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DNA损伤在去分化源性表皮干细胞安全性评价中的作用及相关机制的研究
目的：：从分子、细胞及在体水平评估DNA损伤和非 DNA 损伤因素诱导所得去分化源性表皮干细胞的安全性,探讨DNA损伤及其应答分子对其安全性评估的意义与机制。方法：分别采用紫外线(UV)照射和bFGF处理诱导方案诱导表皮细胞去分化。采用 MTT法比较正常培养和血清培养条件下的两组去分化源性表皮干细胞的增殖能力；流式细胞术检测凋亡情况；Western blotting检测各组去分化过程中DNA损伤应答分子γ-H2AX、激活型 caspase、p53、p21表达的变化；在雌性BALB/c裸小鼠右侧腋窝皮下注射人黑色素瘤细胞及两种去分化源性表皮干细胞,同时设生理盐水注射对照,30 d 后取瘤块称重,评估两种去分化源性干细胞的成瘤性。结果：①两种去分化源性表皮干细胞均表现出较强的增殖能力,UV 照射所得干细胞具有较强的血清耐受性；②UV照射可导致表皮细胞DNA损伤和细胞凋亡,影响表皮细胞中 p53和 p21水平,而 bFGF处理组无此作用；③两种去分化源性表皮干细胞均无体内成瘤性。结论：去分化过程中细胞 DNA 损伤与否是评价去分化源性干细胞安全性的较敏感的关键指标,因此 bFGF处理诱导与 UV照射所得的表皮干细胞相比更为安全可靠。
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热损伤与碱性成纤维细胞生长因子联合处理诱导表皮细胞去分化的实验研究
目的:体外建立表皮细胞去分化模型,为深入阐明表皮细胞去分化过程奠定基础.方法:离体条件下选择热损伤与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为联合诱导因素处理成熟表皮细胞.通过Giemsa染色和电镜观察细胞形态的改变;通过细胞培养和滋养层培养体系观察细胞的增殖能力,包括克隆形成和复层生长情况;采用器官培养体系体外构建三维皮肤,观察细胞再分化形成表皮情况;应用基因芯片技术观察细胞基因表达的改变.结果:经联合诱导后,细胞形态发生改变,表现为体积减小,细胞器数目减少,核浆比增大.增殖和再分化能力的改变体现在诱导后的表皮细胞能形成克隆,在滋养层培养条件下可以形成复层生长,并能够在体外构建出包括基底层和基底上层在内的表皮结构.基因水平的改变表现为与角质化相关基因下调和与有丝分裂相关基因上调.结论:在热损伤与bFGF联合诱导下,已分化的表皮细胞会发生形态、功能和基因表达的改变,表现为干细胞的特性.
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去分化来源表皮干细胞与在体表皮干细胞之间的差异分析
目的:比较去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞之间的异同点.方法:采用碱性成纤维细胞诱导因子(bFGF)诱导表皮细胞去分化形成表皮干细胞;由人包皮分离、培养在体表皮干细胞.采用免疫细胞化学染色法、流式细胞检测技术、细胞染色体核型检测技术及逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)观察去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞之间细胞表面标志蛋白表达、细胞亚群及染色体核型等方面的差异.结果:免疫细胞化学染色结果表明,去分化来源的表皮干细胞能够表达表皮干细胞及其亚群特异性的表面标志蛋白,如β1整合素、角蛋白19(CK19)、CK14等,而CK10的表达为阴性.流式细胞技术检测结果显示去分化来源的表皮干细胞及在体表皮干细胞中α6+CD71-、α6+CD71+及CD71表达阳性的细胞亚群分别占被检测细胞总数的22.8%、68.14%、0及45.39%、33.11%、0.02%.细胞染色体核型检测分析结果显示去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞的染色体均为23对、46条,核型正常.此外,RT-PCR检测结果表明去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞中β1整合素、CK19、CK14及CK10的mRNA表达水平差异无显著性.结论:去分化来源的表皮干细胞和在体表皮干细胞之间存在着细胞亚群的分布差异,提示其具有更强的增殖能力;二者在细胞核型和表面标志蛋白表达等方面具有相似性.去分化来源的表皮干细胞可以作为表皮干细胞的替代细胞应用于皮肤重建与再生的相关研究.
