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濒危南药白木香悬浮细胞体系的建立
以白木香(Aquilaria sinensis)茎尖为材料,利用诱导形成的愈伤组织构建悬浮细胞体系.结果表明,诱导愈伤组织适培养基为MS +2.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 6-BA;经12次继代培养的愈伤组织生长旺盛、质地疏松适于悬浮培养;将其置于液体培养基MS+2.0 mg·L-1 NAA+ 1.0 mg·L-1 6-BA+500.0 mg·L-1 CH中震荡培养,建成悬浮细胞体系.悬浮细胞生长曲线呈S型,初期增长缓慢,4～6天为对数增长期,7～12天进入平台期,12天以后细胞生长速度及活力迅速下降;GC-MS结果显示,培养0、3、6、9、12天悬浮细胞不含沉香倍半萜,使用100 μmol·L-1 MeJA处理24 h可检测到倍半萜.本实验构建的白木香悬浮细胞体系均一稳定、细胞活力良好,可作为研究伤害诱导白木香形成倍半萜的离体体系,同时也具备离体生产沉香倍半萜的潜力.
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白木香AsMYC2蛋白的原核表达与纯化
MYC2转录因子属于bHLH转录因子家族中重要的一员,它是植物茉莉酸(JA)信号途径中的核心调控元件之一,但在白木香中研究甚少.本实验以白木香叶片中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR方法获得AsMYC2基因的编码区(CDS)全长,利用基因重组技术构建pGEX-4T-1-AsMYC2原核表达载体,并进行酶切和测序鉴定,将鉴定正确的克隆转化大肠杆菌BL21 (DE3),在37℃下0.1 mmol·L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导4h,AsMYC2蛋白的表达量高,且主要为可溶性蛋白.利用谷胱甘肽亲和介质进行融合蛋白的纯化,后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白.结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-AsMYC2原核表达载体,诱导了GST-AsMYC2(谷胱甘肽巯基转移酶-AsMYC2)融合蛋白的表达并进行了蛋白的纯化.高质量的GST-AsMYC2融合蛋白的获得,为多克隆抗体的制各提供材料基础,为筛选其互作蛋白因子和研究基因功能奠定基础.利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术对该基因进行组织表达特异性分析,结果显示AsMYC2基因在沉香形成的主要部位根和茎中的表达量高,在叶中的表达量低;该结果提示该基因可能与白木香中沉香的形成有关.
关键词： GST-AsMYC2 白木香 载体构建 蛋白表达与纯化 组织表达 -
白木香3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因AsHMGR2的克隆及表达分析
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是萜类合成甲羟戊酸(MVA)途径中的第一个关键限速酶.本研究根据课题组白木香转录组数据库中的HMGR2部分转录本序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆HMGR2基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析；利用荧光定量PCR检测AsHMGR2基因在不同组织和不同伤害处理下的表达差异.克隆得到的白木香AsHMGR2基因开放阅读框为1 749 bp,编码582个氨基酸,GenBank登录号为KC140287.组织表达分析的结果显示,AsHMGR2基因主要在根和茎尖中表达,其次是主干,叶中的表达量低；该基因同时受物理伤害和结香液处理的诱导,分别在6h和8h达到高表达水平.本研究通过AsHMGR2基因的全长cDNA克隆和表达特性分析,为后续深入研究其在沉香倍半萜合成途径的功能奠定了基础.
