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福建省首次从人体分离到的布鲁氏菌的初步研究
目的 对从人体分离到的5株布鲁氏菌进行种型鉴定.方法 常规确定布鲁氏菌属与种型鉴定.结果 FJFZ0609菌株由于菌型特殊,难以定种;FJ
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布鲁氏菌BP26蛋白的表达纯化及其抗原性的研究
目的 获得布鲁氏菌感染血清学诊断优势抗原BP26重组蛋白.方法 应用PCR技术从布鲁氏菌减毒株(104M)中扩增出bp26目的 基因片段,将其克隆于表达载体PET30a中,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,用亲和层析纯化BP26重组蛋白,然后分别用Western-blot,间接ELISA检测其抗原性.结果 DNA测序及酶切鉴定证实PET-30a/bp26原核表达载体构建成功,并在大肠杆菌中高效表达,免疫印迹和间接ELISA实验证明BP26重组蛋白可与布鲁氏菌阳性血清产生特异性结合.结论 成功获得了布鲁氏菌中序列全长为696bp,编码232个氨基酸的BP26蛋白,通过血清学反应证实,该蛋白为人和动物布鲁氏菌病临床诊断试剂盒的研发奠定了基础.
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布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5差异探索
目的 探索布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5之间的差异.方法 用气相色谱测定两株菌的脂肪酸组成,用脉冲场凝胶电泳方法电泳两株菌的DNA酶切产物,寻找两者在脂肪酸组成和酶切电泳图谱上的差异.结果 两株菌在脂肪酸的种类上一致,但含量有差异,强毒株16M脂肪酸16∶0含量较疫苗株M5高10%左右,而脂肪酸19∶0 CYCLO ω8c较疫苗株M5低15%左右.脉冲场凝胶电泳图谱显示在167.1kb和138.9kb之间强毒株16M比疫苗株M5多出一个条带.结论 脂肪酸分析和脉冲场凝胶电泳技术都可以用于鉴别布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5.
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广东省布鲁氏菌分离株的分子特征分析
目的 了解广东省布鲁氏菌分离株的分子特征.方法 应用传统分型鉴定方法和PCR扩增布鲁氏菌属特异性基因BCSP31,对广东省历年布鲁氏菌分离株作鉴定分型,进一步采用脉冲场电泳技术(PFGE)进行分子分型,分析比较菌株分子指纹图谱的相似性,以探讨不同年份和地域菌株之间的相关性.结果 1965年广东省布鲁氏菌分离株以羊种和猪种为主,1985年的分离株均为猪种3型,2006和2007年的分离株均为羊种3型;PFGE电泳图谱经聚类分析结果显示,历年布鲁氏菌分离株分成三大簇(Clusters):1965年羊种、1965年猪种与1985年猪种3型、2006年和2007年羊种3型.近两年珠三角地区布鲁氏菌病的流行优势菌型为羊种3型,且同源性达100%,但与1965年羊种分离株的同源性只有77.7%.结论 近两年我省布鲁氏菌的优势菌型为羊种3型,各地区分离株之间的遗传关系高度相关,与20年前的分离株同源性差.PFGE可作为传统生物分型的补充手段,可在种的水平对布鲁氏菌分离株分型.
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nested-PCR试剂盒检测牛精液中的布鲁氏菌DNA
目的 布鲁氏菌是兼性细胞内寄生菌,能够在吞噬细胞内长期存活并繁殖,引起家畜流产和人的波浪热.根据病原性和感染宿主的不同将布鲁氏菌分为六个种,能否快速、有效地从各种病料中检出布鲁氏菌,对及时控制布鲁氏菌在家畜中的传播和预防对人的感染十分重要.方法 2006年6月,宁夏某公司奶牛场工作人员送检3份奶牛冻干精液, 用巢式PCR检测出其中的2份为布鲁氏菌感染阳性,这年8月,重复取这2头种公牛的冻精、鲜精复查.结果 用本方法 检测全部为布鲁氏菌感染阳性.结论 这是国内首次用巢式聚合酶链反应(nested-PCR)试剂盒从送检的牛精液中检出了布鲁氏菌DNA片段.
关键词： 布鲁氏菌 Nested-PCR 牛精液 检测 -
布鲁氏菌VirB8-PCR方法的建立
目的 建立VirB8-PCR方法 ,用于布鲁氏菌病的诊断和致病力因子的检测.方法 以布鲁氏菌病致病力因子--四型分泌系统中的VirB8基因为模板,设计引物,建立VirB8-PCR方法 ,优化反应条件和程序,对布鲁氏菌标准株、疫苗株和当地分离株进行检测.结果 13株布鲁氏菌标准株和6株疫苗株PCR检测结果 均为阳性;沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、结核杆菌和链球菌均为阴性;检测11株当地分离株,9株也为阳性,2株为阴性.PCR检测特异性为100%,敏感性为153fg DNA(相当于30个菌).结论 VirB8-PCR方法 特异、敏感,能用于布鲁氏菌病的监测和致病力因子的检测.
