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中西医结合有效逆转乙肝肝纤维化的目标人群特征和作用机制
抗病毒西药具有病因治疗优势,中药具有抗肝纤维化优势,中西药联用优势互补可提高乙肝肝纤维化逆转率.从中西药物联用疗效提高的关键机制和其治疗应答的目标人群特征出发,围绕肝脏区域免疫微环境在肝病中的作用,提出"调节肝脏免疫微环境、恢复自然杀伤细胞对活化肝星形细胞的免疫杀伤功能是中药扶正化瘀方联合西药恩替卡韦有效逆转乙肝高度肝纤维化的主要机制"的科学假说.首先,采用传染病重大科技专项乙肝肝硬化临床生物样本,基于疗效分层与回归分析,发现中西医结合治疗有效人群主要生物学与中医证候特征,并通过组内、组间比较分析阐明该治疗方案的主要作用机制;其次,复制乙肝背景的肝纤维化动物模型,体内给药,检测肝内细胞表型功能及相互关系,探讨中西药联用对肝脏免疫病理调控机制;后,复制肝硬化动物模型,分离培养人肝脏细胞,阐明中药影响活化肝星形细胞对自然杀伤细胞负调控等细胞联系的作用特点,从而验证以上科学假说,终发现有效方案目标人群特征,阐明其主要治疗机制与中药作用特点,促进中西医结合肝病的精准医疗与基础研究发展.
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基于代谢组学的扶正化瘀方抗肝纤维化差异疗效机制研究探讨
同一疾病相同治疗却出现不同疗效，这是临床常见现象与中医学强调“同病异治”的原因所在。既往研究证实，中药新药扶正化瘀方抗乙肝肝纤维化的有效率为52％，为何另约一半患者未出现肝组织纤维化逆转？从这一问题出发，结合中医据病分证、疾病遗传背景差异等认识发展，基于代谢组学整体反应的特点，提出“对扶正化瘀方有效与无效的乙肝肝纤维化患者群存在内源性生物与外源性药物代谢组学的差异特征，且相互影响，构成该药物对乙肝肝纤维化同病同治而差异疗效的内在基础”的科学假说。首先动物实验，了解扶正化瘀方对肝纤维化模型生物代谢组的影响与药物代谢变化特点，继之以扶正化瘀方治疗乙肝肝纤维化患者，以组织纤维化病理评价疗效，将患者分为显效与无效2组，进行给药前后的生物与药物代谢组学检测、代谢网络分析，验证以上科学假说，阐明扶正化瘀方抗乙肝肝纤维化差异疗效的内在机制，明确该药物作用原理与佳适应证，促进中医学“同病异治”的科学诠释。
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扶正化瘀方对纤维化肝脏MMP-2活性及Ⅳ型胶原表达的影响
目的:探讨扶正化瘀方影响基质金属蛋白酶-2活性和Ⅳ型胶原蛋白表达的抗肝纤维化作用机制.方法:二甲基亚硝胺腹腔注射4周诱导大鼠肝纤维化模型,成模后治疗组以扶正化瘀方灌胃4周.检测血清肝功能、肝脏病理学、羟脯氨酸含量;免疫组织化学方法检测肝组织IV型胶原表达;Western印迹法分析肝组织Ⅳ型胶原、基质金属蛋白酶.2/9(matrixmetallopmteinases-2,MMP-2/9)、金属蛋白酶组织抑制物.2(tissue inhibitors of metalloproteinase.2,TIMP-2)表达水平;明胶酶图法检测肝组织MMP-2/9活性.结果:与正常大鼠比较,模型大鼠血清肝功能异常、肝组织炎症明显、肝组织Ⅳ型胶原表达与沉积增加,TIMP-2蛋白表达增加,MMP-2蛋白表达变化不明显,而MMP-2活性水平明显上升.扶正化瘀方显著减轻肝脏炎症和胶原沉积;减少Ⅳ型胶原蛋白表达和沉积;降低TIMP-2蛋白表达;抑制MMP-2活性.结论:扶正化瘀方可通过抑制肝脏Ⅳ型胶原病理增生沉积、下调MMP-2活性水平、减轻肝组织的破坏与重构而发挥抗肝纤维化的作用.
