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嗅鞘细胞移植修复大鼠及人类脊髓损伤的Meta分析
目的:综合评价嗅鞘细胞(OECs)移植治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的价值.方法:计算机检索美国国立图书馆(MEDLINE)、PubMed、Ovid-Medline、Ovid-BIOSIS Previews、CNKI、VIP、CBM数据库中关于嗅鞘细胞移植治疗SCI大鼠及患者的随机对照研究.检索时间均为2000年1月至2012年6月.对符合纳入标准的研究以修改后Jadad量表为标准进行质量评价,收集原始数据,采用RevMan5.0软件进行Meta分析.结果:共28篇文章符合标准,Meta分析显示:15篇以大鼠为模型的实验中,OECs组细胞移植6周后,其后肢运动功能(BBB)评分高于对照组,其差异有统计学意义[WMD=1.24,95％CI(1.12,1.35),P＜0.00001]；感觉诱发电位(SEP)潜伏期短于对照组,而波幅高于对照组,其差异有统计学意义[潜伏期WMD=-2.33,95％CI(-3.05,-1.60),P＜0.0001；波幅WMD=0.27,95％CI(0.24,0.30),P＜0.00001]；运动诱发电位(MEP)波幅高于对照组,差异有统计学意义[MEP振幅WMD=-0.20,95％CI(-0.55,0.15),P＜0.00001]；痛觉测量(Plantar test)潜伏期短于对照组,差异有统计学意义[WMD=-1.05,95％CI(-1.38,-0.72),P＜0.00001]；受损区脊髓横断面积大于对照组,差异有统计学意义[WMD=0.93,95％CI(0.79,1.07),P＜0.00001]在SCI患者的13篇文献中,OECs移植后患者的运动、轻触觉及痛觉功能评分均高于移植前,差异具有统计学意义[运动WMD=-5.53,95％CI(-7.04,-4.01),P＜0.00001；轻触觉WMD=-1 1.22,95％CI(-12.98,-9.47),P＜0.0001；痛觉WMD=-9.65,95％CI(-11.41,-7.88),P＜0.000011.结论:就目前为止的研究结果分析,OECs移植能促进SCI大鼠及人的脊髓再生及功能改善.
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嗅鞘细胞移植在大鼠脊髓损伤处能够迁移和促进神经轴突生长吗?
目的:探讨嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OEC)移植在大鼠损伤脊髓后是否有独特的迁移和轴突生长导向特性.方法:将表达绿色荧光蛋白基因的OEC注入到C4脊髓损伤大鼠距离损伤部位头端1mm及尾端1mm背柱白质处,注射后1、3、12、24h及3、7、28d灌注固定取材,冰冻切片和免疫组化分析.用骨髓基质细胞和成纤维细胞移植到同样的损伤部位做为对照进行同样的分析.另将OEC注射到距离损伤部位头尾侧1mm处脊髓灰质内、小剂量注射在白质内、在损伤前3d或损伤后9d注射、注射到未损伤脊髓白质中,观察细胞迁移情况.结果:OEC在细胞注射后1h内即形成由注射压力造成的从注射部位向损伤处的被动性延伸带,并且不断地从注射部位向损伤处延伸扩散,在形态学方面好象起到"桥接"损伤处的作用.对照组骨髓基质细胞和成纤维细胞注射后也迅速形成细胞"桥接"带,并扩散至损伤空腔.将OEC注射到脊髓灰质内或小剂量注射或注射到未损伤的脊髓白质内、在脊髓损伤3d前或9d后注射细胞均没有见到细胞带延伸进入损伤部位.OEC在注射部位、细胞带以及损伤部位有增殖现象.28d后,共焦免疫酶标法证实细胞带取代了脊髓原有星形胶质细胞,但是下行或上行长束轴突没有优先延伸至该细胞带,也没能起到维持皮层脊髓轴突的桥接作用.结论:OEC在植入大鼠损伤脊髓后没有独特的迁移特性,与骨髓基质细胞或成纤维细胞相比没有明显促进轴突生长的作用,也没有支持皮层脊髓轴突在脊髓损伤处形成桥接的作用.