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人表皮角质细胞系培养过程中细胞生物学行为和表型的变化
目的:获得较高比例的已分化表皮细胞,为表皮细胞去分化研究奠定基础.方法:采用常规表皮细胞培养方法对人表皮角质细胞系(HEK)进行培养和传代.每一代细胞均通过免疫细胞化学染色和Western blot 方法进行表皮干细胞和表皮细胞相应标志物的检测,包括β1整合素、角蛋白19(K19)、角蛋白10(K10)等指标.结果:第1代HEK呈克隆样生长,表皮干细胞标志物β1整合素、K19均有高表达,而K10的表达为阴性.经过数次传代,细胞克隆形成数目减少,细胞逐渐呈分散分布,K10的表达逐渐增高,而β1整合素、K19的表达呈下降趋势,比例减少.细胞培养至第5～6代时,为其生长的一个转折点,即此时细胞增殖能力开始明显降低,但形态良好,K10表达阳性细胞比例明显增高,而β1整合素、K19表达阳性细胞比例迅速降低.细胞培养至10～11代时,为其生长的第二个转折点,此时细胞几乎丧失增殖能力,数量显著减少,体积变大,核浆比明显减小,完全见不到β1整合素、K19表达阳性细胞,K10染色均为阳性.结论:可以选取适当代数的HEK用于去分化研究,为增加HEK的新用途提供了实验基础.
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正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与增殖分化特征的比较性研究
目的:采用特殊染色法研究少儿与成年人大面积重度烧伤后瘢痕组织表皮干细胞分布与表达β1整合素和角蛋白19、14、10(K19,K14,K10)的特征与规律,在此基础上确定表皮干细胞及短暂扩充细胞分布、数量的差异以及这些改变与瘢痕愈合关系.方法:分别取4～12岁少儿及35～53岁成年人2组健康皮肤及大面积深度烧伤后瘢痕组织.采用免疫组织化学SP法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10.结果:瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低.瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛.结论:瘢痕组织表皮基底层具有增殖能力的表皮干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后分化阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高.提示瘢痕组织表皮的增殖能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一.
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5-AzaC对表皮干细胞Oct4基因的诱导作用研究
目的:探讨并建立表皮干细胞Oct4基因的非转基因诱导方法.方法:分离培养人表皮干细胞,在培养至3～5 d出现克隆性生长时加入工作浓度为10 μmol/L的5-AzaC,24 h后再诱导1次.采用RT-PCR方法,检测经5-AzaC刺激48 h后的表皮干细胞Oct4基因转录水平.结果:PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,出现247 bp(Oct4)和219 bp(β-actin)目的片段明亮的特异性条带.结论:5-AzaC能有效激发出表皮干细胞Oct4基因的转录.
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成人正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与表达特征的比较研究
目的:采用免疫组织化学染色方法研究成人正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与表达β1整合素和角蛋白19,14,10(K19,K14,K10)的特征与规律,探讨两种组织表皮干细胞表达特征的差异与烧伤后瘢痕愈合的关系.方法:分别取成年人健康皮肤6例和大面积深度烧伤后瘢痕组织6例.采用免疫组织化学Elivision两步法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10.结果:瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低.瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛.结论:瘢痕组织表皮基底层干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后分化阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高.提示瘢痕组织表皮的修复能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一.
