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热原诱导的Toll样受体信号传导通路研究进展
本文概述了脂多糖、脂磷壁酸和酵母多糖这3种常见热原诱导炎症细胞分泌细胞因子,发生炎症反应的机制.重点介绍了热原的分类以及这三种热原的胞外传递过程和相应Toll样受体介导的胞内信号传导通路.
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血管平滑肌细胞增殖与迁移的机制研究
目的:血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖与迁移在动脉粥样硬化(AS)的早期、中期或AS进展期或血管事件的发病机制中起着关键性作用.方法:采用改良的Boyden小室法检测VSMCs的迁移效应;以MTT法、[3H]-Tdr掺入法、[3H]-脯氨酸标记法和VSMCs计数评价VSMCs的增殖效应;将培养的VSMCs分为5组;2%胎牛血清(2%FCS)组、AngⅡ组(其浓度为10-10～10-6mol/L)、 Losartan组(其浓度为10-7～10-5 mol/L)、 MCP-1 mcAb组(终浓度为10 μg/mL)和阳性对照组(含5%的酵母多糖活化血清).
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脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞株耐受与致敏并存的研究
目的:全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官衰竭(MODS)时血中出现多种炎症介质,一般认为这是白细胞致敏(primed)的结果.我们用巨噬细胞株作为研究对象,建立了代表单克隆细胞水平耐受与致敏并存的细胞模型,并对其机制做了初步探讨.方法:巨噬细胞株RAW 264.7以不同刺激作用后测上清中TNF-α(L929杀伤活性)、NO(Griess反应)、IL-1(胸腺细胞增殖,MTT法)和细胞内游离浓度([Ca2+]i,用荧光显微镜成像系统,Frua-2负载).结果至少重复6次.结果及结论:10 ng/mL LPS预处理(pretreat)18 h,洗去,加入100 ng/mL LPS攻击(challenge) 24 h, TNF-α和NO分别由未预处理组的7.3±1.7 ng/mL和29.7±3.2 μmol/L减少到1.2±0.5 ng/mL和20.2±1.9 μmol/L(P＜0.05),说明已诱导了耐受;同时,IL-1由未预处理组的0.50±0.02 pg/mL增至3.30±0.08 pg/mL(P＜0.05),说明LPS耐受细胞也可出现高反应,即LPS预处理对TNF-α和NO来说是诱导耐受,而对IL-1来说却起到了致敏作用.10 ng/mL LPS预处理18 h后用15 μg/mL MDP、1 μmol/L fMLD、1 mg/mL酵母多糖及1 μg/mL PMA攻击,则NO分别由未预处理组的5.1±1.2、4.2±0.9、14.4±2.7和8.1±3.1 μmol/L增至16.9±2.5、12.9±1.9、18.8±3.1和26.4±3.8 μmol/L(均P＜0.05);而TNF-α在酵母多糖组不变,在PMA组由未预处理组的3.8±0.7降至0.8±0.4 ng/mL(P＜0.05).结论:LPS在同一细胞克隆确可同时诱导耐受和致敏,而判断耐受或致敏应由特定攻击条件和特定的检测指标决定.
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抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2对酵母多糖诱发小鼠腹膜炎的影响
目的 观察抗小鼠TLR2胞外段(mTLR2ECD)单表位抗体TSP-2对酵母多糖诱发的小鼠腹膜炎的主要作用.方法 用腹腔灌洗、细胞计数及特异染色、免疫组化、ELISA 等各种方法检测了抗体TSP-2对模型动物的扭身次数、腹腔灌洗液的伊文思兰渗出、腹腔白细胞浸润的数量变化、腹腔肥大细胞脱颗粒情况以及腹腔灌洗液离心上清中PAF和TNFa水平的影响.结果 与PBS处理组和正常兔IgG组相比,抗体TSP-2能促使小鼠因腹腔炎症引起的扭身次数减少,腹腔灌洗液中伊文思蓝OD值降低,腹腔灌洗液中白细胞渗透减少以及C48/80诱导的腹腔肥大细胞脱颗粒降低.结论 抗体TSP-2可能通过对肥大细胞脱颗粒的抑制作用减轻酵母多糖诱导的小鼠腹膜炎炎症症状.
