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附红细胞体合并布鲁氏菌感染病例的实验室诊断
附红细胞体病和布鲁氏菌都是人兽共患传染病,其中我国人类附红细胞体病是近十多年才发现,报道病例较少,布鲁氏菌病是近几年重新肆虐的传染病[1],目前附红细胞体合并其他病原微生物的感染少有报道[2,3],而与布鲁氏菌合并感染的病例未见有报道,本中心在接诊患者时发现,某病人发热持续14d,体温高38.8℃,多汗,肌肉关节痛、乏力、脾脏轻度肿大,经抗生素治疗无效.流行病学调查显示,该患者从事山羊屠中8年,山羊多来源北方黑龙江、内蒙古、山东省等地,平时屠宰过程无手套、口罩等任何保护措施.经过实验室检测诊断为附红细胞体合并布鲁氏菌病感染.
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从抚顺地区布病患者血液中分离到布鲁氏菌
目的:了解抚顺地区布鲁氏菌感染状况及菌型分布.方法:参照<布鲁氏菌病防治手册>进行分离鉴定.结果:从抚顺地区布鲁氏菌病患者血液中检出2株布鲁氏菌.结论:抚顺地区人感染布鲁氏菌主要为羊3型.
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桃源县首起布鲁氏菌疫情的现场调查与实验室检测
目的 对桃源县首起布鲁氏菌病(下简称布病)疫情进行现场流行病学调查处理和相关的实验室检测,为布病的防控提供科学依据. 方法 发现桃源县首例病例后,开展现场流行病学调查处理,对重点监测人群和羊只进行血清学检测. 结果 首例患儿家中母羊患有布病,患儿经常接触小羊羔而导致感染的可能性较大.从73名重点监测人群中检测出9名血清抗体阳性感染者,阳性率为12.3％;从378只山羊检出布病抗体阳性37份,阳性率9.8％. 结论 桃源县存在动物布病,给人群健康带来威胁,应采取综合防治措施,遏制布病在人畜间流行.
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布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆、表达和免疫学特性的初步研究
目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的克隆、测序和表达,并对其进行初步的血清学鉴定.方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP31基因连接入PMD-18T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP31,在大肠杆菌中将该蛋白表达.用Western-b1ot分析重组表达的GST-OMP31的免疫学特性.结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP31原核表达载体并在大肠杆菌中表达了OMP31基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白.结论成功表达了布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的基础.
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布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达
目的 克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统.方法 用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组,得Omp25基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列,将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,经双酶切和DNA测序测定,将构建的重组质粒转化大肠杆菌(E.coli HB101,TOP10),经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白rOmp25表达情况.结果 经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-Omp25,经IPTG诱导,特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白.结论 制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段,并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白.
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玉溪市2008～2012年布鲁氏菌病监测结果分析
目的 了解玉溪市人、畜布鲁氏菌病的发生及流行现状,为制定防治措施提供科学依据.方法 2008～2012年对玉溪市华宁、通海、澄江、江川四县的养殖、屠宰、乳肉制品加工、兽医和销售交易重点从业人员进行血清学监测,并对52例可疑布病患者进行病原学监测；对玉溪全市八县一区饲养的猪、牛、羊采用试管凝集试验(SAT)进行血清学监测.结果 共监测重点从业人员1335例,感染率2.55％,其中养殖人员感染率高3.74％,职业分布感染率差异有统计学意义(x2=10.63,P＜O.05),通过实验室病原学监测确诊现症病人15例；全市共监测猪、牛、羊16211头(只),感染率2.12％,被监测牲畜中,猪未被检出,牛感染率1.76％,羊感染率4.52％高,差异有统计学意义(x2=57.95,P＜0.05).结论 养殖人员是感染的主要人群,感染布氏菌的羊和牛是主要传染源,疫情有扩散蔓延趋势,需要加强综合防治,加强清除传染源,切断传播途径,对重点地区、重点人群进行宣传干预.