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Akt/mTOR信号通路介导低浓度过氧化氢对小鼠表皮干细胞的促增殖作用
目的:探讨低浓度过氧化氢(H2O2)对小鼠表皮干细胞(mESCs)体外促增殖作用及其机制.方法:以酶消化法分离培养mESCs.免疫荧光技术鉴定第3代mESCs β1整合素和角蛋白19 (K19)表达,流式细胞术鉴定CD34的表达;以不同低浓度H2O2(0、25、50、100、150和200 μmol/L)处理mESCs 48 h和72h.同时,另一组实验中在用不同浓度H2O2刺激的同时加入或不加入雷帕霉素(50 ng/ml)培养48 h.甲氮甲唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;Western Blot法检测H2O2刺激小鼠mESCs 48 h Akt/mTOR信号通路关键蛋白mTOR、Akt、P70s6k、eIF4E、4E-BP1、p-mTOR、p-Akt、p-P70s6k、p-eIF4E、p-4E-BP1和细胞增殖相关蛋白CyclinD1、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.结果:免疫荧光技术检测分离培养的mESCs细胞100％表达β1整合素和K19;流式细胞术检测99.8％的mESCs表达CD34;MTT检测结果显示,48 h和72 h时25 μ mol/L和50 μ mol/L的H2O2可以有效地促进mESCs的增殖(P＜0.05),而雷帕霉素能拮抗这一效应;但当H2O2浓度为200 μ mol/L时,则显著抑制mESCs增殖(P＜0.05);免疫印迹结果显示低浓度H2O2处理mESCs 48 h后,Akt/mTOR信号通路关键蛋白mTOR、Akt、eIF4E、4E-BP1水平及其磷酸化水平(p-mTOR、p-eIF4E、p-4E-BP1)显著增加(P＜0.05或P＜0.01),当H2O2浓度为200 μ mol/L时则抑制其表达(P＜0.05或P＜0.01).此外,50 μ mol/L的H2O2能上调细胞周期蛋白Cyclin D1和PCNA的表达,而雷帕霉素能拮抗这一作用.结论:低浓度的H2O2对mESCs有明显的促增殖作用,并且能激活Akt/mTOR通路.而低浓度H2O2对mESCs的促增殖作用至少部分是通过活化Akt/mTOR信号通路介导的.
关键词： 表皮干细胞 过氧化氢 Akt/mT0R信号通路 细胞增殖 -
蜕皮甾酮体外促进人表皮干细胞增殖的实验研究
目的:观察蜕皮甾酮(EDS)对人表皮干细胞增殖的影响.方法: 中性蛋白水解酶-Ⅳ型胶原黏附法分离正常人包皮的表皮干细胞,免疫细胞化学法检测第3代细胞β1整合素、角蛋白19(K19)、K14、K10抗原表达以鉴定表皮干细胞.分别用EDS终浓度为0(对照组)、10、20、40、80、160 mg/L的Epilife培养基培养表皮干细胞,于培养1 d、2 d、3 d、4 d时用 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5二苯基溴化四唑(MTT)法于酶标仪上检测490 nm处的吸光度值(A值),判定EDS对表皮干细胞体外增殖的影响.4 d时采用流式细胞术检测各组细胞的周期改变,计算增殖指数(PI).结果:免疫细胞化学法检测提示β1整合素、K19、K14抗原明显阳性, K10抗原阴性.培养1 d、2 d时,20、40、80 mg/L组吸光度高于对照组(P＜0.05),10、160 mg/L组吸光度与对照组比较差异无显著性(P＞0.05);培养3 d、4 d时,各实验组吸光度均高于对照组(P＜0.05);各时间点所检测的吸光度值均以80 mg/L时高.流式细胞技术检测实验组PI值分别为40.00%、40.41%、40.96%、43.76%、40.87%,均高于对照组35.53%;实验组中以80 mg/L时高.结论:体外培养条件下EDS能促进人表皮干细胞的增殖,该促进作用在80mg/L时为显著.