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嗅鞘细胞在硫酸肝素-胶原蛋白支架材料中复合的研究
目的:观察硫酸肝素-胶原蛋白支架材料与嗅鞘细胞的相容性.方法:以冷冻干燥的方法制备硫酸肝素-胶原蛋白支架材料.培养、纯化并鉴定嗅鞘细胞后,将Hoechst荧光标记的嗅鞘细胞复合于硫酸肝素-胶原支架材料中,荧光显微镜、扫描电镜及光镜下观察其在材料内部的空间排列形式.以MTT法检测嗅鞘细胞与硫酸肝素-胶原蛋白共培养时的生物活性.结果:以硫酸肝素复合胶原蛋白结合冷冻干燥技术制备的支架材料具有纵行的、平行排列的微管结构,嗅鞘细胞在支架材料微管内成线性平行排列,MTT法证明嗅鞘细胞与硫酸肝素-胶原蛋白材料共培养时保有高度的生物活性.结论:硫酸肝素复合胶原蛋白结合特定条件下冷冻干燥技术可以制备在组分和内部空间结构上高度仿生的新型神经组织工程支架材料,其与嗅鞘细胞有良好的相容性.
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共培养条件下嗅鞘细胞对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响
目的:观察体外骨髓间充质干细胞(BMSC)和嗅鞘细胞(OEC)非接触共培养时,OEC对BMSC向神经样细胞诱导分化的影响.方法:采用5～6周龄、体重100g左右的SPF级雄性Sprague Dawley (SD)品系大鼠20只,分离培养大鼠BMSC和OEC,BMSC取自双侧股骨,OEC取自嗅上皮.使用6孔0.4μm的Transwell共培养系统进行培养.将2×104/cm2的第3代OEC置于共培养系统上层,3×104/cm2的第3代BMSC置于下层.对共培养7d和14d后的BMSC行免疫组化染色,检测神经细胞特异性蛋白巢蛋白(Nestin)、神经元类型Ⅲβ-微管蛋白(Tuj-1)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.流式细胞仪检测Nestin、Tuj-1和GFAP阳性细胞的分布和所占的比例.结果:免疫组化检测显示,共培养7d和14d后BMSC均表达Nestin、Tuj-1和GFAP.流式细胞仪分析,共培养7d后Nestin、Tuj-1和GFAP阳性细胞比例分别为46.3％、76.5％和23.2％,共培养14d后分别为27.7％、89.1％和50％.结论:非接触共培养条件下,OEC能诱导BMSC向神经样细胞分化.
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骨髓间质干细胞与胚胎嗅鞘细胞联合移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究
目的:观察人骨髓间质干细胞(MSCs)与胚胎嗅鞘细胞(OECs)联合移植治疗大鼠脊髓损伤的效果,探讨共移植的OECs对MSCs分化的影响.方法:采用Allen's法制作大鼠脊髓损伤模型,随机分为MSCs移植组(A组)、OECs移植组(B组)、MSCs与OECs联合移植组(C组)及PBS注射组(D组),术后1～5周采用BBB评分、经颅磁刺激运动诱发电位及组织学方法检查脊髓损伤修复情况.结果:术后2周起,A、B、C组BBB评分和诱发电位潜伏期与D组比较恢复明显,C组与A、B组相比亦有显著性差异(P＜0.05).术后5周时C组损伤区有较密的神经轴突分布,近端可见大量成束再生轴突;A、B组损伤区及近端再生轴突分布稀疏;D组损伤区及近端少见轴突.C组移植的MSCs中Nestin及NF表达阳性的比率较A组高(P＜0.05).结论:联合移植OECs可促进MSCs向神经元方向转化,提高MSCs分化为神经元的比例;MSCs与OECs可以在脊髓损伤修复中发挥协同作用,联合细胞移植是提高脊髓损伤修复效果的可行方法.
