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表皮干细胞仿生膜对毛囊细胞修复创面的影响
目的 选择新生1d大鼠表皮干细胞(ESCs)接种在胶原修饰几丁质膜(C-CBM),构建具有生物活性的覆盖物,评估其修复效果及应用前景.方法 将16只裸鼠随机分4组(n=4):Ⅰ型胶原组(A组)、几丁质膜组(B组)、几丁质膜+ ESCs组(C组)和Ⅰ型胶原修饰几丁质膜+ESCs组(D组),制备裸鼠背部全层皮肤缺损模型,术后定期取材,组织包埋切片,苏木素-伊红(HE)染色,免疫组织化学检测CD34和CD200表达,观察创面早期滤泡性毛囊增生情况.结果 6周创面愈合皮肤以D组修复较好,肉眼观察创面较厚、红润,有皮纹;A组和B组的修复则较薄、呈淡紫色,易出血;C组愈合较慢;并发现表皮巢形成有规律地增多,D组＞C组＞B组＞A组;D组CD34和CD200在手术后3d开始有毛囊干细胞增生,CD34表达延续到第4周,CD200表达延续到第6周,而C组CD34出现在第4周后,CD200出现在7d,D组是C组的2倍,A组和B组新生毛囊干细胞较少.结论 ESCs在C-CBM上生长良好,细胞可利用胶原的天然材料的黏附性,充分扩展,并参与创面修复,这些结果显示仿生膜有可能成为诱导性生物材料.
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血管紧张素转化酶抑制剂对表皮干细胞增殖、分化、迁移的影响
目的 观察血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂卡托普利对表皮干细胞(ESCs)增殖、迁移、分化的影响,探讨ACE在维持ESCs生物学功能中的作用.方法 利用差速贴壁法获得10例儿童的ESCs,进行离体培养,检测ACE在ESCs的表达.用XTT法检测不同浓度(1 ×l0-5、1×10-6、l×10-7、1×10-8mol/L) ACEI卡托普利对ESCs增殖的影响；体外创伤模型观察1×10-6mol/L的卡托普利对ESCs 6、12、18、24h各时间段的迁移能力；流式细胞仪检测K10的表达观察1×10-6mol/L的卡托普利对ESCs分化的影响.结果 培养的细胞经β1-整合素和K19免疫荧光双重标记染色,83.55％细胞为双标记阳性细胞,即ESCs.免疫荧光染色和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果显示ESCs表达ACE.流式细胞仪定量检测培养的细胞ACE阳性率为74.2％.1×10-6mol/L的卡托普利可明显抑制ESCs的增殖(P＜0.05),且在第5天达到峰值.1×10-6 mol/L的卡托普利可明显抑制细胞的迁移能力(P＜0.05)和克隆能力(P＜0.05).流式细胞仪检测结果表明,l×10-6 mol/L的卡托普利并不影响K10的表达(P＞0.05).结论 ACE通过影响ESCs的增殖,迁移从而影响皮肤的损伤修复和自我更新.
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μ型阿片受体对人表皮干细胞增殖与迁移的影响
目的 观察μ型阿片受体的活化对体外培养的人表皮干细胞(hESCs)增殖与迁移的影响.方法 分离培养原代hESCs,整合素β1、细胞角蛋白19 (CK19)染色鉴定.取第2代hESCs分别用含1 nmol/L β-内啡肽的K-SFM培养基(A组)、含10 nmol/L纳洛酮及1 nmol/L β-内啡肽的K-SFM培养基(B组)以及单纯的K-SFM培养基(C组)进行培养；连续5d,采用噻唑蓝(MTT)法检测hESCs分裂增殖活性.于培养后24 h刮擦生长融合成片的hESCs,制备宽度为100 μm的体外单层hESCs缺损模型,模型制备后24、48、72、96 h,倒置相差显微镜下观察各组表皮创面愈合,并拍照记录,计算模型制备后72 h各组创面愈合率.结果 原代培养的hESCs贴壁后呈鹅卵石样生长.免疫荧光染色法检测第2代hESCs的整合素β1、CK19均呈阳性表达.分组培养后,MTT法测得第2～4天中A组hESCs分裂增殖活性均高于C组,B组低于C组,各组间差异有统计学意义(P＜0.05).单层细胞缺损模型制备后24 h,各组均可见hESCs迁移越过创缘,其中A组越过创缘的细胞数多于C组,B组少于C组；模型制备72 h后,由Image-Pro Plus软件分析各组创面愈合率分别为A组(91.80±0.05)％、B组(79.40±0.06)％、C组(86.30 ±0.75)％,各组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 μ型阿片受体活化后可促进hESCs分裂增殖和迁移活动,并可能藉此参与皮肤多种代谢调控过程.