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扶正化瘀方对原代大鼠肝细胞中CYP450的影响
目的:采用原代大鼠肝细胞(PRH)研究扶正化瘀方(FZHY)对大鼠细胞色素P450酶(CYP450)的影响.方法:采用两步灌流法分离大鼠原代肝细胞,形成肝板结构后加入FZHY共培养24 h,换成含有4种CYP450同工酶(CYP1A2,CYP2C9,CYP2D6,CYP3A4)对应的特异性探针药物(非那西丁、甲苯磺丁脲、氢溴酸右美沙芬、睾酮)的培养基,培养2h后吸取上清液,利用UPLC-MS/MS对探针药物的代谢产物进行检测,考察FZHY对探针药物代谢产物生成量的影响,评价FZHY对PRH中CYP450代谢活力的影响.结果:PRH中CYP1A2,CYP2C9,CYP2D6与CYP3A4具有良好的代谢活力.4种探针药物在0 ～ 500μmol·L-1内对PRH没有毒性,在0.5～500 μg·L-1时,FZHY对PRH没有毒性.FZHY在5μg·L-1时对PRH具有轻微的保护作用,并能使甲苯磺丁脲的代谢活化值——米氏常数(Km)降低20.8％;氢溴酸右美沙芬的Km降低39.2％;非那西丁的Km降低17.4％;并使睾酮的Km显著降低.结论:FZHY能抑制原代大鼠肝细胞中CYP1 A2,CYP2C9,CYP2D6和CYP3A4的代谢活性.
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扶正化瘀方对大鼠肝脏与肾脏并存纤维化的影响
本项研究用DMN腹腔注射合喂饲重金属,同时诱导大鼠肝纤维化和肾间质纤维化病变,造成多器官纤维化的动物模型,观察扶正化瘀方对该模型的干预作用,从而为多器官纤维化的治疗提供有效手段.
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扶正化瘀方对大鼠纤维化肺组织MMP-2活性与Ⅳ型胶原表达的影响
目的:观察扶正化瘀方影响肺组织MMP-2活性与Ⅳ型胶原表达的抗肺纤维化作用机制.方法:一次性气管内注射博来霉素诱导肺纤维化模型,分模型对照组、扶正化瘀方组、甲强龙组,每组各14只模型大鼠.另设正常组10只,一次性气管内注射等量生理盐水.造模次日扶正化瘀方组予以4.6 g·kg-1大鼠体重的扶正化瘀方灌胃;甲强龙组予以15 mg·kg-1大鼠体重的甲强龙腹腔注射,正常组和模型组灌喂等量生理盐水;每日1次,共4周.Masson染色观察肺组织胶原沉积,称量肺重量与计算肺系数,Jamall氏法测定肺组织羟脯氨酸含量,明胶酶图法检测肺组织MMP-2与MMP-9的活性,Western blot检测肺组织MMP-2,MMP-9和Ⅳ型胶原的蛋白表达量.结果:与正常组比较,模型组肺系数明显增加,肺组织胶原沉积明显,Hyp含量、Ⅳ型胶原、MMP-2与MMP.9蛋白表达增加,MMP-2活性水平升高,尤其是活性型MMP-2活性升高明显,而MMP-9活性略有下降.与模型组比较,扶正化瘀方与甲强龙均不同程度减轻模型组肺组织胶原沉积与Ⅳ型胶原蛋白表达,减少肺系数与肺组织Hyp含量,降低MMP-蛋白与2活性水平,尤其是活性型MMP-2水平.其中,对肺系数、Ⅳ型胶原蛋白与MMP-2蛋白与活性的抑制作用以扶正化瘀方较为明显.而2种药物对MMP-9蛋白表达与活性无明显影响.结论:扶正化瘀方具有良好的抗大鼠肺纤维化作用,其部分作用机制在于:抑制纤维化肺组织的MMP-2蛋白及其活性,以减少组织的炎性破坏;抑制Ⅳ型胶原过度表达,以减少胶原的病理增生沉积.