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正常皮肤和瘢痕组织表达β1整和素与系列角蛋白特征的比较性研究
目的:采用特殊染色法研究幼儿与成人大面积重度烧伤后瘢痕组织表皮细胞表达β1整和素和角蛋白19、14以及10的特征与规律,并在此基础上确定表皮干细胞及短暂扩充细胞分布、数量的差异以及这些改变与瘢痕愈合关系.方法:分别取幼儿及成人健康皮肤与大面积深度烧伤后瘢痕组织.采用免疫组化方法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达β1整和素和角蛋白19(K19)以及分化表皮细胞表达的角蛋白14与10(K14、K10).结果:瘢痕组织表皮基底层表达β1整和素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低.瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛.结论:实验结果提示,瘢痕组织表皮基底层具有增殖能力的表皮干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后细胞阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高.提示瘢痕组织表皮的增殖能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一.
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表皮干细胞及其信号通路的研究进展
1 表皮干细胞特点及其在创伤愈合中的作用皮肤是人体大的器官,表皮位于皮肤外层,具有自我更新能力的组织(约每个月更新1次)[1].近年来,人们逐渐认识到存在于上皮组织的成体干细胞ESCs与皮肤的发生、修复、改建以及与上皮源肿瘤、皮肤免疫性疾病有着密切关系.在正常成人表皮基层主要含有三种细胞亚群维持着其新陈代谢:①表皮干细胞;②表皮干细胞的子代细胞-短暂扩充细胞(TA,类似定向祖细胞);③有丝分裂后分化细胞(Postmitotic differentiating cells, PM-D Cells),表皮脚及毛囊隆突部表皮干细胞向表皮迁移分化为表皮祖细胞,为表皮新陈代谢提供细胞源;向下迁移,为毛囊循环周期提供细胞源.
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人表皮干细胞分离培养和纯化鉴定的进展
皮肤体现出很强的再生能力,是由于表皮基底层中的表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)终身不断自我更新、持续分化以取代终末分化细胞,从而在维持组织结构的更新、细胞内环境的稳定及在创伤后创面修复过程中起至关重要的作用[1].随着分子生物学、细胞生物学、组织工程学及生物工程学等学科的发展,ESCs凭借其特有的生物学优势在基因治疗、细胞治疗中越来越受到重视,成功地分离培养ESCs对临床上创伤修复的研究起着重要的作用.但ESCs数量较少,只占基底细胞总数的1%～10%[2],且ESCs的特异性分子标志、识别标准、分布定位及体外培养条件下生物学行为的变化等诸多方面都还存在一些争议.现将ESCs分离培养和纯化鉴定的进展综述如下.
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表皮干细胞分化调控的相关研究进展
皮肤是人体大的器官,同时也是人体免疫系统的重要组成部分.皮肤由表皮和真皮组成,表皮是典型的能够自我更新的组织.表皮的不断更新,是表皮干细胞不断增殖分化所形成的,其在维持表皮更新、保持细胞的产生和丢失平衡状态方面起着重要作用[1].因此,了解表皮干细胞的定位和特性,增殖分化及其调控机制对于临床修复皮肤损伤、治疗皮肤疾病、构建组织工程皮肤的意义重大.
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表皮干细胞分离和鉴定的研究进展
大面积烧伤创面的覆盖仍是医学面临的难题之一.目前临床常用的方法存在诸多不足,以患者自体皮覆盖创面,经常面临皮源不足的问题,用自体表皮细胞培养的皮片来覆盖创面,不但耗时长、易感染,而且费用贵、弹性差.
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参与创面修复的干细胞及其在创面修复中作用的研究进展
皮肤作为人体大的器官,在抵御外界病菌入侵、调节体温、感觉等方面有重要作用.通常情况下,皮肤的表皮处于动态的更新状态,新生的表皮细胞取代老化脱落的角质细胞,这个过程与定位于表皮基底部的表皮干细胞密切相关,基底表皮干细胞的增殖同表皮脱落的细胞处于动态平衡,这一平衡维持着皮肤正常的组织结构和细胞内环境的稳定.