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酵母多糖对体外培养小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的增强作用
目的:探讨酵母多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、产生NO和IL-1的影响.方法:将不同剂量的酵母多糖加入体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中,检测巨噬细胞的吞噬能力,取细胞培养上清液根据Griess反应检测NO2的量间接反映巨噬细胞产生NO的生成量,并用MTT比色法检测上清液中IL-1的生成量.结果:酵母多糖可明显促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用,并能促进巨噬细胞产生NO和IL-1,且NO的生成量呈现剂量依赖关系.结论:体外酵母多糖对小鼠腹腔巨噬细胞有免疫增强作用.
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补体旁路活化对血小板形态的影响
目的:探讨酵母多糖A活化补体旁路对SD大鼠血小板形态的影响.方法:采集健康SD大鼠颈动脉血,制备富血小板血浆,分别加入((1.0、2.5、5.0)×10-3 g/L酵母多糖A,用血小板聚集仪测定血小板聚集曲线,电镜观察血小板的超微结构.结果:5.0 ×10-3g/L酵母多糖A可引起血小板明显的变形和轻微的聚集.酵母多糖A在(1.0、2.5、5.0)×10-3g/L范围内,血小板的变形幅度与酵毋多糖A剂量对数呈正相关(r=0.7835,P<0.01).电镜观察见活化的血小板变形,有伪足样突起,胞质内颗粒减少或融合.结论:酵母多糖A可经补体旁路活化SD大鼠血小板,使血小板发生变形和释放胞质颗粒.
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新鲜血对自体血浆致敏酵母多糖快速免疫反应的实验研究
目的:建立一个简便、快速、准确地检测血液免疫功能的方法.方法:在自然条件下,以新鲜全血和自体血浆致敏酵母多糖为实验对象.该方法能同时、快速检测粒、红细胞免疫粘附功能.结果:在用此方法对临床病例的检测中,发现肿瘤、自身免疫性疾病病人红细胞即时免疫功能明显下降,而粒细胞疫功能变化不明显.结论:说明红细胞免疫在基础免疫和临床应用中的地位应引起充分的重视.
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酵母多糖引发MODS机制及其干预的实验研究进展
多器官功能障碍综合征(MODS)是多种打击诱发的临床综合征。鼠腹腔注射酵母多糖后会引发逐渐严重的器官损伤和功能障碍。酵母多糖引发全身炎症反应(ZIGI)的动物模型被认为与人类MODS发病机理相似，而且ZIGI已被广泛使用研究系统性炎症反应致多器官损伤的机制。本文就近年来有关ZIGI模型的病理生理机制及新治疗成果做一综述。
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吴茱萸碱对酵母多糖诱导急性腹膜炎小鼠的保护作用
目的 探讨吴茱萸碱(evodiamine,EVO)对酵母多糖(zymosan,ZYM)诱导的小鼠腹膜炎中炎症反应及中性粒细胞(polymorphonuelear neutrophil,PMN)浸润的影响.方法 将54只成年雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组和EVO治疗组.模型组腹腔注射1 mg/mLZYM溶液(1 mL)建立急性腹膜炎小鼠模型,EVO治疗组则同时腹腔注射10 mg/kg EVO及1 mg/mLZYM溶液,正常对照组腹腔注射等量磷酸盐缓冲液.各组处理后2、6、12 h处死6只小鼠,收集眼眶血及腹腔灌洗液.