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布鲁氏菌病患者血清免疫球蛋白的检测分析
目的 检测分析乌鲁木齐地区布鲁氏菌病患者治疗前后免疫球蛋白含量的变化及意义.方法 对治疗前后布鲁氏菌病患者和同期健康体检者的血清采用速率散射免疫比浊法检测免疫球蛋白的含量.结果 治疗前布鲁氏菌病患者,血清IgG和IgM含量分别为(18.27±7.95) g/L和(2.92±1.25) g/L,明显高于对照组(7.32±3.72) g/L和(1.60±0.64) g/L,差异均有统计学意义(P＜0.05).但对于IgA的含量,病例组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);治疗后病例组免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量明显降低,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 检测布鲁氏菌病患者机体免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平的变化有助于临床布鲁氏菌病的诊治.
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猪布鲁氏菌分离及鉴定
目的 了解海南省猪布鲁氏菌病发病情况和流行菌株类型,为制定布鲁氏菌防治措施提供科学依据.方法 采用组织培养、小动物接种对一例布鲁氏菌病血清学阳性的临高母猪进行细菌分离,并以生物分型、血清分型等传统方法作鉴定.用纸片扩散法进行药敏试验.结果 采用猪脾组织以及肝、脾、淋巴结的混合组织接种的豚鼠,分别在第37d、49d血清抗体滴度达1∶1 600～1∶3 200,此时从剖杀的两只豚鼠肝脾组织中各分离出一株布鲁氏菌,经鉴定均为猪种生物3型布鲁氏菌.药敏试验该菌对四环素、卡那霉素、利福平、链霉素、庆大霉素高敏.结论 海南畜间布鲁氏菌病流行菌株以猪种生物3型布鲁氏菌为主,今后布鲁氏菌病的防控应以猪布鲁氏菌病监测作为侧重点.
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血液及骨髓培养分离马耳他布鲁氏菌1例
布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病为急性或慢性传染病,属人畜共患疾病.该病临床表现变化多端,细菌培养时间长、检出率低,给该疾病的诊疗带来一定困难,极易延误诊疗.本院收治不明原因发热患者1名,分别经血液、骨髓培养分离出马尔他布鲁氏菌,确诊为布鲁氏菌病,本文对此病例进行总结分析.
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布鲁氏菌感染1例
布鲁氏菌病属人畜共患的乙类传染病,国内主要流行于西北、东北等地的牧区,病原菌主要通过破损的皮肤及呼吸道、消化道黏膜进入人体,患者以长期发热、关节酸痛、肝脾肿大为主要临床特征,其早期诊断和及时治疗具有重要的意义.
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基于PCR的几种分子检测技术在布鲁氏菌鉴定中的应用
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体引起的人兽共患传染病,常造成牲畜流产和人类多器官的损害.布鲁氏菌属基于宿主特异性分为6个种19个型:马耳他布鲁氏菌(羊型布鲁氏菌)3个型、流产布鲁氏菌(牛型布鲁氏菌)8个型、猪布鲁氏菌5个型和犬种布鲁氏菌、林鼠布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌各1个型口],其中,引起人类疾病的主要有羊、牛、猪和狗布鲁菌.
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PCR检测方法在陕西省布鲁氏菌种型鉴定中的应用
目的 将PCR检测技术应用于陕西省布鲁氏菌的种型鉴定中,建立适用于该省的标准化分子分型技术,为布病防治提供科学依据.方法 用BCSP31-PCR及AMOS-PCR对收集的3株标准菌株羊16M、牛544A、猪1330S以及89株陕西省1957年以来保存的部分地方株进行种型鉴定.结果 菌14025、14045经BCSP31-PCR、AMOS-PCR均未条带,排除是布氏菌,与生化鉴定结果一致;其余菌株BCSP31-PCR均出现223 bp大小的条带;菌62018、74011、74012经AMOS-PCR出现285 bp左右条带,证实为猪1型菌株,菌92008未出现条带,该方法不能用于犬种菌的鉴定,其余菌株均出现731 bp左右的条带,为羊种菌.结论 PCR方法特异、快速、准确,在实际工作中,可用BCSP31-PCR方法鉴定到属,AMOS-PCR检测方法鉴定到种,可作为布鲁氏菌种属快速鉴定方法之一.