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Notch信号通路激活/抑制对表皮干细胞增殖和分化的影响
目的 观察Notch信号通路激活或抑制对表皮干细胞增殖和分化的影响.方法 体外分离培养并纯化大鼠表皮干细胞,分组加入Notch信号激活剂Jagged1/FC蛋白(1000 μg/L)和抑制剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT,16 μmol/L),空白对照加磷酸盐缓冲液(PBS),共培养48 h后,通过观察各组细胞形态学变化、克隆计数、噻唑蓝(MTT)法检测吸光度(A)值,比较各组表皮干细胞的增殖能力；通过流式细胞仪及免疫细胞组化法检测细胞表面标记物β1整合素(CD29)及角蛋白CK19、CK10的阳性细胞百分比,比较各组表皮干细胞的分化.结果 3组细胞形态无明显差异.分组培养第5天,Jagged1/FC组贴壁细胞的克隆计数为(45.7±3.8)个,显著高于DAPT组[(16.9±2.1)个]及对照组[(33.4±3.1)个,P＜0.05]；MTT法检测细胞增殖能力,Jagged1/FC组明显高于对照组,DAPT组明显低于对照组(P＜0.05)；流式细胞仪检测Jagged1/FC组的β1整合素表达率(96.42±2.57)％显著高于DAPT组[(72.58±3.87)％]及阴性对照组[(8 8.75±3.14)％,P＜0.05].免疫组织化学CK19阳性细胞百分比Jagged1/FC组明显高于对照组,DAPT组明显低于对照组(P＜0.05)；而CK10阳性细胞百分比Jagged1/FC组明显低于对照组,DAPT组明显高于对照组(P＜0.05).结论 激活Notch信号通路能促进表皮干细胞增殖并维持低分化状态,而抑制Notch信号通路能促进表皮干细胞向表皮细胞分化.
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Wnt-1重组腺病毒的构建及其对人表皮干细胞分化的影响
目的 构建Wnt-1重组腺病毒,并观察Wnt-1对人表皮干细胞分化相关蛋白表达的影响.方法 连接穿梭质粒与骨架质粒,构建重组腺病毒;扩增后感染人表皮干细胞,检测其3种角蛋白和基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达.结果 重组质粒酶切后可得到30 kb和4.5 kb两条特异性条带;人表皮干细胞感染重组腺病毒后,聚合酶链反应(PCR)与绿色荧光蛋白均指示Wnt-1基因的表达,且角蛋白10表达变为阳性;角蛋白18表达增强;角蛋白19表达减弱;细胞培养基中MMP-2浓度由(-16.25±2.40)μg/L升高至(714.88±30.45)μg/L(t=58.45,P<0.01).结论 Wnt-1具有促使人表皮干细胞向腺样上皮细胞分化的趋势.
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表皮干细胞的分离培养和鉴定
目的 分离培养和鉴定人表皮基底层干细胞.方法 中性蛋白水解酶选择性的消化表皮与真皮之间的细胞连接,采用改良的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法分离、培养表皮中的干细胞,观察培养第2、4、6天时a6、β1整合素、K19、K14、p63、Nestin、CD34、PCNA及K10在表皮干细胞中的表达差异.结果 改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够有效地促进表皮干细胞的贴壁和伸展.原代分离的表皮基底层干细胞a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA表达为强阳性而K10不表达.这些细胞具有干细胞的特点,可以形成克隆.随着培养时间的增加,表皮干细胞形态发生变化,a6、β1整合素、K19、K14,表达逐渐减弱,K10表达逐渐增强.此外,在原代分离的细胞中可见单个核样干细胞表达a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA,这些细胞形态相似体积较表皮基底层干细胞大,胞核为肾形,染色较深.结论 中性蛋白水解酶消化合并改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够高效地分离表皮中的干细胞.分离的细胞具有干细胞的特点,可以形成集落.此外,原代分离培养的表皮干细胞中仍然可见单个核样干细胞,这些细胞形态相似,类似血液系统来源的单核细胞,胞质内均匀分布着粗大的阳性颗粒.单个核样干细胞可能与皮肤的发生、发育以及创伤修复有关.