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白木香S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达分析
S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶,在植物响应生物与非生物胁迫中发挥着重要作用.本研究根据白木香转录组高通量测序结果结合RACE、RT-PCR技术从白木香愈伤组织中首次克隆得到1个SAMS基因,命名为AsSAMS1,并对其进行生物学信息分析、原核表达与纯化、组织特异性分析及非生物胁迫和激素诱导表达分析.白木香AsSAMS1基因的开放阅读框(ORF)长1183 bp,编码393个氨基酸,其蛋白分子质量是43.13 kDa.生物学信息分析表明AsSAMS1蛋白含有3个SAMS的特征序列,系统进化树显示AsSAMS1蛋白与野大豆(Glycine soja) SAMS蛋白具有较高的同源性.构建原核表达载体pET28a-AsSAMS1并在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中成功表达AsSAMS1重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱纯化得到可溶性AsSAMS1重组蛋白.实时荧光定量PCR检测结果表明AsSAMS1基因在茎中表达高,叶和茎尖次之,在根中表达低.盐、干旱、低温以及重金属胁迫均能够提高AsSAMS1的表达量和其产物S-腺苷甲硫氨酸的含量;茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸、赤霉素也能够诱导白木香愈伤组织中AsSAMS1基因表达.本研究可以为进一步研究S-腺苷甲硫氨酸合成酶在白木香结香机制和植物防御反应中的作用奠定基础.
关键词： 白木香 S-腺苷甲硫氨酸合成酶 生物学信息分析 原核表达 表达分析 -
白木香丙二烯氧化物合酶基因的表达分析
茉莉酸(jasmonic acid,JA)为植物防御反应的重要信号分子,其生物合成途径的关键酶是丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase,AOS).本研究以白木香(Aquilaria sinensis为材料,设计特异引物,克隆了白木香AsAOS1基因的cDNA序列,并进行氨基酸序列分析、原核表达和纯化、组织特异性分析及非生物胁迫和激素诱导表达分析.白木香AsAOS1基因的开放阅读框(ORE)长1 575 bp,编码524个氨基酸,其蛋白分子质量是58.70 kDa.AsAOS1蛋白包含细胞色素P450的保守区域.系统进化树显示AsAOS1蛋白与甜橙(Citrus sinensis)AOS蛋白同源性较高.构建原核表达载体pET28a-AsAOS1并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达AsAOS1重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱纯化得到可溶性AsAOS1重组蛋白.荧光定量PCR结果显示AsAOS1基因在茎中表达高,根次之,叶中表达低.盐、低温和重金属胁迫能够诱导白木香愈伤组织中AsAOS1基因表达,诱导12h表达量达到高;激素茉莉酸甲酯、水杨酸和脱落酸诱导后,愈伤组织中AsAOS1基因的表达量明显上升,而干旱胁迫和赤霉素处理对本AsA OS1基因的表达量影响不大.本研究为进一步研究茉莉酸途径在白木香结香机制和植物防御反应中作用奠定基础.
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白木香倍半萜合酶基因AsSS4的克隆、原核表达与功能鉴定
通过RT-PCR方法从伤害处理的白木香树木质部中克隆得到沉香倍半萜合酶4(sesquiterpene synthase 4,AsSS4)基因的全长开放读码框,该基因全长读码框为1 698 bp,编码包含565个氨基酸的蛋白质.将AsSS4基因与原核表达载体pET28a相连构建重组载体pET28a-AsSS4,把重组载体转入大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中,用IPTG诱导重组菌,经SDS-PAGE电泳分析,获得分子质量约为64 kD的重组AsSS4蛋白.利用镍凝胶亲和色谱法获得纯度较高的AsSS4蛋白,以法尼基焦磷酸(FPP)为底物进行蛋白酶促反应,共催化产生5种倍半萜类成分:cyclohexane,1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-、β-elemene、α-guaiene、α-caryophyllene 和δ-guaiene.本研究首次证实了白木香倍半萜合酶AsSS4基因的功能,为揭示伤害诱导沉香倍半萜形成的分子机制奠定了理论基础.