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河南省登封市哨点医院布鲁氏菌病原学鉴定与分子型别研究
目的 分析河南省登封市2014-2016年30株布鲁氏菌的生物型别及PFGE分子分型特征,为布鲁氏菌病的病原学监测,暴发预警、溯源提供基线数据.方法 采集试管凝集试验(SAT)阳性病人静脉血10ml,双相血培养瓶培养与生化鉴定,AMOS-PCR鉴定布鲁氏菌生物型别;阳性菌株利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和BioNumerics7.0软件进行指纹图谱分析.结果 阳性病例以青壮年男性职业和密接人群为主;30株布鲁氏菌经鉴定28株为羊种,2株为牛种.羊种布鲁氏菌经脉冲场凝胶电泳后可分为2种带型,带型相似度在97.7％～100％之间;牛种布鲁氏菌可分为2种带型,带型相似度96.3～100％.结论 河南省监测哨点医院人感染布鲁氏菌存在羊种和牛种两种型别,羊种为优势型别;羊种与牛种菌株在PFGE带型特征上存在较大差异度.
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布鲁氏菌PFGE分子分型的条件优化
[目的]将PFGE方法应用于布鲁氏菌分型研究,探索建立布鲁氏菌PFGE分型的优化方法.[方法]在用PFGE方法进行布鲁氏菌基因分型的研究中,针对不同内切酶、酶切的浓度和时间、脉冲时间等影响PFGE分型结果的因素进行优化,利用优化后的条件对布鲁氏菌19株标准菌株进行分型研究.[结果]在布鲁氏菌的PFGE分型研究中,选择XbaI为内切酶、酶切浓度为96μ/200μl、酶切时间为4 h、脉冲时间为2～25 8为PFGE电泳的优化条件,在分析的19株布鲁氏菌标准菌株中,6种布菌的PFGE图谱各不相同,但PFGE不能将种内不同生物型布菌完全区分开来.[结论]PFGE方法可用于布鲁氏菌的基因分型的研究,是对传统分型方法一种较好的补充.
关键词： 脉冲凝胶电泳(PFGE) 布鲁氏菌 分子分型 -
PCR产物直接测序快速识别病原菌
[目的]结合PCR和DNA测序技术,建立一种适用于传染性疾病预防控制的快速准确地识别病原细菌的分子检测方法.[方法]以布鲁氏菌为例,利用PCR分别从纯培养物、模拟标本中扩增布鲁氏菌16S和31kd基因,并对扩增产物测序,与数据库进行比对,根据比对结果确定扩增产物是否来源于布氏菌.[结果]从纯培养物和模拟标本成功扩增特异产物,测定序列与数据库比对,能很快准确确定病原的种类,优于单纯的PCR扩增.[结论]结合PCR扩增和产物测序的分子检测方法切实可行,为疾病预防控制体系中病原菌的快速识别提供了一个快速、高效和准确的方法.
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布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定
[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26 基因的克隆、表达与测序,并对其进行初步的血清学鉴定.[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接,构建重组质粒PGEX-4T-1/bp26,在大肠杆菌中表达该蛋白.用western-blot鉴定重组表达的GST-bp26蛋白.[结果]成功构建了PGEX-4T-1/bp26原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白.[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础.
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布鲁氏菌外膜蛋白免疫蛋白质组学方法的建立
目的 建立布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,筛选布鲁氏菌保护性抗原.方法 利用双向电泳技术对实验条件下培养的布鲁氏菌疫苗株M5外膜蛋白进行分离,结合WB(Western blotting)技术寻找发生免疫反应的蛋白质.结果 21个免疫蛋白点经胶内酶切、肽提取后用基质辅助激光解析/电子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定.每个蛋白点的肽质量指纹图谱用Mascot进行检索后,代表了12个开放阅读框.这些蛋白不全是外膜蛋白,还存在胞浆蛋白,其功能涉及生物合成和物质代谢等领域,还有一个功能未知的蛋白.结论 成功建立了布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,为寻找保护性抗原及为新型疫苗抗原候选提供新思路.