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整合素β1对人表皮干细胞增殖与分化的影响
目的 构建针对整合素(intergrin)β1特异性的siRNA表达载体,并转染人表皮干细胞(KSC),探讨整合素β1对KSC增殖与分化的影响.方法 针对目的基因intergrinβ1,选择RNA干扰作用靶点特异性的寡核苷酸序列,构建到siRNA表达质粒pSilencer3.1/H1中,并转染人KSC,转染分组为转染siIntegrinβ1组、非转染组、转染空载体组、转染siNegative组.通过蛋白质印迹法观察intergrinβ1及外皮蛋白的表达变化;应用流式细胞仪观察细胞周期变化;挑选干细胞克隆传代培养14 d后用1%罗丹蓝染色计算克隆形成率.结果 重组载体siIntegrinβ1转染人KSC能够抑制intergrinβ1的蛋白表达,抑制效率达70%;KSC中外皮蛋白表达较对照组增加50%;G0/G1期细胞较对照组明显减少(P＜0.01)、G2期及S期细胞较对照组增多(P＜0.05);干细胞克隆形成率较对照组显著降低(P＜0.01).结论 重组载体转染人KSC能下调intergrinβ1的表达,下调intergrinβ1的表达可能是表皮干细胞走向分化的重要调控因素之一.
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体外培养表皮干细胞构建组织工程皮肤的研究
目的 探讨应用表皮干细胞构建组织工程皮肤修复皮肤缺损的可行性.方法 运用黏附实验将人表皮干细胞分选出来后大量培养,将成纤维细胞和表皮干细胞转移到真皮底物上构建组织工程皮肤,并将之移植于裸鼠皮肤缺损模型,于术后第1、2、4周处死动物,收集标本,进行组织学、透射电镜及免疫组织化学检查.结果 组织工程皮肤移植后4周具备完整的表皮层和真皮层,表皮层中具备基底层、棘层、颗粒层和角质层.表皮细胞间还可以看到有桥粒、半桥粒、角质透明颗粒和粗张力微丝束.表、真皮层间有连续的、完整的基底膜.真皮网架破坏明显,大量的成纤维细胞增殖活跃,胶原纤维排列整齐,有丰富的毛细血管.结论 本研究所构建的组织工程皮肤组织学形态和超微结构上已接近于正常的皮肤,从而为临床修复皮肤缺损的研究打下了坚实的理论和实践基础.
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荷负电气溶胶治疗大鼠烧伤创面后表皮干细胞的变化
目的探讨荷负电气溶胶对烧伤创面表皮干细胞影响以及其促进创面愈合的机制.方法将清洁级健康Wistar大鼠48只随机分为A、B两组,每个动物背部两侧分别制成实验创面或对照创面,实验创面以荷负电气溶胶照射,A组动物每日照射2次,B组每日照射1次;利用干细胞表达β1整合素的特性,加入整合素β1抗体,通过免疫组织化学染色检测创面表皮干细胞含量的变化,比较各时相点两组创面间的差异.结果A、B两组各时相点实验创面的表皮干细胞数目是同组对照创面的1.5到2倍;而A组实验创面的表皮干细胞数又较B组实验创面增多.结论经用荷负电气溶胶照射大鼠烧伤创面能促进表皮干细胞的增殖.
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鼓膜表皮干细胞的研究及应用前景
所有能够自我更新的组织都存在干细胞,这些细胞长期生存,有强大的增殖分化潜能,有助于细胞更替.鼓膜的外表层属于角质细胞,表层角质细胞持续不断更新、脱落,然后又由基底层的细胞持续不断地增殖分裂更替.为了让表皮维持固定的厚度和功能,细胞产生和丢失的速度必须一致.因此,理论上鼓膜表层中也存在干细胞.鼓膜表皮干细胞是鼓膜表皮细胞增殖和移行的基础,对其在鼓膜上的分布和增殖调控的研究可以从根本上了解鼓膜穿孔修复的细胞增殖和移行规律.鼓膜表皮干细胞的保留和移殖对鼓室成形术术腔尽早上皮化有积极的临床意义.