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白木香丙二烯氧化物环化酶基因(AsAOC1)的克隆与表达分析
丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase,AOC)是茉莉酸生物合成途径中的一个关键酶,在植物防御反应中发挥重要作用.本研究根据白木香转录组高通量测序结果设计引物扩增,利用RT-PCR技术从白木香中首次克隆得到1个AOC基因,命名为AsAOC1,并进行生物学信息分析、原核表达和纯化、组织特异性分析及非生物胁迫和激素诱导表达分析.白木香AsAOC1基因的开放阅读框(ORF)长753 bp,编码251个氨基酸,其蛋白分子质量是27.46kD.生物学信息分析表明AsAOCl蛋白包含1个保守的allene_ox_cyc结构域,系统进化树显示AsAOC1蛋白与川桑(Morus notabilis) AOC蛋白具有较高的同源性.构建原核表达载体pET28a-AsAOC1并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达AsAOC1重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱纯化得到可溶性AsAOC1重组蛋白.实时荧光定量PCR检测结果表明AsAOC1基因在茎中表达量高,根与茎尖次之,叶中表达量低.盐、干旱、低温以及重金属胁迫均能够诱导白木香愈伤组织中AsAOC1基因表达;茉莉酸甲酯、水杨酸、赤霉素和脱落酸诱导后,愈伤组织中AsAOC1基因的表达量明显上升.本研究为进一步研究茉莉酸途径在白木香结香机制和植物防御反应中作用奠定基础.
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三年生白木香机械伤害转录组学研究
国产沉香为瑞香科(Thymelaeaceae)植物白木香(Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg)含有树脂的木材.白木香树体只有在受到伤害等胁迫,才在伤口周围的木材内产生倍半萜等沉香类物质,但是伤害如何诱导沉香倍半萜生物合成途径至今尚未揭示.为揭示伤害诱导白木香结香的分子机制,本研究应用RNA测序技术对机械伤害后的白木香木质部转录组进行测序,研究其基因表达谱,挖掘其功能基因.本研究共获得40295条表达序列标签(express sequence tags,EST),平均长度305 bp.经序列合并拼接,获得22095条单基因簇(unigene).通过核苷酸和蛋白质序列等方面的同源性分析,表明其中61.6％(13611条)与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性.通过功能分类研究(GeneOntology)和代谢途径分析(KEGG)获得参与沉香倍半萜合成的序列26条(编码7个关键酶).这些基因的发现为研究沉香倍半萜化合物的生物合成途径及伤害诱导沉香形成的分子机制提供了基础数据.
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白木香化学成分和遗传多样性研究进展
白木香[Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg]是珍贵的药用树种,是国产沉香的唯一植物资源,具有极高的经济价值.但由于野生资源和生态环境长期遭受人为破坏等因素,白木香野生资源量不断减少,现已被列为国家二级重点保护野生植物.本文综述了近几年白木香化学成分和种质资源遗传多样性的国内外研究进展,期望能为白木香的资源保护及综合开发利用研究提供参考.
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中国沉香挥发油的化学成分与抗耐甲氧西林金葡菌活性
分析中国沉香的挥发油成分,并测试其抗耐甲氧西林金葡菌活性.采用水蒸气蒸馏法提取中国沉香挥发油进行GC/MS分析,峰面积归一化法计算各成分相对含量,采用NIST05和WILEY275L数据库匹配,以及将质谱图与文献数据进行对照的方法进行鉴定.采用滤纸片琼脂扩散法测试挥发油抗菌活性.挥发油对耐甲氧西林金葡菌显示强活性.共检测到66个色谱峰,其中30个化合物得到鉴定,占挥发油总量的59.80%.26个化合物被鉴定为倍半萜类化合物,占挥发油总量的54.26%.B.沉香呋喃(8.96%),枯苏醇(7.82%),(-)-jinkh-eremol(5.04%),沉香螺旋醇(4.53%),白木香呋喃酸(4.09%)为主要的倍半萜.4个降倍半萜和其他一些倍半萜,如10-表-γ-桉叶油醇,α-沉香呋喃,epi-ligulyl oxide等为首次从中国沉香中检出.本文首次报道了中国沉香挥发油对耐甲氧西林金葡菌具有抗菌活性.