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神经营养素-3基因修饰嗅鞘细胞移植对急性脊髓损伤作用的实验研究
目的:观察神经营养素-3(NT-3)基因转染嗅鞘细胞(OEG)移植对急性大鼠脊髓损伤的作用.方法:将自行构建的质粒pEGFP-NT3应用脂质体介导的方法导入体外培养的嗅鞘细胞,并移植入急性脊髓损伤大鼠体内,连续观察12周,与接受单纯OEG、空白质粒转染OEG移植的脊髓损伤大鼠进行比较.结果:移植转染pEGFP-NT3后的OEG能在体内长期存活,表达NT-3基因,与对照组比较能更好地促进脊髓损伤区轴突的再生和后肢功能的恢复.结论:OEG是脊髓损伤基因治疗较好的受体细胞.转染NT-3基因的OEG移植后可以在体内较长时间存活,能明显促进急性脊髓损伤神经纤维的再生和功能恢复,为基因修饰嗅鞘细胞在脊髓损伤治疗中的应用提供了实验和理论依据.
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不同剂量嗅鞘细胞蛛网膜下腔移植修复脊髓损伤的实验研究
目的:探讨嗅鞘细胞蛛网膜下腔移植治疗脊髓损伤的可行性、安全性及细胞移植数量与疗效的关系.方法:应用改良Allen's法制备大鼠T10脊髓损伤模型,随机分四组:大剂量嗅鞘细胞蛛网膜下腔移植组(A组,2×106个)、中剂量嗅鞘细胞蛛网膜下腔移植组(B组,2×105个)、小剂量嗅鞘细胞蛛网膜下腔移植组(C组,2×104个)、DMEM/F12培养液蛛网膜下腔移植组(D组).术后即刻进行细胞移植,术后第4、10周行CBS功能评分及组织学检查,观察脊髓神经功能修复情况及损伤区神经纤维数量.结果:CBS功能评分示A、B组明显好于C、D两组(P＜0.05)；A、B两组间比较无差异,C、D两组间比较无差异(P＞0.05).组织学观察发现A、B组神经纤维数量多于C、D组.结论:急性期嗅鞘细胞经蛛网膜下腔移植治疗脊髓损伤安全有效,急性期移植细胞数量较大则脊髓神经功能恢复较好.
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低温保存的嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究
目的:观察低温保存复苏后嗅鞘细胞(OECs)局部移植治疗脊髓损伤(SCI)的疗效,探讨低温保存对嗅鞘细胞活性的影响.方法:建立大鼠T10节段脊髓半切损伤模型56只,随机分为四组,每组12只:新鲜OECs移植组(A组),冻存OECs移植组(B组),D/F12培养液移植组(C组)和空白对照组(D组).A组损失伤局部行新鲜OECs移植,B组将处于对数生长期的OECs冻存3个月,复苏后(用双苯亚甲胺标记)移植到脊髓半切模型大鼠脊髓损伤区.术后第1天、1、2、3、4、6、8及10周时进行联合行为学(CBS)综合评分,术后5周和10周时取材观察移植细胞存活及迁移情况；HE染色及嗜银染色观察脊髓组织病理及轴突情况；NGFRp75免疫组织化学染色情况.结果:术后第1天,2、10周时CBS评分,A组分别为85.78＝1.07、58.80±5.00、6.52±2.37；B组分别为86.12±1.29、60.06±6.51、8.15±2.26;C组分别为86.4± 1.03、66.28±7.00、30.65±5.60；D组分别为86.75±1.37、69.85±6.61、34.13±5.38.A、B两组间无明显差别(P＞0.05)；C组与D组间比较无差异(P＞0.05)；A组及B组较C组和D组在2周后各时段差别有显著意义(P＜0.05).组织学方面,HE染色和嗜银染色A、B两组在术后5周可见多量突起经近侧断端向损伤区域生长,10周时可见神经纤维跨越损伤区域,而C、D组未见有神经纤维跨越损伤区；NGFRp75免疫组化染色,无论5周还是10周,A、B两组在损伤部位均可见阳性染色区域,C、D组未见有阳性着色.术后5周时A、B两组可检测到荧光标记细胞,且可见细胞发生迁移.结论:低温保存的OECs脊髓局部移植治疗SCI与新鲜OECs移植治疗效果无差别.