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端粒酶在体外培养人表皮干细胞中的表达
目的:探讨人表皮干细胞在体外培养中的端粒酶活性.方法:体外培养人表皮干细胞,于第1、8、10代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达并进行图像分析. 结果:人表皮干细胞表达端粒酶逆转录酶,表达强度随传代次数的增多而下降.结论:人表皮干细胞在体外培养过程中,仍具有端粒酶活性,但不足以抑制该细胞的衰老.
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改良法分离、培养人表皮干细胞的研究
目的:改良传统人表皮干细胞(hESCs)分离、培养方法,为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞.方法:应用改良的酶消化法(改良法)及传统酶消化法(传统法)分离、培养hESCs,台盼蓝染色测定细胞活力.结果:台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61 个,传统法细胞消化分离数为68.50 ±26.91 个(P<0.01);改良法活细胞比率是(94±0.01)%,传统法活细胞比率是(75±0.04)%(P<0.05).结论:利用改良的酶消化法可获得数量更多、活力更好的人表皮干细胞,为以hESCs 为种子细胞构建组织工程皮肤奠定基础.
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皮肤鳞癌组织角蛋白19表达特征的实验研究
目的通过对皮肤鳞癌组织角蛋白19表达特征的研究,探讨表皮干细胞与皮肤鳞癌的关系. 方法选择皮肤鳞癌患者10例,旁开病变组织2 cm作切口切除病变组织,取癌组织和皮肤鳞癌周边组织做检查,应用过氧化酶标记的链霉卵白素(SP)免疫组化法,以小鼠抗人角蛋白19型的单克隆抗体检测角蛋白19表达阳性细胞的分布特征. 结果正常皮肤只有表皮基底层和附属器有角蛋白19表达阳性细胞,而癌组织内的角蛋白19表达阳性细胞不仅比正常皮肤多,且分布紊乱,其核大小不等,形态各异,皮肤鳞癌周边组织中的表皮有多层角蛋白19表达阳性细胞,但分布有规律,无异形性. 结论皮肤鳞癌与表皮干细胞可能存在某种关系,值得进一步探讨.
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表皮干细胞表面标志物的研究进展
表皮干细胞具有高度自我更新能力及终末分化低的特性,从而可维持表皮的自我更新和完整性.目前对表皮干细胞表面标志物的研究已取得了一定的进展,但仍然缺乏具有特异性的表面标志物.就国内外对表皮千细胞表面标志物在整合素,角蛋白,基因物质P63,CD71,连接蛋白43,C8/144B和CD34等方面的研究进展作一综述.
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体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮干细胞
目的:探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮干细胞的可行性.方法:直接抽取成年健康志愿者骨髓,采用直接贴壁法培养获得较纯的人骨髓间充质干细胞;用免疫组织化学方法进行表面标志的检测、鉴定及培养扩增后,以HaCaT细胞培养上清液联合表皮生长因子(EGF)诱导分化,透射电镜下观察细胞形态的变化;并运用免疫组织化学方法检测K10,K19及β1整合素的表达.结果:诱导BMSCs1周后可见大量扁平的多角形细胞紧密连接成片,呈铺路石状排列生长,胞浆内可见丰富的角蛋白丝;大量细胞K19和β1整合素双染阳性,个别细胞K10染色阳性.结论:BMSCs在HaCaT细胞培养上清液联合EGF的体外培养条件下可诱导分化为表皮干细胞.