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白木香叶95％乙醇提取物在db/db糖尿病小鼠上的降糖作用
白木香叶为中国广东省治疗糖尿病的民间药物,关于其降糖作用和机制未见报道.本研究采用白木香叶95％乙醇提取物(AE),灌胃给药于db/db2型糖尿病小鼠,4周之后发现AE高剂量组(600 mg/kg)具有降低db/db小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平,改善糖耐量的作用.作用机制研究表明,AE可能是通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK),起到了改善胰岛素抵抗,降低血糖的作用,并且AE未表现出引起动物体重增加的副作用,可能成为噻唑烷二酮之外的治疗肥胖相关糖尿病药物的新选择.
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白木香内生真菌发酵产物抑制HIV-1整合酶活性筛选
目的 研究白木香内生真菌的抗人类免疫缺陷病毒(HIV)活性,旨在获得具有显著活性的菌株,以寻找新的抗获得性免疫缺陷综合征药物来源,降低生产成本.方法 以人类免疫缺陷病毒-1整合酶为靶点,利用人类免疫缺陷病毒-1整合酶链转移反应筛选内生真菌发酵产物的抗人类免疫缺陷病毒活性,并对其中活性好的一株内生真菌进行了活性指导下的化合物分离.结果 不同时期不同地点采集的白木香材料分离所得78株内生真菌,其中有9株真菌显示出良好的活性(抑制率＞80％),占总分离菌株的11.54％.其中毛壳菌属菌株球毛壳菌HN-AS-8的发酵液活性好,IC50为9.44 μg· mL-1,从其活性部位得到3个已知化合物,其中化合物1具有一定的人类免疫缺陷病毒整合酶链转移反应抑制活性,IC50为35.4 μmol·L-1,化合物1和3为首次从该属真菌中分离得到的化合物.结论 白木香的内生真菌具有潜在的抑制人类免疫缺陷病毒-1整合酶活性物质,这为新型抗获得性免疫缺陷综合征药物的开发提供了更丰富的资源.
关键词： 内生真菌 抗人类免疫缺陷病毒活性 白木香 球毛壳菌 -
镰刀菌诱导结香对白木香倍半萜合成酶基因表达与倍半萜含量的影响研究
目的 研究镰刀菌诱导结香对白木香倍半萜合成酶(sesqui-TPS)表达的影响与倍半萜类化合物含量的动态变化.方法 小孔滴注法进行镰刀菌诱导造香实验并割取造香前后12月内7个时间点的结香部位(沉香树脂),采用实时荧光定量PCR法(qPCR)测定sesqui-TPS基因表达水平,气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析倍半萜类化合物含量的动态变化.结果 镰刀菌诱导白木香形成沉香2 ～ 12个月内sesqui-TPS基因相对表达量分别为10.85,0.793 1,6.484,611.4,5 800,4 211;人工诱导2个月前未检出倍半萜类次生代谢产物,4～12个月内共检出14个倍半萜类化合物,其相对百分含量分别为21.40％,25.52％,36.44％,32.40％和55.70％.结论 镰刀菌诱导白木香结香过程中sesqui-TPS基因主要在后期响应伤害胁迫,其表达水平对促进倍半萜类成分生物合成具有滞后性,为进一步研究白木香结香过程中功能基因对萜类成分的生物合成途径调控作用奠定基础.
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真菌诱导白木香产生沉香的野外实验与分析
目的 采用野外小规模实验和室内分析相结合的方法验证3株真菌YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导白木香产生沉香的可行性.方法 采用真菌诱导法诱导白木香产生沉香,利用气相-质谱联用技术(GC-MS)对诱导结香材料挥发油成分中的化合物进行检测,通过比对诱导材料高频菌与原接入菌的形态及核糖体基因内部转录间隔区序列(internal transcribed spacer,ITS)一致性来验证接入菌的有效性.结果 3株真菌定植于白木香6个月,YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导产生材料的重量分别为(1.786±0.473),(2.964±0.492)和(3.615±0.591)g,高于空白对照(1.325±0.407)g和阴性对照(1.462±0.417)g.GC-MS检测到3株活性真菌诱导材料含有代表沉香品质的主要化学成分倍半萜类化合物和色原酮类似物.菌种验证结果表明,3株活性真菌在诱导材料中为优势菌,分别占分离菌种的90.0％,97.5％和91.25％.结论 利用3株活性真菌诱导白木香产生沉香可以应用于实际生产,是可持续、高效生产沉香的良好方法.