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HPLC-MSn分析扶正化瘀方中五味子的入血成分
目的:分析扶正化瘀方(Fuzheng Huayu decoction,FZHY)灌胃大鼠后进入血液的五味子中木脂素类成分,以探讨部分体内效应成分.方法:应用液相色谱-电喷雾质谱联用(HPLC-ESI-MSn)技术,通过空白血清,口服FZHY方后含药血清,FZHY方和对照品之间的色谱图和质谱碎片信息的对比分析,结合文献报道,确定口服FZHY方后大鼠的入血成分.结果:FZHY方和口服FZHY方后含药血清中均含有五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子乙素,并在FZHY方中还发现含有五味子甲素和丙素.结论:五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子乙素是直接吸收入血的成分,可能是发挥抗肝纤维化的体内效应成分.
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扶正化瘀方对正常及肝纤维化大鼠体内CYP450酶的影响
使用Cocktail探针药物法,研究扶正化瘀方(FZHY)对正常和肝纤维化大鼠细胞色素P450(CYP450)5种同工酶的影响.正常和二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)腹腔注射诱导的肝纤维化模型大鼠,以FZHY浸膏粉连续灌胃2周后,单剂量尾静脉注射由CYP450 5种同工酶的特异性探针底物非那西丁(CYPlA2)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、奥美拉唑(CYP2C 19)、氢溴酸右美沙芬(CYP2 D6)和咪达唑仑(CYP3A4)配置的Cocktail探针溶液后,通过建立的LC-MS/MS法同时检测血浆中5种探针药物的浓度,采用PK solution 2TM对数据进行处理,并计算主要药动学参数.正常大鼠灌胃FZHY后,非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑和氢溴酸右美沙芬的AUC0-t均出现不同程度的增加,CL也均出现降低趋势,提示FZHY能明显抑制正常大鼠CYP1 A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6的活性,但对CYP3 A4的活性影响不明显;肝纤维化大鼠灌胃FZHY后,甲苯磺丁脲的AUC0-t显著增加,Vd显著降低,其他4种探针药物的药动学参数未见显著改变,提示在肝纤维化大鼠体内FZHY仅对CYP2C9有抑制作用,对CYP1 A2,CYP2C19,CYP2D6,CYP3A4活性影响不明显.CYP450酶在肝纤维化条件下活性的改变可能是FZHY对正常和肝纤维化大鼠CYP450酶影响不同的原因.
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纤维化大鼠肝组织与物质代谢相关蛋白质动态变化及扶正化瘀方的调节作用
目的探讨扶正化瘀方干预治疗肝纤维化的作用.方法将Wistar大鼠随机分正常组、模型组、扶正化瘀方(简称中药)组.大鼠皮下注射40%CCl4-橄榄油溶液造模,正常组仅用生理盐水皮下注射,中药组用中药灌胃,取肝组织做病理、羟脯氨酸、蛋白质的分步提取.蛋白质定量后进行二维电泳,凝胶银染,运用PDQUEST 2-DE图像分析软件对获得的蛋白质图谱进行分析,运用MALDI-TOF-MS鉴定了30多个差异表达的蛋白质.结果(1)模型组大鼠出现生命活动整体反应(如体重、活动度等)下降;(2)肝纤维化过程中存在物质代谢障碍;(3)蛋白质组改变质谱结果显示模型组和正常大鼠肝组织差异表达的蛋白质与物质代谢相关的蛋白质有:过氯酸可溶性蛋白质、磷脂酰肌醇转移蛋白酶、磷酸甘油酸激酶、内质网-60蛋白酶;(4)中药组大鼠肝组织中过氯酸可溶性蛋白质、磷脂酰肌醇转移蛋白酶、磷酸甘油酸激酶、内质网-60蛋白酶的表达趋近正常.结论在肝纤维化过程中伴有蛋白质合成与分解异常和糖酵解活动增强;中药调节物质代谢相关蛋白质的表达是抗肝纤维化的途径之一.