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不同方法共移植的嗅鞘细胞和雪旺氏细胞在损伤脊髓内的迁移和对轴突再生的影响
目的:观察经不同方法共移植的嗅鞘细胞和雪旺氏细胞在脊髓内的迁移特点和对轴突再生的影响.方法:将8只75±1d雌性SD大鼠随机分为2组,每组4只,利用NYU打击器制作TIO脊髓损伤模型,打击高度25mm,打击杆重量10g.造模后2周,一组采用联合移植,雪旺氏细胞移植于损伤鄢位中心,嗅鞘细胞移植于距离损伤中心0.5mm处的头侧和尾侧的脊髓中线上;另一组采用混合移植,将嗅鞘细胞和雪旺氏细胞混合后移植于距离损伤中心0.5mm处的头侧和尾侧的脊髓中线上.每个部位注射4个点,深度为1.75mm,1.25mm、1mm、0.5mm.注射速度为0.1μl/min.联合移植组嗅鞘细胞晕每点0.5μl含5×10~4个,雩旺氏细胞晕为每点1μl含10~5个雪旺氏细胞;混合移植组为每点1μl含嗅鞘细胞和雪旺氏细胞各5×10~4个.细胞移植后1周和8周时各组分别取2只大鼠.以损伤部位为中心取包含细胞移植部位的脊髓,荧光和共聚焦显微镜下观察细胞迁移情况,利用神经丝(neurofilment,NF)和乍长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)免疫荧光染色观察移植细胞对轴突再生的影响.结果:两组中均可见嗅鞘细胞迁移,主要在灰质和白质内沿脊髓纵轴向损伤部位迁移,还分别有一小部分沿中央管和蛛网膜下腔迁移;但雪旺氏细胞仅存与嗅鞘细胞混合移植于距离损伤中心0.5mm处的头侧和尾侧脊髓时才可见有限距离的迁移.联合移植时,NF阳性(NF+)和GAP-43阳性(GAP-43+)纤维伴随嗅鞘细胞迁移而沿脊髓纵轴延伸,雪旺氏细胞移植处可处NF+纤维从各个方向长入损伤部位(移植部位)并互相缠绕;混合移植时,大量NF+纤维伴随移植细胞迁移而延伸,损伤部佗虽然NF+纤维较少,但没有互相缠绕现象.结论:雪旺氏细胞在损伤脊髓内迁移能力差;嗅鞘细胞不仅具有良好的迁移能力,而且可促进雪旺氏细胞迁移.无论是联合移植还是混合移植,移植细胞均能促进轴突再生,但联合移植时雪旺氏细胞移植处再生纤维互相缠绕、无法延伸.
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嗅鞘细胞体外诱导神经干细胞分化的实验研究
目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)体外诱导神经干细胞(neuron stell cells,NSCs)分化的作用.方法:分别从3月龄SD大鼠的嗅球和新牛SD大鼠的海马中分离OECs及NSCs.进行体外分离、培养及免疫荧光鉴定.构建OECs与NSCs共培养体系,分为3组,纯化培养的OECs+NSCs组,末纯化培养的OECs+NSCs组,单纯NSCs组.共培养后4、8、12d行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率.结果:经P75和S100双重免疫荧光鉴定所培养的细胞为OECs,经巢蛋白抗体(Nestin)免疫荧光鉴定所培养的细胞为NSCs.荧光显微镜观察可见被特异件烯醇化酶一异硫氰酸荧光素(NSE-FITC)荧光标记的神经元大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突.在各时时间点,共培养组中可见到多个神经元聚集生长,神经元数目明显多于单纯NSCs培养组,而共培养组之间无明显差别.共培养后12d,共培养组中NSCs分化为神经元的百分率大约为23%,而单纯NSCs培养组约为4%.在各时间点,共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异(P<0.001),而共培养组之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论:OECs在体外能够有效诱导NSCs向神经元转化.