采用酶联免疫吸附法检测血清及腹腔灌洗液中白介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、角化细胞来源趋化因子(keratinocyte-derived chemokine,KC)及巨噬细胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein 2,MIP-2)的含量;通过血细胞计数板计数腹腔灌洗液中混合细胞总数;利用流式细胞仪检测腹腔灌洗液中PMN比例及PMN中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;采用Western blot检测6h时腹腔灌洗液混合细胞中核转录因子-kB(nuclear factorκB,NF-κB) p65入核情况.结果 建模后2、6、12 h,模型组血清及腹腔灌洗液中IL-6、TNF-α、KC及MIP-2含量均高于正常对照组(P＜0.05),EVO治疗组上述指标均较模型组明显降低(P＜0.05),其中,血清中IL-6、KC及MIP-2均于2h达高峰,随后逐渐下降,而TNF-α在2h逐渐上升,6h达到高峰,随后逐渐下降;腹腔灌洗液中TNF-α、KC及MIP-2均于2h达高峰,随后逐渐下降,而IL-6在2h逐渐上升,6h达到高峰,随后逐渐下降.制模后6h,EVO治疗组可显著降低腹腔混合细胞数与PMN数及其百分比(P＜0.05),且PMN中ROS显著降低(P＜0.05).另EVO治疗可显著降低腹腔混合细胞中细胞核的NF-κB p65表达(P＜0.05).结论 EVO可抑制ZYM诱导急性小鼠腹膜炎模型中血清及腹腔灌洗液中炎症因子及趋化因子的分泌,减轻腹腔PMN的浸润,并抑制PMN中ROS的产生,该作用可能是通过抑制NF-kB p65入核实现的.
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吴茱萸碱对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用
目的 探究吴茱萸碱(evodiamine,EVO)对酵母多糖(zymosan)诱导的急性肺损伤的保护效应及其作用机制.方法 24只6～8周龄雄性C57BL/6小鼠,按随机数字表法分为正常对照组、EVO对照组、模型组、EVO治疗组,每组6只.各组分别于处理作用12 h后处死小鼠,收集眼眶血及肺组织.酶联免疫吸附法(ELISA)检测血液及肺组织中白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-0(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平及肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性及核转录因子NF-κBp65的DNA结合活性,TUNEL法检测肺组织细胞凋亡情况,HE染色观察肺组织病理改变并测量肺湿干质量比.结果 酵母多糖作用12h后,小鼠出现精神萎靡、活动减少等症状.EVO治疗组小鼠状态有所好转.EVO可明显改善酵母多糖所致的肺泡壁毛细血管扩张充血及炎性细胞浸润,降低肺湿干质量比,并显著下调酵母多糖刺激下血清和肺脏中IL-6和TNF-α的含量(P＜0.01),同时抑制肺组织中MPO含量以及NF-κB p65的DNA结合活性(P＜0.01).结论 EVO可缓解酵母多糖诱导的急性肺损伤.该作用可能是通过抑制NF-κB的活性以减少炎症介质释放实现.
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炎症因素在泡沫细胞形成中的作用及三七皂苷对其影响
目的探讨炎症因素在小鼠腹腔巨噬细胞来源泡沫细胞形成中的作用及三七皂苷对其影响.方法在传统泡沫细胞形成模型基础上添加炎症刺激因素及三七皂苷,培养后,油红O染色观察泡沫细胞的形成,检测细胞内总胆固醇的含量,取细胞培养液测定TNF-α和IL-1的含量.结果酵母多糖能够明显增加细胞内脂质的沉积,同时伴有细胞产生TNF-α和IL-1的增加,三七皂苷可以明显减少由炎症因素引起的脂质沉积的增加,并同时减少炎症细胞因子的产生.结论炎症因素可以明显促进泡沫细胞的生成,三七皂苷可通过其抗炎活性干预这一过程.