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扶正化瘀方抗大鼠肾间质纤维化的作用
目的 观察扶正化瘀方抗氯化汞(HgCl_2)诱导的大鼠肾间质纤维化病变的作用,并初步探讨其作用机制.方法 将大鼠随机分为正常组、模型组、扶正化瘀方(FZHY)组及维生素E(VitE)组,模型组用HgCl_28 mg/kg灌胃9周,FZHY组(4.6 g/kg)和VitE组(100 mg/kg)分别给予相应的药物干预.检测肾功能情况(Cr和BUN),盐酸水解法检测肾组织羟脯氨酸(Hyp)含量,HE染色、Masson染色和六胺银(PASM)染色观察肾组织病理形态,Western blot观察Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、纤维连接蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达.结果 与模型组比较,FZHY组及VitE组大鼠肾体比(双肾质量/体重)明显下降(P<0.05)、肾组织Hyp含量明显下降(P<0.05),血清Cr和BUN含量明显下降(P<0.01),肾脏纤维化程度明显减轻.其中FZHY组比VitE组轻.FZHY组和VitE组肾组织Col Ⅰ和FN表达均较模型组减弱(Col Ⅰ,P<0.05;FN,P<0.01).FZHY组α-SMA表达较模型组减弱(P<0.01),VitE组则无明显变化(P>0.05).结论 FZHY可改善HgCl_2诱导模型大鼠的肾功能损伤,减少细胞外基质沉积,减轻肾间质纤维化病变,其作用机制与抑制肌成纤维细胞活化有关.
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扶正化瘀方抗肺纤维化的药物配伍作用特点
目的 探讨扶正化瘀方抗肺纤维化的配伍作用特点.方法 一次性气管内注射博来霉素诱导大鼠肺纤维化模型.采用正交试验设计,将造模成功大鼠随机分为16组,另设正常组.分别观察各组大鼠体重、肺系数,肺组织炎症与胶原沉积病理变化,检测肺组织羟脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性.结果 与正常组相比,模型组大鼠肺泡结构破坏,肺泡壁与间隔胶原沉积,肺泡壁与泡腔内大量炎性细胞浸润;肺系数显著增高;肺组织Hyp与MDA含量上升,而SOD活性下降.降低纤维化肺组织Hyp含量起主效应的药物是绞股蓝,其次是丹参、桃仁,有一定交互作用的是冬虫夏草与五味子.对SOD活性起主效应的药物是冬虫夏草、丹参,呈明显交互作用的是冬虫夏草与五味子,降低MDA含量作用较明显的是绞股蓝、丹参与桃仁、冬虫夏草与丹参、丹参与五味子均有明显交互作用.结论 扶正化瘀方抗大鼠肺纤维化大鼠的主要有效药物为绞股蓝、丹参、冬虫夏草,其中绞股蓝抑制肺组织胶原生成作用明显,冬虫夏草、丹参抗肺组织过氧化损伤作用明显.
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扶正化瘀方对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝纤维化及ACE-Ang Ⅱ-AT1R轴的影响
目的 探讨扶正化瘀方对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝纤维化及肾素血管紧张素转换酶-血管紧张素Ⅱ-血管紧张素Ⅱ1型受体(ACE-Ang Ⅱ-AT1R)轴的影响.方法 40只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、扶正化瘀方低剂量干预组(低剂量组)和扶正化瘀方高剂量干预组(高剂量组).除正常对照组外,其余3组经高脂饲料喂养24周后,低、高剂量组分别给予0.75、1.5g/kg扶正化瘀方灌胃,1次/d,6次/周,共6周.测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)等生化指标;放射免疫法检测血浆及肝组织中Ang Ⅱ水平;采用HE染色及Masson染色观察肝脏病理形态学变化;免疫组化法检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、ACE、AT1R的表达;RT-qPCR测定α-SMA、ACE、AT1R mRNA水平.结果 与模型组比较,低剂量组及高剂量组ALT、AST水平均明显降低,且高剂量组降低更明显,差异有统计学意义(P＜0.05);3组间TC和TG差异无统计学意义(P＞0.05).与正常对照组比较,其余3组血浆及肝组织中AngⅡ均明显升高;3组间血浆AngⅡ水平差异无统计学意义(P＞0.05);而高、低剂量组肝组织AngⅡ表达与模型组比较均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).HE染色及Masson染色结果显示,与模型组比较,低剂量组和高剂量组肝细胞脂肪变性、炎性反应及肝纤维化程度均减轻,其中高剂量组效果更为明显.免疫组化分析显示,低剂量组和高剂量组α-SMA、ACE、AT1R等蛋白表达均较模型组明显降低,其中高剂量组表达低,差异均有统计学意义(P＜0.05);RT-qPCR结果显示,α-SMA、ACE、AT1R的mRNA水平显示出与蛋白表达相同的变化规律.结论 扶正化瘀方能有效延缓非酒精性脂肪性肝纤维化的发生和发展,该机制可能与抑制ACE-AngⅡ-AT1R轴活性,从而有效抑制肝星状细胞的进展密切相关.
