);随访结果显示,免疫治疗临床疗效、生活质量、生存率较对照组均有一定的改善,但无显著性差异(P>0.05).结论 CIK-DC/CEA细胞免疫治疗胃癌是有一定的近期临床疗效的,可为改善胃癌根治术的预后以及免疫治疗提供一定的理论基础.
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肿瘤抗原及相关疫苗研究进展
肿瘤的生物治疗作为肿瘤治疗的新模式,已日渐成为肿瘤综合治疗中不可替代的重要组成部分,它主要包括了免疫治疗和基因治疗两方面.从目前国际研究的趋势分析,从实际应用的角度推测,肿瘤的免疫治疗将会有广泛的应用前景.传统的方法是以肿瘤细胞、肿瘤提取物或某一成分作抗原,给患者接种,通过激发免疫反应,达到控制肿瘤的目的.然而,在不能确定肿瘤特异性抗原的情况下,所引发的非特异性免疫活动在控制肿瘤生长方面十分有限.因此,寻找肿瘤特异性抗原,从而进一步进行相关疫苗的研制工作是基础的、必需的.
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《温病条辨》青蒿鳖甲汤现代药理及临床应用研究进展
青蒿鳖甲汤出自《温病条辨》,系治疗温病后期阴虚邪伏代表性方剂,内清血中伏热、外透阴分伏邪.对原因不明发热及慢性疾病、肿瘤、血液病、术后消耗性发热,疗效显著,无严重不良反应,广泛应用于内、外、妇、儿等各科疾病.随着老龄化社会和疾病谱变化,邪伏阴分发热成为多种疾病共性证候,对“热自阴来”的发热,存在“夜热早凉,热退无汗”等诸证,无论有无阴虚症状或轻重,均可使用,须“审因论治”,明确系温热病后期,邪伏阴分兼阴虚,灵活加减,阴虚较重加元参养阴滋液;虚热甚加地骨皮清透伏热.药理研究主要集中在白血病,已经证实青蒿鳖甲汤能阻止白血病细胞增殖进程,促进白血病细胞凋亡,降低sTNFαR含量,提高免疫力;促进DC分泌IL-12,增加抗肿瘤作用,其他方面研究较少.未来应深入研究作用机理和应用范围.
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DC对系统性白假丝酵母菌感染保护性研究
目的:观察致敏的树突状细胞(DC)免疫接种小鼠对系统性白假丝酵母菌感染保护效果.方法:将白假丝酵母菌孢子、菌丝悬液致敏小鼠DC经小鼠行尾静脉接种3次,后造系统性白念珠感染模型观察小鼠生存期、肾病理切片、眼球取血检测CD4+、CD8+T淋巴细胞.结果:DC能有效延长小鼠生存期、保护小鼠肾脏、增强小鼠的免疫力.结论:DC能很好地抵抗系统性白假丝酵母菌感染,这为研究DC作为佐剂对抗系统性白假丝酵母菌感染的新型联合疫苗奠定基础.
关键词： DC 系统性白假丝酵母菌感染 免疫保护 -
Np73α基因转染树突状细胞抗乳腺癌细胞的免疫效应
目的：研究ΔNp73α基因转染树突状细胞（ DC）诱导的特异性抗乳腺癌免疫效应。方法：人脐带血细胞经GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子诱导培养DC，流式细胞仪（FCM）检测DC成熟前后CD1a、CD83的表达变化情况。脂质体法将pcDNA-HA／ΔNp73α转染至DC，经Western blot检测转染情况。转染DC与自体T细胞共培养诱导特异性CTL。 MTT法测定T细胞增殖能力；ELISA法检测IFN-γ的分泌水平；LDH释放法检测T细胞对乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤作用。结果：DC诱导成熟后，CD1a表达约占56％，CD83约占74％，与未成熟DC（ CD1a 19％，CD8313％）比较，差异有显著统计学意义（ P＜0.01）。 Western blot检测到DC-ΔNp73α组有一特异条带表达。 DC-ΔNp73α组诱导的特异性CTL对MDA-MB-231杀伤作用高于DC组（ P＜0.05），而且刺激T细胞增殖能力增强，分泌IFN-γ的水平升高，与空载体DC-pcDNA组及DC组比较有显著统计学意义（P＜0.01）。结论：以ΔNp73α转染DC制备的DC疫苗，具有显著诱导CTL杀伤乳腺癌细胞的作用。
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激活TLR5和NLRC4通路对小鼠先天免疫细胞的影响