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啤酒酵母多糖提取工艺的研究
酵母多糖是酵母细胞壁的重要组成部分,其主要成分为大分子的甘露聚糖及糖蛋白复合物,酵母多糖占酵母细胞壁干重的40%左右[1].研究表明酵母多糖具有多种重要生物活性,如增强免疫功能、抗病毒、抑制肿瘤生长等[2,3].目前我国大部分啤酒生产厂家对废弃啤酒酵母没有很好地开发利用,且造成环境污染和资源浪费.本研究以重庆某啤酒厂废弃啤酒酵母泥为原料,对酵母多糖提取工艺进行试验研究,为废弃啤酒酵母的综合开发利用积累资料.
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酵母多糖血凝实验检测单疱病毒性角膜炎患者红细胞免疫功能的临床应用
目的 探讨酵母多糖血凝实验在检测单疱病毒性角膜炎(HSK)患者红细胞免疫功能方面的临床应用价值.方法 应用酵母多糖血凝实验检测43例HSK患者(其中活动期15例,非活动期28例)的红细胞免疫功能.并以45例健康献血者为正常对照组.结果 HSK患者红细胞免疫黏附血凝阳性滴度显著低于健康者,差异有统计学意义(P＜0.05);而两组补体稀释滴度比较差异无统计学意义.结论 酵母多糖血凝实验可以检测HSK患者红细胞免疫功能,HSK患者红细胞免疫功能较健康者明显降低,该实验对HSK患者的疗效判断及愈后评估具有一定的参考价值.
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阿司匹林和谷胱甘肽对酵母多糖诱导的小鼠肝肿瘤坏死因子-α基因表达的抑制作用
目的在分子水平上研究阿司匹林和谷胱甘肽(GSH)对酵母多糖诱导的小鼠肝组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达的影响.方法分别给予小鼠低、高剂量阿司匹林(9mg、16mg*kg-1,ig)及GSH(20mg*kg-1,ip),然后给予酵母多糖(0.5g*kg-1,ip).逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织TNF-αmRNA水平,放射免疫分析法检测TNF-α蛋白水平.结果损伤组肝组织TNF-αmRNA及蛋白水平均显著高于对照组;低、高剂量阿司匹林保护组和GSH保护组肝组织TNF-αmRNA、蛋白水平都低于损伤组.结论阿司匹林和GSH均可抑制由酵母多糖诱导的小鼠肝组织TNF-αmRNA及蛋白的表达.
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脱水淫羊藿素对腹膜炎小鼠的保护作用
目的 研究脱水淫羊藿素(AHI)对酵母多糖诱导的小鼠腹膜炎的影响.方法 采用酵母多糖诱导腹膜炎模型,观察各组小鼠的生存情况,收集腹腔液,分别进行白细胞计数,Griess试剂联合酶标仪检测一氧化氮(NO)、流式细胞术检测小鼠腹腔渗出液中IL-6、IL-10、TNF-α、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的水平；采用Fluo4-AM标记,激光扫描共聚焦显微镜实时检测AHI对骨髓巨噬细胞钙离子内流的影响；Western blot法检测AHI对一氧化氮合酶(iNOS)的影响.结果 4 mg/kg体质量的AHI能提高腹膜炎小鼠的存活,减少腹腔白细胞的数量,降低NO、IL-10、TNF-α、MCP-1、IL-6的分泌；5μmol/L的AHI能抑制小鼠巨噬细胞的钙内流和iNOS的表达.结论 AHI对酵母多糖诱导的腹膜炎小鼠具有保护作用,可能与抑制巨噬细胞的钙离子内流、iNOS表达有关.