关键词： 非酒精性脂肪性肝病 肝纤维化 扶正化瘀方 肾素-血管紧张素系统 -
扶正化瘀方干预肝硬化大鼠血浆蛋白质组的初步研究
目的 利用蛋白质组技术比较CCl4诱导肝硬化大鼠血浆蛋白质变化并研究扶正化瘀方对肝硬化大鼠血浆蛋白质的影响.方法 将雄性SD大鼠随机分为3组,分别给予CCl4(CCl4/橄榄油∶1体积比=1∶1)腹腔注射、CCl4腹腔注射+扶正化瘀方灌胃、橄榄油腹腔注射,8周后通过Masson三色染色法用图像分析仪自动分析肝脏胶原面积.应用双向凝胶电泳技术经银染显色和PDQuest7.3软件分析凝胶图像,对在三组中表达均有差异的蛋白质点用基质辅助激光解吸电离飞行时间串连质谱进行鉴定.结果 扶正化瘀方干预组肝纤维化程度明显轻于模型组,胶原纤维面积在肝内沉积少(8.9%±3.7%vs 12.4%±4.7%,P＜0.05).实验去除血浆中的高丰度蛋白质可获得重复性较好的血浆蛋白质图谱.实验共鉴定出10个明显差异表达的蛋白质.在这些蛋白质中,血浆谷胱甘肽过氧化物酶及其前体、前白蛋白、结合珠蛋白、载脂蛋白A-Ⅳ前体、补体4、α抑制剂重链4和微管相关调节激酶1在肝硬化大鼠血浆中表达减少,扶正化瘀方干预组表达增加,肝脏再生相关蛋白和波形纤维蛋白在肝硬化大鼠血浆中表达增加,扶正化瘀方干预组表达减少.结论 CCl4诱导肝硬化大鼠血浆中与氧化应激、细胞增值和转化相关蛋白质表达明显改变.扶正化瘀方可通过促进蛋白质合成、抗氧化、调控细胞增值和转化等多方面发挥抗纤维化的作用.
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扶正化瘀方联合化疗治疗29例晚期胃癌的临床效果观察
目的:探索扶正化瘀方联合化疗治疗晚期胃癌的临床效果.方法:57例晚期胃癌患者,将患者根据不同治疗方案分为治疗组(29例)与对照组(28例).治疗组在常规化疗的基础上给予扶正化瘀方治疗,对照组仅予常规化疗治疗,比较两组效果.结果:治疗组患者治疗效果明显优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);治疗组总体不良反应程度低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:扶正化瘀方联合化疗治疗晚期胃癌,不但可以提高疗效,还可以减轻化疗的不良反应,值得临床推广.
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软肝丸治疗肝炎肝硬化临床观察
研究扶正化瘀方软肝丸改善肝功能、抑制肝纤维化的疗效.用软肝丸治疗肝炎肝硬化45例,另设对照组43例,治疗前后观察症状、体征;肝功能检测;测定血清透明质酸(HA),Ⅲ型前胶原(PCⅢ).结果:治疗组症状、体征的改变明显优于对照组(P＜0.05)肝功能明显改善.HA及PCⅢ分别由治前的398±196(μg/L)及342±6.25(μg/L)下降至治疗后的190±78(μg/L)及110.8±57.2(μg/L)(P＜0.01).治疗组肝功能的改善及PCⅢ、HA的降低,明显优于对照组.结论:软肝丸治疗肝炎肝硬化三个月,肝功能明显改善,肝纤维化亦明显减轻.