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加热对大鼠表皮干细胞 HSP70表达及细胞增殖的影响
目的：分离、培养并鉴定SD大鼠表皮干细胞；观察不同温度加热对表皮干细胞热耐受预测因子HSP70表达和细胞增殖的影响。方法体外分离培养大鼠表皮干细胞，用倒置显微镜观察其形态，以角质形成细胞作为对照；采用细胞免疫荧光技术对β1-整合素、干性标志物K19、α6及分化标志物K10进行鉴定；实验对37、41、43、45、47、49℃热处理的表皮干细胞采用MTT法测定细胞吸光度值，计算细胞存活率；Western blot法测定HSP70表达的变化。结果分离的细胞体积小，核质比大，集落生长，呈典型的铺路石样结构；实验组细胞干性标志物K19、β1-整合素及α6呈阳性表达，分化标志物K10表达阴性；随着温度升高，细胞HSP70表达增加，于47℃时表达量达到峰值，同时细胞随温度升高存活率逐渐降低，于45℃～49℃时降低幅度下降成一水平趋势。结论成功建立了SD大鼠表皮干细胞分离、培养方法，升高温度可抑制表皮干细胞增殖能力，细胞存活率下降，提示HSP70表达增加对表皮干细胞热损伤可能具有保护作用。
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人表皮干细胞的体外培养与鉴定
目的 探讨人表皮干细胞的体外分离培养方法 ,并对培养的表皮干细胞进行鉴定.方法 运用中性蛋白水解酶和胰蛋白酶两步法分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附分离角质形成细胞,应用表皮干细胞培养基进行培养.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,免疫组织化学染色观察表皮干细胞β1整合素、角蛋白19(K19)、CK10的表达. 结果 组织学观察显示,培养中实验组细胞呈现克隆生长,且克隆维持时间较长;免疫组织化学染色显示,实验组的培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达,而CK10阴性表达.结论 应用Ⅳ型胶原黏附和运用表皮干细胞培养基可以实现人体表皮干细胞的分离和培养,为表皮干细胞体外的大量扩增奠定了基础.
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角蛋白19在Ⅲ度烧伤创面修复过程中的表达及意义
目的通过对Ⅲ度烧伤创面原位再生修复过程中不同活组织角蛋白19(K19)表达特征的研究,探索Ⅲ度烧伤创面原位再生修复的可能机制.方法选择有Ⅲ度烧伤创面的青年患者10例,在原位再生修复过程中的不同时期分别切取活组织,应用过氧化酶标记的链霉卵白素(SP)免疫组化法,以K19单抗检测表皮干细胞的分布和形态特征;同时取供皮区的正常皮肤以及慢性溃疡组织作对照.结果⑴正常皮肤组织只有表皮基底细胞层和附属器的部分细胞表达K19;⑵伤后3～6d,10例患者的痂下活组织均未发现K19表达阳性细胞;⑶肉芽样组织有部分细胞表达K19;⑷早期再生组织检测结果示:在再生表皮的中部,即位于基底膜与颗粒层之间有大量的K19表达阳性细胞,且分布广泛而有规律 ;⑸晚期再生组织检测结果显示:与正常皮肤类似;⑹入院前慢性皮肤溃疡组织中无K1 9表达阳性细胞.结论Ⅲ度烧伤创面经烧伤湿性医疗技术加rhEGF治疗后K 19表达阳性细胞可以从无到有产生并不断增加,以实现Ⅲ度烧伤创面的原位再生修复.
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应用改良小室法构建裸鼠皮肤及毛囊
目的 应用改良小室法在裸鼠体内构建出有正常组织结构的皮肤和毛发.方法 应用16.5 d小鼠胚胎的表皮细胞、成纤维细胞和Ⅰ型鼠尾胶原蛋白构建毛囊重建模型.首先在裸鼠背部做直径1.0 cm的圆形创面,将小室固定于创面上;然后,在小室内加入成纤维细胞和Ⅰ型鼠尾胶原蛋白混合悬液形成真皮层,等待胶原凝固后加入表皮细胞形成表皮层.对照组采用传统小室法,16.5 d小鼠胚胎的表皮细胞和成纤维细胞混匀后加入裸鼠体内构建好的小室中.结果 实验组和对照组在第10天拆除小室后创面皮肤均得到修复,两组无明显差异.拆除小室1周后,实验组在创面上形成均匀分布的毛发,对照组毛发呈现不均匀分布.拆除小室1个月后可观察到实验组和对照组创面均能够形成大量毛发.通过HE染色及免疫荧光检测发现改良小室法所构建的皮肤拥有正常的组织结构及完整的毛囊结构.结论 改良小室法能够构建出有正常组织结构的皮肤组织,是一个高效稳定的毛囊重建模型.
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表皮干细胞生物性状及临床应用研究进展
表皮干细胞(Epiderimal Stem Cells,ESC)是由胚胎干细胞分化而来,为皮肤组织中的专能干细胞.皮肤组织特异性干细胞,在维持表皮的自我更新,保持皮肤正常的表皮结构与功能方面起着重要作用[1-2].现就表皮干细胞的研究及临床应用作一综述.