目的：探讨用重组鞭毛素蛋白同时或者分别激活C57BL/6小鼠模型TLR5和NLRC4通路对小鼠先天免疫细胞的影响。方法：首先，表达和纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC（同时激活TLR5和NLRC4两条通路)； FliCΔ90-97（不能激活TLR5通路)；FliC-L3A（不能激活NLRC4通路)；FliCΔ90-97：L3A（两条通路都不激活)。将小鼠分为5组，分别为：PBS组、FliC组、FliC-L3A组、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97：L3A组。分别用PBS和10μg重组鞭毛素蛋白腹腔注射C57BL/6小鼠，每组3只。12 h后收集腹腔灌洗液，流式抗体染色检测腹腔灌洗液中的中性粒细胞和NK细胞的比例。同时，取小鼠脾脏制成脾细胞悬液，流式抗体染色检测DC表面共刺激分子CD80和CD86的表达情况及脾细胞中调节性T细胞（ Treg)的比例。结果：激活TLR5（FliC组和FliC-L3A组)和NLRC4通路（FliCΔ90-97组)小鼠的腹腔灌洗液中中性粒细胞和NK细胞的比例都显著高于PBS组和FliCΔ90-97：L3A组（P<0．01)。激活TLR5通路的FliC组和FliC-L3A组的DC表面CD80和CD86表达水平显著高于 PBS 组、FliCΔ90-97和 FliCΔ90-97：L3A 组（P<0．01)。 FliC-L3A 组调节性 T 细胞的比例高于其他组（P<0．05)。结论：激活TLR5和NLRC4通路可以趋化中性粒细胞、NK细胞，两条通路激活对中性粒、NK细胞有相同的趋化能力。鞭毛素蛋白只有激活TLR5通路才可以上调DCs表面共刺激分子CD80和CD86，促进DCs的成熟。
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DC-CIK细胞免疫联合治疗癌性胸腔积液的实验观察
目的:探讨树突状细胞(DC)-细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞免疫治疗配合CIK细胞联合白介素2胸腔内注射治疗癌性胸腔积液的疗效及机制.方法:分别采集8例癌性胸腔积液患者外周血单个核细胞,诱导成熟DC行淋巴结部位皮下注射;诱导CIK细胞分别行静脉输注以及CIK细胞联合白介素2胸腔内注射.结果:患者治疗后外周血T细胞亚群显示NK细胞(CDl6+CD56+双阳性细胞)较治疗前明显上升,患者的临床症状、影像学均提示病变较前好转.结论:DC-CIK细胞免疫治疗配合CIK细胞联合白介素2胸腔内注射治疗癌性胸腔积液有确切疗效,延长患者生存期,提高生活质量.
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EpCAM蛋白激活DC诱导抗原特异性CTL治疗卵巢癌的实验研究
目的:探讨EpCAM蛋白激活树突细胞(DC)诱导产生CD8+细胞毒T淋巴细胞(CD8+ CTL)进行卵巢癌免疫治疗的效果,为卵巢癌的临床治疗提供帮助.方法:利用EpCAM蛋白诱导成熟DC同时检测DC表面分子和白介素(IL)-10与IL-12表达量的变化,随后通过EpCAM-DC诱导EpCAM抗原特异性CD8+ CTL,继而检测EpCAM-DC-CD8+ CTL对正常卵巢上皮细胞IOSE80和卵巢癌细胞SKVO3的杀伤效果,同时检测干扰素(IFN)-γ释放量.随后进一步检测EpCAM-DC-CD8+ CTL对卵巢癌移植裸鼠的肿瘤抑制程度,并通过病理学染色检测治疗后肿瘤组织变化情况.结果:与PBS刺激相比,EpCAM蛋白能够显著上调DC表面分子DC80、DC83、DC86和HLA-DR水平,依次达到4.79、4.85、4.60和10.91倍;同时EpCAM蛋白显著提高IL-12释放和显著抑制IL-10分泌(P<0.05).DC-CD8+ CTL与EpCAM-DC-CD8+ CTL均引起少量IOSE80细胞凋亡(P>0.05),但EpCAM-DC-CD8+ CTL对SKVO3细胞杀伤率是DC-CD8+ CTL的6.82倍(P<0.05).动物实验表明,经EpCAM-DC-CD8+ CTL治疗后,BALB/c-nu/nu卵巢癌移植肿瘤体积比明显低于PBS组以及DC-CD8+ CTL组,分别达到0.27和0.28倍(P<0.05).HE染色显示 EpCAM-DC-CD8+CTL治疗导致肿瘤组织出现明显的病理学改变.结论:EpCAM蛋白刺激促进了DC成熟继而诱导产生EpCAM特异性CD8+ CTL,EpCAM-DC-CD8+ CTL能够高效的杀伤肿瘤细胞并延迟肿瘤生长,对卵巢癌临床免疫治疗具有重要意义.
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具抗原呈递功能的NK细胞新亚群:IKDC细胞
近年来在小鼠体内发现了一群新的细胞亚群--产生干扰索的杀伤DC(Interferon-producing killer DE,IKDC).这群细胞在表型上既表达NK细胞的标志分子,也表达DC的标志分子;在功能上,IKDC能分泌IFN,具有细胞毒性,同时还具备抗原递呈能力.在正常小鼠体内IKDC广泛存在于全身各淋巴器官,而且各组织器官中IKDC的表型基本相似.随后研究认为IKDC在来源上更接近于NK细胞.究竟是NK细胞还是DC的亚群目前没有明确定论.IKDC的发现为我们研究天然免疫和适应性免疫提供了一个新的途径.