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扶正化瘀方调节差异微小RNAs表达的抗肝纤维化的作用机制
目的 筛选出扶正化瘀方(FZHY)调控的差异微小RNAs(miRNAs),并对这些差异miRNAs进行生物功能分析,部分揭示FZHY抗肝纤维化的作用机制.方法 CCl4皮下注射制备小鼠肝纤维化模型,分为正常组、模型组及FZHY组;自造模前3d开始给药,1次/d,共8周.天狼星红染色及羟脯氨酸(Hyp)含量测定观察肝组织胶原沉积.应用miRNAs芯片检测各组小鼠肝脏miRNAs表达谱.基于miRNAs表达谱筛选出正常组、FZHY组与模型组具有相同变化趋势的差异miRNAs,即FZHY调控的miR-NAs,并以qRT-PCR进行验证.采用TargetScan及PITA数据库对miRNAs靶基因进行预测,并采用DAVID数据库对这些预测的靶基因进行功能分析及信号通路分析,发现其调控的显著性功能及信号通路.多组间比较采用方差分析,miRNA差异基因筛选采用随机方差模型的t检验.结果 FZHY可明显降低纤维化肝组织Hyp含量,减轻胶原沉积.miRNAs芯片分析共发现3个FZHY调控的miRNAs,分别为:mmu-miR-322 、mmu-miR-342-3p和mmu-miR-296-5p.信号通路分析共得到32条这些miRNAs可能调控的信号通路,其中趋化因子信号通路、黏着斑、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、间隙连接、细胞外基质蛋白相互作用、Wnt信号通路、Jak-STAT信号通路等与肝纤维化密切相关;功能富集分析共得到32项显著性功能,其中三磷酸尿苷(GTP)酶活性调节、细胞连接、凋亡调节、Ras蛋白信号转导调节及小GTP酶活性调节等与肝纤维化密切相关.结论 下调miR-322,miR-342-3p及miR-296-5p表达,从而调节这些miRNAs对应的相关功能,如MAPK信号通路、Wnt信号通路、凋亡调节及Ras蛋白信号转导调节等可能是扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制,值得进一步研究.
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Jak/Stat信号通路在经典CCl4大鼠肝纤维化模型中的动态变化及扶正化瘀方对其影响
目的：探讨Jak/Stat信号通路在经典的CCl4大鼠肝纤维化模型中的动态变化及扶正化瘀方对其影响。方法复制经典的CCl4大鼠肝纤维化模型和肝纤维化扶正化瘀方干预模型，收集纤维化形成、逆转和干预过程中不同时间的血液和肝组织，观察血清指标、肝组织病理、α-SMA表达及肝组织Jak1、Stat3蛋白和mRNA表达变化。多组间比较采用单因素方差分析。结果 CCl4应用后模型组大鼠肝组织炎症及纤维化逐渐加重，α-SMA及Jak1、Stat3表达逐渐升高，8周时达高峰。8周后随着CCl4停用，大鼠肝组织炎症和纤维化逐渐好转，上述指标亦较前明显降低；扶正化瘀方干预组第4、6、8周时大鼠血清指标，肝组织炎症和纤维化程度、Jak1、Stat3表达均较模型组相同时间点明显降低。结论 Jak/Stat信号通路在肝纤维化发生和逆转中发挥重要作用，扶正化瘀方可通过阻断Jak/Stat通路及减少肝星状细胞活化发挥抗肝纤维化作用。
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基于FN/整合素信号途径探讨扶正化瘀方抑制肝星状细胞活化的作用机制