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建立双抗原夹心酶免疫试验对人畜布鲁氏菌抗体检测的研究
目的 为人畜布鲁氏菌病(布病)的血清学诊断、监测及流行病学调查提供特异、敏感、快速的试验方法.方法 在制备高滴度的布鲁氏菌(布氏菌)抗原及其抗原辣根过氧化物酶结合物基础上.建立了检测人畜布氏菌抗体的双抗原夹心酶免疫试验(DAgS-EIA),包括常规双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)、双抗原夹心酶免疫斑点试验(DAgS-DIEA)以及快速双抗原夹心ELISA(快速DAgS-ELISA),并对影响本试验的主要因素因素进行了试验.结果 制备了高滴度的布氏菌抗原及其抗原酶结合物和冻干制品.并在此基础上,建立了常规DAgS-ELISA及DAgS-DIEA以及快速DAgS-ELISA检测人畜布氏菌抗体方法.经对115份布病患者血清检测结果,阳性率以DAgS-ELISA为高(61.7%),其余依次为RBPT(58.1%)、I-ELISA(55.6%)、DAgS-DIEA(53.7%)、及SAT(44.2%)且用DAgS-EIA检测布氏菌感染羊、牛、猪及实验动物家兔、豚鼠和小鼠均为强阳性反应,而对正常人、羊、牛、猪及实验动物血清均为阴性反应.结论 双抗原夹心酶免疫试验检测人畜血清布氏菌抗体,不仅特异、敏感、快速、简便而且仅需制备单一的布氏菌抗原酶结合物就可对人及各类动物血清布氏菌抗体进行检测.
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羊种布鲁氏菌OMP16蛋白结构的生物信息学分析
目的 使用生物信息学方法预测羊布鲁氏菌OMP16蛋白的结构特点,并预测可能的B细胞和T细胞优势表位.方法 从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的OMP16蛋白的氨基酸序列.通过ProtParam分析OMP16蛋白的理化性质;利用DNAstar和SOMPA分析OMP16蛋白二级结构;利用Phyre2和Rasmol构建并分析OMP16蛋白三级结构;利用IEDB、DNAStar、ABCpred和BepiPred预测OMP16蛋白的B细胞抗原表位;利用SYFPEITHI和IEDB预测OMP16蛋白的T细胞抗原表位.结果 OMP16蛋白有426个氨基酸序列,理论等电点为9.72,原子组成为C2026H3209 N499O536S17,为稳定性疏水性蛋白.二级结构显示α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别是40.61％,19.01％,8.45％和31.92％.预测出4个B细胞优势表位,分别是93-102,183-187,273-289,294-301;5个CTL细胞优势表位,分别是69-77,175-183,267-275,373-381,408-416;5个Th细胞优势表位,分别是4-20,32-46,63-77,316-330,352-366.结论 羊布鲁氏菌OMP16蛋白结构中有4个B细胞优势表位,5个CTL细胞优势表位和5个Th细胞优势表位,为进一步为布鲁氏菌诊断和疫苗研究的奠定基础.
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MALDI-TOF-MS鉴定布鲁氏菌方法建立和评价
目的 为了快速、准确、便捷的检测和鉴定布鲁氏菌,本研究拟建立鉴定布鲁氏菌属的MALDI-TOF-MS方法,利用现场分离菌株对该方法进行特异性和敏感性评价.方法 收集布鲁氏菌标准菌株和地方流行株,应用MALDI-TOF-MS采集图谱,获取独特的蛋白质指纹图谱,汇总成标准图谱,建立布鲁氏菌鉴定数据库.并用39株布鲁氏菌菌株,对建立的数据库进行验证.结果 经数据库鉴定,39株布鲁氏菌菌株与数据库中布鲁氏菌的匹配分数全部大于2.300,均报告为布鲁氏菌,表明鉴定结果的可信度很高.聚类分型结果表明,在蛋白质水平,MALDI-TOF-MS将测试的布鲁氏菌分成3大类.结论 MALDI TOF-MS对布鲁氏菌进行鉴定,具有快速、准确、灵敏等优点,可以实现对布鲁氏菌属的准确鉴定,对布鲁氏菌病的临床诊断具有较高的使用价值.