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诱导白木香产生沉香真菌的固体培养条件优化
目的 对诱导白木香产生沉香的3株活性真菌的固体培养条件进行优化,为该类真菌的推广应用提供参考.方法 采用真菌固体培养方法,对影响真菌生长的营养和培养条件等因子进行优化,实验结果采用单因素方差分析法.结果 得到了培养3株活性真菌的佳固体培养基配方,获得了真菌固体生长的适温度、pH值、装料量、基质含水量和光照条件.结论 在实验得到的佳条件下,能够较快的培养出高质量的固体菌种；为3株活性真菌诱导白木香产生沉香的生产推广提供了菌种培养的优化条件.
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筛选诱导白木香产生沉香的真菌的研究
目的 筛选诱导白木香产生沉香的活性真菌.方法 野外条件下用真菌接种白木香,利用光学显微镜和扫描电子显微镜分别观察真菌诱导白木香树产生沉香过程中的真菌侵染、定植、真菌与植物的互作情况；用GC-MS检测诱导产生沉香材料中挥发油的主要成分.结果 筛选到三株具有诱导白木香产生沉香的活性真菌,这些真菌的诱导效果尚属首次报道.真菌菌丝能够侵入白木香组织细胞,诱导白木香产生的沉香与天然沉香的化学成分类似.结论 利用本实验得到的3株真菌诱导白木香结香具有重要的理论意义和实际应用价值.
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国产沉香和进口沉香的规格与鉴别
沉香为较常用中药,始载于《名医别录》,列为上品.因素木的心节质重,置水中则沉,气香,故名.别名土沉、女儿香、白木香、耳香、沉木香、沉香木、莞香、海南沉.沉香味辛,苦,性微温.有行气止痛,温中止呕,纳气平喘的作用,用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急.
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沉香粉的加工工艺
沉香为瑞香科植物白木香含有树脂的木材,为珍贵药材之一.始载于<名医别录>,列为木部上品.<唐本草>载:沉香、青桂、鸡骨、马蹄、煎香同出一树.出天竺诸国.木似榉柳,树皮青色,叶似橘叶,经冬不凋,夏生花,白而圆,秋结实似槟榔.大如桑椹,紫而味辛.沈怀远<南岳志>云:交趾蜜香树,彼人取之,先断其积年老木根,经年其外皮干俱朽烂,木心与枝节不坏,坚黑沉水者即沉香也.半浮半沉者为鸡骨香.
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国产沉香中1个新的2-(2-苯乙基)色酮
目的 对国产沉香的小极性化学成分进行研究.方法 运用硅胶、Sephadex LH-20、半制备高效液相等色谱方法进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构.结果 从国产沉香的石油醚提取物中分离得到4个2-(2-苯乙基)色酮衍生物,分别鉴定为6-甲氧基-7-羟基-2-(2-苯乙基)色酮(1)、6,7-二甲氧基-2-(苯乙基)色酮(2)、6,7-二甲氧基-2-[2-(4’-甲氧基苯)乙基]色酮(3)、6-甲氧基-2-[2-(3’-甲氧基-4’-羟基苯)乙基]色酮(4).结论 化合物1为新化合物,命名为沉香酮J;化合物4为首次从国产沉香中分离得到.
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沉香挥发油化学成分分析
沉香以其心材含黑色树脂,质重而能沉于水,且有香气而得名[1].药材分为两类,<中国药典>收载的来源为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg含有树脂的木材[2],产于广西、广东、海南等地[3];而进口沉香同科同属沉香树A.alagallocha Roxb.含有树脂的心材[4],则来源于越南、柬埔寨、印尼、马来西亚、泰国等地.沉香始载于梁代陶弘景<名医别录>,列为上品.