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嗅鞘细胞对脊髓后角神经元突起生长的影响
目的:观察嗅鞘细胞对胚胎脊髓后角神经元突起生长的影响.方法:分离孕15d胚胎大鼠脊髓,取纵向分开的后半制备成细胞悬液,培养于:(1)原代培养的嗅鞘细胞单细胞层上;(2)嗅鞘细胞培养上清中;(3)原代培养的成纤维细胞单细胞层上;(4)单纯培养.24h后终止培养,行抗神经丝-200免疫细胞化学染色.每组随机取15个神经元,在Leica Q-570图像分析仪中测量各组神经元的平均总突起长度及平均单个长突起长度,进行组间比较.结果:神经元平均总突起长度(1)～(4)组分别为408.62±126.9lμm、336.24±106.34μm、199.37±76.14μm和64.61±24.49μm;平均单个长突起长度(1)～(4)组分别为180.13±83.54μm、141.22±53.68μm、107.29±43.35μm和23.04±5.30μm.第(1)、(2)组神经元平均总突起长度和平均单个长突起长度明显高于第(3)、(4)组(P ＜0.01),而(1)、(2)组之间没有明显差异(P＞0.05).结论:与嗅鞘细胞共培养能明显促进胚胎脊髓后角神经元突起的生长速度.
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嗅鞘细胞和雪旺细胞混合移植对大鼠脊髓损伤修复的影响
目的:探讨嗅鞘细胞和雪旺细胞混合移植对大鼠脊髓损伤修复的影响.方法:75±1d雌性SD大鼠35只.随机取30只分为实验组和对照组,每组15只,剩下5只作正常备用.实验组和对照组大鼠均制作成T10段脊髓损伤模型,实验组在造模后2周接受嗅鞘细胞和雪旺细胞混合移植,移植部位为距离损伤中心0.5mm处的头侧和尾侧的脊髓中线上,每个部位注射4个点,深度为1.75mm、1.25mm、1mm、0.5mm;每点移植0.5μl含嗅鞘细胞和雪旺细胞各0.5×105个的DMEM悬液;对照组在相同部位注射等量DMEM.造模后每周应用BBB评分观察大鼠后肢运动功能.移植后6周每组大鼠在大脑运动皮层后肢代表区注射10%生物素化葡聚糖胺(BDA),移植后8周取包含损伤部位(对照组)和移植部位(实验组)的脊髓进行HE染色、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)I神经丝(NF)免疫荧光双染、生长相关蛋白-43(GAP-43)的检测及显微荧光照相.结果:造模后1-4周两组大鼠后肢BBB评分未见明显差异,造模后5～8周实验组大鼠后肢BBB评分较对照组高(P<0.05),9、10周时两组无明显差异.伤后10周(移植后8周)时,实验组大鼠脊髓损伤部位瘢痕和损伤范围较对照组小;实验组脊髓损伤部位NF阳性纤维计数为31～8.12根/切片,明显多于对照组的17.80～2.58根/切片(P<0.01);实验组脊髓损伤部位GAP-43的相对表达量为1.27±0.12,明显高于对照组的1.20±0.58(P<0.05);两组损伤部位尾侧脊髓均未见BDA标记的皮质脊髓束.结论:嗅鞘细胞和雪旺细胞混合移植具有一定程度的促进大鼠损伤脊髓结构修复的作用,但未能促进大鼠后肢运动功能改善.
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嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的治疗一直是医学界的难题,现今临床上仍无确实有效的治疗方法.目前,SCI修复的研究策略主要有以下几方面:药物治疗、细胞移植治疗、组织移植治疗、基因治疗以及联合治疗等.近年来细胞移植治疗被广泛研究,包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、雪旺氏细胞(Schwann cells,SCs)、嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)、神经干细胞(neural stem cells,NSCs)、骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)、脐血细胞(umbilical cord blood cells,UCBCs)等,其中OECs以独特的生物学特性和功能引起医学界广泛关注.笔者就OECs移植治疗SCI的研究进展综述如下.