关键词： 布鲁氏菌 MALDI-TOF-MS 鉴定 -
利用多重聚合酶链反应和多色毛细管电泳分析布氏菌多位点可变数目串联重复序列
目的 传统的布鲁氏菌多点可变数目串联重复序列分析方法涉及16个位点(MLVA-16),包括单重聚合酶链反应和琼脂糖凝胶电泳,一直以来都作为标准的基因分型方法,用于布病的病原监测和流行病学调查.然而,目前这种传统方法工作量较大,实验室间结果不宜比较;尤其是对大规模菌株进行基因分型或面临突发疫情时,急需一种高通量且快速的方法.方法 用多重PCR和多色毛细管电泳方法建立一种可靠的,高通量的且自动化程度较高的MLVA-16改良分型系统,用82株菌进行测试.结果 这种改良的MLVA-16分型系统具有很高的准确性,且具有快速和高通量的特点.结论 改良的MLVA-16分型系统可用于基层布病实验室,为布病的病原监测提供高效的工具.
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多重荧光定量PCR方法鉴定布鲁氏菌属及牛羊种布鲁氏菌研究
目的 利用多重实时荧光PCR技术,建立快速鉴定布鲁氏菌的方法.方法 根据布鲁氏菌特异性基因BCSP31,AlkB/IS711和BMEI1162/IS711的部分片段作为靶基因,分别设计探针引物,将扩增产物连接到PUCm18-T载体上,制备标准品及标准曲线,确定此方法的灵敏度.利用布鲁氏菌的其他生物型菌株和同源性较近的致病菌(汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O157∶H7、大肠杆菌O∶16、小肠结肠炎耶尔森菌O∶9、沙门氏菌N群血清型、嗜麦芽假单胞菌)验证所建立方法的特异性.通过布鲁氏菌标准菌株建立方法,优化体系后扩增97株地方株进行验证.结果 应用多重TaqMan荧光PCR技术检测布鲁氏菌结果显示,布鲁氏菌属、牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌有各自的荧光信号,而与其同源性较高的致病菌均未见荧光信号;由标准曲线可知该方法的单重和多重荧光PCR低检测下限均约为102copy/μL(13~24 fg /μL),是常规PCR灵敏度的100倍.结论 建立的方法有灵敏度高、快速易操作等优点,可用于布鲁氏菌快速鉴定,并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌.
关键词： 布鲁氏菌 荧光定量聚合酶链式反应 鉴定 评价 -
布鲁氏菌减毒活疫苗株的比较基因组学研究
目的 探究布鲁氏菌减毒活疫苗株与亲本株的分子遗传差异.方法 通过布鲁氏菌全基因组DNA芯片对4株减毒活疫苗株进行比较基因组学研究.结果 通过比较基因组学研究,发现疫苗菌株中存在大片段基因缺失,同时发现一些基因以多拷贝形式存在.4株减毒活疫苗株分别缺失不同数目的功能基因,主要为胞内活动有关基因和功能未知基因(分别为31和45个).较深入地认识了布鲁氏菌减毒活疫苗株基因构成上的差异.结论 与亲本株相比,4株减毒活疫苗株缺失大量基因,构成了不同疫苗株差异的遗传基础.
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我国羊种3型布鲁氏菌的多位点序列分型研究
目的 对2004-2009年从病人标本中分离的羊种3型布鲁氏菌进行遗传多态性分析,了解菌株的遗传特征及遗传进化关系.方法 采用多位点序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)技术,对47株布鲁氏菌菌株的7个管家基因、1个外膜蛋白基因及1个基因间区的序列进行测定,将各个基因的序列与标准菌株的等位基因型进行比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型(STs),分析与其它ST型间的遗传关系.结果 47株布鲁氏菌中,19株omp25基因与目前已有的等位基因型不同,被定义为1个新的等位基因型,即ST28.其余28株与已知的ST8型的各等位基因型一致.结论 我国流行的羊种布鲁氏菌主要是羊3型菌株,国内的菌株与国外菌株遗传背景上有差异.MLST分型可以作为研究布鲁氏菌进化关系的重要手段之一.