目的 探讨不同活化状态肝星状细胞(HSC)的纤维连接蛋白(FN),整合素的信号转导特点,以及扶正化瘀方干预FN刺激HSC活化的抗肝纤维化分子药理机制.方法 分离培养大鼠HSC,以10%小牛血清/M199原代培养于FN包被培养板中,以无FN包被培养细胞为对照,动态观察FN对原代培养HSC的影响;以原代培养1天的HSC为药效模型,分别加入10%大鼠血清(NRS)与扶正化瘀方药物血清,温育4～18h,倒置显微镜观察HSC形态,MTT法测定HSC增殖,alamarBlue法观察HSC的动态增殖变化,Western印迹法检测α-SMA、整合素α5β1、粘着斑激酶(FAK)和细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达水平,磷酸化抗体Western印迹法检测分析FAK与ERK磷酸化水平.结果 ①无包被培养HSC随培养时间延长,细胞伸展与增殖明显,α-SMA和整合素α5β1蛋白表达增加;FN包被能明显促进培养早期(1 d)静止HSC的增殖、α-SMA和整合素α5β1蛋白表达及ERK、FAK磷酸化;动态观察发现,FN能明显促进分离培养16～32h大鼠HSC的增殖,而后进入平台期,FN促HSC增殖作用减弱,对培养4、7 d的HSC的活化与信号分子表达影响也不明显.②与无血清培养细胞比较,正常大鼠血清与扶正化瘀方药物血清可明显促进FN包被的静止HSC的α-SMA与整合素β1表达、ERK与FAK磷酸化;与正常大鼠血清比较,扶正化瘀方药物血清可明显抑制FN与血清刺激的静止HSC增殖、α-SMA与整合素β1表达、ERK与FAK磷酸化.结论 FN可促进静止HSC活化,机制与上调整合素/FAK、ERK信号分子活性有关;中药药物血清可较好用于基于细胞外基质(ECM)成分细胞信号转导的中药分子药理机制研究;扶正化瘀方可明显抑制FN刺激的HSC增殖活化,作用机制与下调整合素/FAK信号通路有关.
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扶正化瘀方抗大鼠肝纤维化疗效的代谢组学研究
目的 利用代谢组学方法,评价扶正化瘀方(丹参、桃仁、松花粉等)对大鼠肝纤维化的治疗效果,并探索其可能的机制.方法 将SD大鼠随机分成正常对照组(n=6)、二甲基亚硝胺(DMN)诱导肝纤维化模型组(n=6)及扶正化瘀方给药组(n=6),采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UHPLC-TOF-MS)技术对大鼠血清进行分析,所得数据采用偏小二乘判别分析法(PLS-DA)进行模式识别处理.结果 正常组和模型组大鼠的血清代谢轮廓存在显著差异,而给药组在空间投影上呈现出“偏离模型组且接近正常组”的趋势.根据变量重要性投影值(VIP),筛选出19种相关代谢标志物.结论 验证了扶正化瘀方对大鼠肝纤维化的治疗效果,其潜在机制可能与修复体内异常的脂质和氨基酸代谢有关.
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扶正化瘀方对大鼠中毒性肾间质纤维化的作用
目的:观察扶正化瘀方对大鼠中毒性肾间质纤维化的作用.方法:Wistar大鼠40只,分为正常组、模型组、扶正化瘀方药物组.采用二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)腹腔注射4周和含汞等重金属的饲料喂饲造模8周,制备大鼠肝纤维化-肾间质纤维化模型.药物组以扶正化瘀方自第5周起灌胃,1次/d,共4周.肾组织HE染色及六胺银(periodic acidsilvermetheramine,PASM)染色,观察肾组织炎症与胶原纤维沉积变化;试剂盒方法检测血清尿素氮与肌酐含量,观察肾功能变化;盐酸水解法测定肾组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,观察胶原生成变化.结果:模型大鼠肾小管上皮细胞浊肿、坏死与脱落,炎性细胞浸润;肾间质增宽,大量胶原沉积;肾小管基底膜增厚,出现皱褶;血清尿素氮与肌酐含量上升,肾组织Hyp含量显著增加.扶正化瘀方药物组明显减轻模型大鼠肾小管炎症坏死与肾间质胶原沉积,减轻肾组织Hyp含量,降低异常增高的血清尿素氮与肌酐水平.结论:DMN腹腔注射与汞等重金属饲料口服可造成大鼠肾间质纤维化,扶正化瘀方可明显改善大鼠肾功能,有抗肾间质纤维化的作用.