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以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析
目的 构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础.方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd+-pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd+-pVAX1-BLS-L7/L12).以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价.结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生.通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主.结论 所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主.可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗.
关键词： 布鲁氏菌 BLS-L7/L12 DNA疫苗 伤寒沙门菌 平衡致死系统 -
CIP29对布鲁氏菌侵袭和巨噬细胞凋亡影响的初步研究
目的 研究CIP29在细胞中的定位及其对巨噬细胞凋亡和布鲁氏菌侵袭的影响.方法 通过RT-PCR方法从细胞中获取CIP29基因片段,并将其亚克隆入质粒载体pET28a和eGFP,构建原核表达质粒pET28a-CIP29和真核表达质粒eGFP-C IP29,原核表达质粒用于制备CIP29抗体,用于后续CIP29蛋白的检测;真核表达质粒用于转染巨噬细胞,通过荧光显微镜、Western blot技术检测CIP29在真核细胞中的表达及定位, Annexin-Ⅴ/PI双染检测其对细胞凋亡的影响,布鲁氏菌侵袭试验检测其对布鲁氏菌入侵巨噬细胞的影响.结果 获得了CIP29基因,构建的表达质粒pET28a-CIP29 和eGFP-CIP29经测序和双酶切鉴定,证实重组表达质粒构建成功.将pET28a-CIP29转化BL 21中,CIP29蛋白得到了表达,制备了特异性抗体,经ELISA检测效价达1∶25 600.进一步构建真核表达质粒eGFP-CIP29,转染细胞后,荧光显微镜观察结果显示其定位于核内,但也有部分扩散之胞质中,CIP29可诱导细胞的凋亡,但对布鲁氏菌侵袭的影响无统计学意义.结论 本研究获得CIP29重组蛋白,并制备了其多克隆抗体,CIP29瞬时高表达诱导巨噬细胞凋亡.
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布鲁氏菌引起的巨噬细胞依赖性树突状细胞迁移与免疫应答
目的: 研究阴道巨噬细胞清除后小鼠对布鲁氏菌疫苗的免疫应答机制.方法: BALB/c小鼠60只随机分为3组, 每组20只, 实验组小鼠阴道内滴注脂质体包裹的clodronate以清除阴道巨噬细胞, 3 d后阴道滴注10 μL布鲁氏菌疫苗(含6×108个布鲁氏菌).同时设空脂质体对照组(不含clodronate)和PBS对照组.依次在12、 24、 36、 72 h收集小鼠阴道、髂内淋巴结和血液.采用免疫组织化学染色法观察阴道巨噬细胞清除效果和树突状细胞(DC)的迁移, 并用ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-4的含量.收集小鼠腹腔液制备巨噬细胞进行细胞培养, 1.2×106个巨噬细胞中加入布鲁氏菌疫苗10 μL, 于不同时间点对巨噬细胞进行姬姆萨染色, 观察巨噬细胞的变化.结果: 清除巨噬细胞组小鼠接种布鲁氏菌疫苗后, 髂内淋巴结中S-100阳性DC数量没有明显的变化, IFN-γ和IL-4的含量也没有明显的升高.非清除组中, 不同的时间点, 髂内淋巴结中S-100阳性DC明显增多, 与PBS对照组相比, IFN-γ含量显著增高, 而IL-4则没有明显变化.体外巨噬细胞负载布鲁氏菌疫苗发现, 随着时间的延长, 巨噬细胞吞噬布鲁氏菌逐渐增多, 在12 h, 巨噬细胞开始出现坏死性凋亡.结论: 小鼠在对布鲁氏菌疫苗的免疫应答中, DC的迁移是巨噬细胞依赖性的, 并且这种依赖性有可能是由布鲁氏菌抗原成分在细胞间间接传递引起的.