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布鲁氏菌的脂肪酸分型研究
目的 探索脂肪酸分型方法对布鲁氏菌进行分型的可能性.方法 选择90株布鲁氏菌经化学方法提取菌体脂肪酸后,用气相色谱分析,获得布鲁氏菌脂肪酸成分的数据资料.并利用SPSS11.5统计软件对获得的数据资料进行聚类分析.结果 布鲁氏菌脂肪酸分型方法将90株布鲁氏菌分为5组:第1组为部分牛种菌;部分羊种菌;部分猪种菌;部分绵羊附睾种;部分变异牛种;部分变异羊种;沙林鼠种标准株.第2组为猪种1、2、3、5型标准株和疫苗株S2;羊种疫苗株M28和Rev.1;绵羊附睾种标准株.第3组为部分羊种;部分变异羊种菌;部分牛种3型和6型;犬种;部分绵羊附睾种.第4组为犬种菌标准株.第5组为部分羊1型;部分变异羊种;部分牛1型;部分猪1型和3型.结论 依据布鲁氏菌菌体脂肪酸含量差异可以对布鲁氏菌进行分型;依据19:0CYCLOω8c,18:1ω7c,16:0三种脂肪酸含量差异可以区分猪种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌;脂肪酸分型结果进一步提示犬种布鲁氏菌不只1个生物型;脂肪酸分型结果进一步证实牛3型和牛6型布鲁氏菌高度同源.
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福建省布鲁氏菌分离株的分子生物学鉴定
目的 利用分子生物学方法鉴定福建省布鲁氏菌分离株.方法 对布鲁氏菌分离株进行AMOS-PCR和MLVA分型.结果 3株福建省分离株经AMOS-PCR鉴定为羊种,与传统生物学分型一致;MLVA分型将其分为3个基因型,聚类分析鉴定为羊种.结论 AMOS-PCR、MLVA分型可以作为我省布鲁氏菌分离株鉴定的辅助手段.
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AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定的应用
目的 评价AMOS-PCR方法鉴定布鲁氏菌种型的特异性和实用性.方法 用已建立的AMOS-PCR方法在国内检测标准菌株和对国内分离的布鲁氏菌地方株种型进行检测.结果 羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌1,2,4、猪种布鲁氏菌1型和绵羊附睾布鲁氏菌有特异条带.结论 AMOS-PCR 是一种快速、简便、特异的鉴定布鲁氏菌的方法之一.
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羊种布鲁氏菌疫苗株M5和强毒株16M的比较蛋白质组学研究
目的 阐明羊种布鲁氏菌疫苗株M5致弱的分子基础,更加深入地理解布鲁氏菌的毒力机制.方法 利用双向电泳技术对相同条件下培养的羊种布鲁氏菌疫苗株M5和强毒株16M总蛋白进行分离,两株问差异蛋白点利用基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱技术进行鉴定.每个蛋白质点的肽指纹图谱均使用Mascot在NCBInr蛋白质数据库中进行检索.结果 共成功鉴定了13个差异蛋白,代表了8种不同的开放阅读框(ORFs),功能涉及能量代谢,应激,物质运输等.结论 上述发现为羊种布鲁氏菌疫苗株M5致弱分子基础的阐明提供了新依据.
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布鲁氏菌bp26和OMP10基因的原核表达和鉴定
目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和 bp26基因的表达、克隆与测序,并对其进行初步的血清学鉴定.方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP10和bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP10和 PGEX-4T-1/bp26,在大肠杆菌中将该蛋白表达.用western-blot 分析重组表达的GST-OMP10和GST-bp26的免疫学特性.结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-4T-1/bp26原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了OMP10和 bp26基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白.结论布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和 bp26 基因的成功表达,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础.
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AFLP法构建布鲁氏菌基因组DNA指纹图谱
目的采用扩增片段长度多态性(AFLP)分子遗传标志技术,分析布鲁氏菌基因组DNA多态性.方法提取布鲁氏菌基因组DNA,经EcoRI/MseI酶切并与相应的人工接头连接后,使用选择性引物进行PCR扩增.结果经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,成功构建出多态性丰富、重复性好的布鲁氏菌DNA指纹图谱.结论 AFLP法有望成为一种独立的切实可行的方案,在布鲁氏菌的多态性研究和流行病学调查中发挥作用.
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布鲁氏菌AP-PCR优反应体系的建立
目的建立布鲁氏菌的随机扩增DNA多态性的优化反应体系,用于布鲁氏菌分子流行病学研究.方法利用几种随机引物及其组合(P1、P2、P3、P4、P5、OPLO4、P3/5、P4/5)进行随机引物PCR的反应(AP-PCR,又称RAPD), 及重复片断引物ERIC1R/ERIC2的随机扩增多态性;另外针对优选引物P5和OPLO4,分别对Mg2+浓度、dNTPs浓度、模板DNA浓度、引物的浓度及扩增过程中的退火温度等影响反应结果的因素,进行了一系列优化组合方案的试验及系统分析.结果引物P5、OPLO4和引物组合P4/5可以得到布鲁氏菌的高分辨率的分型带谱,并建立相应的优化反应体系.结论在严格的优化反应条件下,建立简单、快捷、灵敏度高的RAPD方法,用于布鲁氏菌的DNA多态性研究,为布鲁氏菌分子流行病学的深入研究提供资料.