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酵母多糖所致大鼠多器官功能衰竭中肾小球损伤与NF-κB p65活性的关系
目的:观察在酵母多糖所致大鼠多器官功能衰竭(MOF)中, NF-κB p65的活性与肾小球损伤的关系.方法: 将20只Wistar雌性大鼠随机分为MOF模型组和对照组, 每组各10只, 通过腹腔注射酵母多糖石蜡油悬液建立模型.24 h后, 取血检查肝、肾功能及进行血气分析, 并处死大鼠, 取肾组织进行HE染色、 PAS染色、 PASM染色及Masson染色, 并用免疫组化染色和ELISA法检测肾小球中NF-κB p65的活性.结果: MOF模型组血PO2、 pH值显著低于对照组; 而ALT和sCr的水平明显高于对照组(P<0.01).病理观察显示, MOF模型组大鼠的肾小球呈明显的增生性改变, 部分肾小球硬化, 肾小球及其周围可见大量的炎症细胞浸润; 肾小球内NF-κB p65的活性明显增强, 且与肾小球内的细胞数、基底膜系膜区的面密度呈正相关; 而与毛细血管袢的面密度呈负相关.结论: 酵母多糖所致大鼠MOF中肾小球的损伤可能与NF-κB p65的活性增强有关.
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酵母菌活性物质及多糖对红细胞免疫粘附能力的影响
用CD35单抗阻断实验研究酵母菌活性物质(yeast co mpetence products,YCP)和酵母多糖(zymosan A,ZA)增强红细胞免疫粘附能力并探讨其作用机理.结果显示:YCP和ZA组在CD35单抗阻断前RBC·C3bRR率分别为24.73±2.72,22.82 ± 3.66,与对照组(12.33±1.07)比较有非常显著性差异(P<0.001).CD35单抗阻断后R B C.C3bRR率分别为6.45±1.86、6.45±1.29,与阻断前比较有非常显著性差异(P <0.001).提示YCP和ZA能增强红细胞免疫粘附能力,其机理可能与红细胞膜上CR1表达增强有关.
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猪全血法体外检测热原的可行性研究
目的:研究猪全血法体外检测热原的可行性.方法:采用猪全血,与不同浓度的各类热原[细菌内毒素(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、酵母多糖]共同孵育20 h(37℃、5％CO2),以细胞因子(IL-1β、IL-6)为检测指标,用酶联免疫法(ELISA)检测孵育体系中相应细胞因子的含量,进行猪全血-IL-1β、IL-6法体外热原检测的方法研究.结果:猪全血经一定比例稀释后(猪全血:RPMI1640为1∶3),猪全血-IL-1β、IL-6法对LPS可检测到0.25 EU·mL-1,对LTA可检测到0.5 μg· mL-1,对酵母多糖可检测到16.0 μg· mL-1;且在该孵育体系下,猪全血-IL-1β法对LPS的低检测限为0.125 EU·mL-1,线性范围为0.125 ～0.5 EU·mL-1,r =0.9515;猪全血-IL-6法对LPS的低检测为0.0625 EU·mL-1,线性范围为0.0625 ～0.5 EU·mL-1,r =0.9926.结论:初步研究认为,猪全血-IL-1β、IL-6法适用于检测热原.
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激活补体对血小板的作用
目的:研究激活补体对血小板的作用和随后对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的作用.方法:用酵母多糖A激活补体观察血小板变形、凝血活酶表达和膜粘度的改变，观察酵母多糖A处理的富血小板血浆对内皮细胞和血管平滑肌细胞的生长、DNA含量和膜微粘度的影响.结果:酵母多糖A能引起富血小板血浆的血小板明显变形、膜微粘度增加和凝血活酶表达增加，但不引起经洗脱的血小板变形，新鲜的贫血小板血浆能恢复酵母多糖A引起的作用，但经眼镜蛇毒因子预处理后作用消失.酵母多糖A引起的血小板变形能被依他酸5 mmol/L、Mn2+10 nmol/L、河豚毒素40μmol/L或吲哚美辛100 μmol/L阻断.酵母多糖A处理的富血小板血浆上清液能抑制血管内皮细胞生长，但对血管平滑肌细胞生长有促进作用，促使血管平滑肌细胞进入G2期和M期，同时内浆网变粗和游离的核糖体出现，而内皮细胞的线粒体出现空泡.结论:激活补体引起血小板显著变形，损伤血管内皮细胞并使血管平滑肌细胞增殖.