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表皮干细胞生物学特性的研究进展
皮肤作为保护人体的天然屏障,在避免机体水分大量丢失、维持机体体温恒定、抵抗微生物感染、减少机械损伤中均具有重要作用,并且具有终生动态保持自身结构状态稳定的能力。皮肤结构由表及里依次为表皮、真皮、皮下组织及其附属器官。表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)是来源于胚胎外胚层的特异性干细胞,能分化为皮肤各层组织,从而使表皮始终处于持续不断的增殖、分化、凋亡状态,保证表皮组织结构的完整和动态平衡。此外,ESCs 作为创面修复的特异性干细胞,在皮肤及其附属器官的修复、改建过程中具有重要作用[1]。有关ESCs生物学特性的研究已有很多报道,现将近年来研究进展综述如下。
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表皮干细胞表面标志物的研究进展
表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)是来源于胚胎外胚层的皮肤组织的专能干细胞,可以分化成各种表皮细胞,使表皮始终处于持续的增殖、分化、脱落、消亡状态,大约每月更新一次,并且增殖与消亡的速度保持大致平衡,从而保证了皮肤形态和功能的完整性.
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表皮干细胞的研究进展
表皮干细胞(epidermal stem cells)主要位于表皮基底层和毛囊外根鞘膨凸部(bugle).
关键词： 毛囊外根鞘 表皮干细胞 stem cells 基底 -
创面愈合过程中创缘表皮干细胞的再分布
目的:研究皮肤干细胞在全层皮肤创面愈合过程中的分布与增殖分化特征,以及该特征在创面愈合过程中的作用.方法:10只Wistar大鼠背部各制备4个面积为2.54cm2的全层皮肤创面,将刨面随机分为2组,即银锌霜治疗组(20个创面),空白对照组(20个创面).分别于伤后3d、1周、2周和3周以组织学检查动态观察各组治疗效果,并以β1整合素、角蛋白19(K19)免疫组化法检测表皮干细胞在创面愈合过程中的表达情况.结果:两组创面愈合率为银锌霜组80%(16/20),对照组60%(12/20).两组创面肉芽组织于各时相点均未见β1整合素、K19阳性细胞出现,但于创缘表皮的棘层或颗粒层出现了散在的β1整合素和K19同时染色阳性细胞.且越接近创面这些阳性细胞越密集,组织学上与基底层的阳性细胞无直接联系,其数量随着创面的缩小渐渐增加,直到创面愈合.上皮化后,这些阳性细胞逐渐减少,并随着愈合创面表皮脚的出现而消失,而感染创面的阳性细胞数量明显少于未感染创面的阳性细胞数.结论:表皮干细胞能动地参与创面的修复,创缘表皮干细胞再分布的主要功能可能促进创面再上皮化.
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毛囊不同发育阶段表皮干细胞NK-1受体表达特征的实验研究
目的:通过观察不同阶段表皮干细胞表面感觉神经肽SP的受体NK1的表达特征与鼠毛囊发育间的相关性,研究表皮干细胞分化发育为毛囊时感觉神经肽的作用,为研究通过神经调控诱导表皮干细胞向毛囊分化奠定基础.方法:实验取胎龄12.5～13.5d胎鼠、1～2d新生鼠、成鼠三组皮肤标本,以β1整合素及K19双标阳性表达定位表皮干细胞,免疫组化方法定性、半定量分析NK1受体表达.结果:不同发育阶段鼠表皮干细胞表面均有NK1受体表达,其阳性表达率与ESC双标阳性表达率无明显差异;胎鼠及新生鼠NK1受体表达率同成鼠之间存在明显差异,提示鼠毛囊发生期前ESC的NK1受体表达明显高于毛囊静止期.结论:感觉神经肽在由ESC分化发育为毛囊过程中具有重要启动及调控作用.