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中国的细胞移植:对大的人类慢性脊髓损伤临床试验的观察研究
背景:在中国已有400多例脊髓损伤患者接受了胎儿脑组织的移植.至今,说明这种手术安全和有效的唯一根据是一些新闻报道.目的:比较患者的个体感受以及客观发现的所有报告,这些患者在细胞移植手术前和手术后1年内接受了综合性评估.方法:独立观察研究7例在北京接受了黄红云医生手术的慢性脊髓损伤患者.研究分析其损伤部位的脊柱核磁共振成像,残疾状况的变化,手术前后的详细记录及美国脊髓损伤协会的评估标准.结果:无明显选取和排除患者的标准,包括创伤性脊髓损伤(程度从ASIA A到D)以及由多种不同原因引起的脊髓损伤患者均可以治疗.细胞注射点不一定总对应损伤部位,如高位颈段损伤患者,细胞却注射到大脑前叶.5例患者有严重副作用,包括脑膜炎.患者观察到的身体变化可能是由于手术后短暂的肌张力减退所致.未发现临床上有价值的运动感觉功能、残疾状况或者自主神经功能的改善.结论:不清楚被称为嗅鞘细胞的移植细胞类型和可能发生的生物功能.临床上严重的不足是手术并发症以及缺乏有效的改善.观察的手术既不符合安全临床试验的国际标准,亦不符合有效临床试验的国际标准.基于缺乏有效科学临床试验的手段和标准,临床医生应建议患者不去做这种手术治疗.
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嗅鞘细胞移植对急性脊髓损伤修复作用的实验研究
目的:研究嗅鞘细胞(OEG)的培养及其对大鼠脊髓挫伤加横断伤的修复作用.方法:用新生Wistar大鼠嗅球(OB)做OEG培养,OEG植人挫伤加横断伤的大鼠脊髓内(A组),设立注入DMEM培养液(B组)和单纯椎板切除(C组)的对照组.观察术后动物脊髓功能恢复情况.术后3个月取材,了解脊髓再生情况和双笨亚甲胺(Hoechst)标记的OEG在体内存活情况.结果:(1)手术4周后,BBB运动功能得分A组均高于B组.(2)在脊髓损伤区及其周围,神经纤维A组数量多于B组,均少于C组.(3)Hoechst标记的OEG大量存在于A组脊髓损伤段周围.结论:OEG移植具有明显促进脊髓挫伤加横断伤神经纤维再生和功能恢复的作用.
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嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤的新进展
传统观点认为,中枢神经系统损伤后由于自身的再生能力差和外在环境抑制,神经不能再生.脊髓是中枢神经系统的重要部分,发育成熟的脊髓损伤后神经不能再生是功能永久丧失的主要原因.为促进脊髓神经的再生,各国学者所采用的方法主要集中在以下几方面:(1)神经营养因子的应用;(2)拮抗生长抑制因子的应用;(3)电刺激有应用;(4)外周神经移植;(5)雪旺氏细胞(Schwann cells,SCs)移植;(6)神经干细胞移植;(7)胚胎组织移植;(8)基因治疗;(9)嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植.在这些方法中,嗅鞘细胞移植被认为是修复脊髓损伤有前景的方法之一.现将嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤的相关研究做一综述.
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胰酶限时消化在嗅鞘细胞培养中的运用
目的 探索出一套高效、实用的大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的培养和纯化方案.方法 分离SD大鼠嗅球的外两层组织,剪切消化成细胞悬液进行接种.采用3种方法进行OECs的培养和纯化:(1)A组分别经6h、24 h两次差速贴壁去除杂质细胞,培养至12d左右消化重悬细胞进行爬片分析.(2)B组分别经6h、24 h两次差速贴壁去除杂质细胞,培养至12d左右经胰酶限时消化,留成纤维细胞于瓶壁,重悬的细胞进行爬片分析.(3)C组采用经典的Nash法(分别经18 h、36 h两次差速贴壁去除杂质细胞),培养至11d左右消化重悬细胞进行爬片分析.采用NGFRP75与碘化丙啶(PI)双染的方法进行OECs的鉴定和纯度分析.结果 在共聚焦显微镜下呈双染阳性的细胞为OECs,OECs多数突起细长,呈双极或三极,少量呈单极或多极.A、B、C组所纯化的OECs纯度分别为(67.3±6.2)％、(83.7±7.7)％和(74.6士9.5)％,3组间比较有统计学差异(F=13.633,P＜0.01),B组所得OECs纯度均较另两组高(P＜0.05).结论 经6h、24 h两次差速贴壁十胰酶限时消化可以获得较高纯度的OECs,能够满足动物实验的需要.
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用于移植的嗅鞘细胞的纯化培养方法研究
目的 探讨移植用成年大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的培养和纯化方法.方法 取成年SD大鼠嗅球,将分离消化所得细胞悬液进行接种.然后分别于接种后2 h、6 h和18 h 3个时间点进行单步骤差速贴壁法去除成纤维细胞,纯化嗅鞘细胞,纯化培养约11 d时采用神经生长因子受体P75(NGFRP75)和碘化丙啶(PI)双染OECs并对其纯度及细胞数量进行免疫荧光鉴定分析.结果 纯化培养11 d后在共聚焦显微镜下呈双染阳性的细胞为OECs,数量级达106/mL,形态以梭形、双极或三极突起为主,亦有少量多极或单极细胞.2 h、6 h和18 h组嗅鞘细胞纯度分别为(53±5)%、(73±8)%和(69±13)%,组间差异有统计学意义(F=11.766,P<0.001). 结论分别经2、6、18 h单步骤差速贴壁法纯化的OECs在纯度和数量级上均可满足移植用细胞的要求,且方法简单、经济、快捷.
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嗅鞘细胞移植后大鼠损伤脊髓神经生长因子的表达
目的 研究嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓内的神经生长因子(NGF)表达的影响,以从NGF角度探讨嗅鞘细胞移植修复大鼠脊髓损伤的机制.方法 48只SD大鼠用NYU -Ⅱ撞击机(10g-25 mm)损伤T10脊髓制作脊髓损伤(SCI)模型,随机分为嗅鞘细胞组、DMEM组各24只；另设立正常对照组6只.将GFP-嗅鞘细胞细胞悬液移植入嗅鞘细胞组大鼠损伤处,DMEM组用单纯的DMEM/F12液代替,正常对照组不做任何处理.移植术后1d、7d、14 d、21 d,用BBB评分法测定脊髓运动功能,RT - PCR方法比较各时间点NGF表达差异.移植术后第21天应用免疫组化比较嗅鞘细胞组、DMEM组、正常对照组大鼠脊髓损伤区NGF的表达差异.结果 移植后1d、7d、14 d、21 d,嗅鞘细胞移植组运动功能评分均高于同期DMEM组.NGF表达量在术后第1天高,第7天达峰值,之后缓慢降低.移植后第21天,嗅鞘细胞移植组脊髓NGF表达量高于同期DMEM组和正常对照组.结论 嗅鞘细胞移植可上调损伤脊髓NGF的表达,从而促进了损伤脊髓的修复.
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嗅鞘细胞及其表达的NGF和BDNF对神经干细胞增殖的影响
目的 研究嗅鞘细胞及其表达的神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)对神经干细胞增殖的影响.方法 采用共培养液培养以及NGF或BDNF抗体封闭的方法,观察嗅鞘细胞对神经干细胞增殖的影响.免疫组化和RT.PCR半定量分析嗅鞘细胞表达的细胞因子及其受体的情况.结果 共培养液培养4d后,神经干细胞数量明显增多(P<0.05).免疫组化和RT-PCR半定量分析结果显示,嗅鞘细胞表达多种细胞因子及受体,共培养液培养2d后嗅鞘细胞表达NGF和BDNF mRNA的相对值明显高于对照组(P<0.05).抗体封闭培养液中的NGF或BDNF后,没有影响神经干细胞的增殖.结论 嗅鞘细胞表达大量细胞因子作用于神经干细胞,促进其增殖.在本研究条件下,神经干细胞的增殖可能与嗅鞘细胞表达的碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)有关,而与NGF和BDNF无关.
