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离体培养嗅鞘细胞促进新生大鼠螺旋神经节细胞的存活
本文旨在探索离体实验中的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)有无促进耳蜗听觉传入神经元--螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)存活作用及可能机制.取成年大鼠嗅球和新生大鼠蜗轴组织块进行OECs与SGCs的培养,采用差速贴壁法纯化培养OECs.实验分OECs与SGCs共培养组和SGCs单独培养组.倒置相差显微镜下观察OECs和SGCs生长状态,神经营养因子受体p75免疫组织化学法鉴定OECs,神经元特异性标志物βⅢ-tubulin标记SGCs.为了研究OECs与SGCs共培养体系中,前者促进后者存活的可能机制,共培养组中分别加入脑源性神经生长因子(BDNF,500pg/mL)和BDNF抗体(IgY型,50 μg/mL),对照组为未加任何处理的共培养组,然后检查各培养组中SGCs存活数量和存活时间.结果显示,OECs贴壁培养7 d后形成一细胞单层,在OECs与SGCs共培养体系中,SGCs在OECs形成的细胞单层的表面生长,并伸出长突起,呈现典型的双极神经元形态:在培养的前6天内,随着培养时间的增加,两组中的SGCs都较接种前减少,但共培养组中SGCs存活数量明显高于SGCs单独培养组(P<0.01);单独培养组的SGCs数量在培养的第6天出现人幅度减少,在培养的第9天几乎没有生长;共培养组的SGCs数量未见明显变化(P>0.05);共培养中加入BDNF对OECs促进SGCs存活无明显影响,而加入BDNF抗体(IgY)后存活的SGCs减少(P<0.01).本研究结果提示,OECs与SGCs共培养能够促进新生大鼠SGCs存活和突起生长,延长存活时间,OECs分泌BDNF可能是促进SGCs存活的机制之一.
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脊髓半切洞损伤后人胚嗅鞘细胞移植的时机选择
目的通过对脊髓损伤后不同时间进行嗅鞘细胞移植治疗产生的不同效果进行比较,从而选择细胞移植治疗脊髓损伤的佳时机.方法将20只SD大鼠分成3组,制成脊髓半切洞模型,第1组予损伤后即刻移植细胞,其余2组分别予伤后2周和4周移植等量的细胞,每组动物均饲养1月后处死,观察比较治疗前后动物不同时间的神经功能评分,应用HRP-TMB神经示踪计数伤侧中脑红核大细胞的数量,间接评价脊髓轴索再生的程度.结果无论是神经功能评定还是中脑红核大细胞计数结果,伤后2周和4周组的动物均优于伤后即刻移植组,差异有显著性(P＜0.05), 伤后4周组要优于2周组,但2组间差异无显著性.结论脊髓损伤后延期进行细胞移植效果要优于伤后即刻移植.
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嗅鞘细胞上清液对抗过氧化氢诱导的星形胶质细胞损伤的线粒体机制
目的:研究嗅鞘细胞上清液(olfactory ensheathing cell conditioned medium,OECCM)对星形胶质细胞的保护作用及其线粒体机制.方法:先用500 μmol/L H2O2 损伤星形胶质细胞20 min;再以50%的OECCM继续培养细胞24 h.MTT法检测星形胶质细胞的活性,Hoechst 33342 染色法和蛋白质印迹法检测细胞凋亡及凋亡相关蛋白caspase-3的表达;用JC-1染色法检测线粒体的膜电位.结果:OECCM能减少H2O2诱导的细胞凋亡,减少caspase-3的表达,并且使线粒体膜电位增高.结论:OECCM可以对抗500 μmol/L H2O2诱导的星形胶质细胞凋亡,其机制可能与稳定线粒体膜电位有关.
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嗅鞘细胞对活化的星形胶质细胞的作用
目的:研究体外培养的大鼠嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell,OEC)对活化的星形胶质细胞(astrocytes,AST)的作用.方法:体外培养嗅鞘细胞和星形胶质细胞.星形胶质细胞经纯化传代,细胞融合后利用划伤法得到活化的星形胶质细胞,将嗅鞘细胞与活化的星形胶质细胞共培养24 h后,观察星形胶质细胞增殖能力的改变,以及其表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的变化.结果:活化的星形胶质细胞与嗅鞘细胞共培养后,MTT实验表明其增殖能力增强;免疫荧光染色、RT-PCR和蛋白质印迹法测定结果表明共培养后活化的星形胶质细胞表达的GFAP和CSPG降低.结论:嗅鞘细胞作用于活化后的星形胶质细胞以后,能够促进星形胶质细胞的分裂增殖,同时能够减少星形胶质细胞胶质化,降低抑制性细胞因子的表达.
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嗅鞘细胞移植后脊髓半横断大鼠睫状神经营养因子和FGF-2表达的变化
目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植到损伤的脊髓后,能否分泌睫状神经营养因子(CNTF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2),以及能否引起脊髓组织内CNTF和FGF-2表达的变化及脊髓的细胞有何数量改变.方法:体外分离培养大鼠嗅球嗅鞘细胞,通过免疫荧光细胞化学染色检测其CNTF和FGF.2的表达.将嗅鞘细胞移植入脊髓半横断SD大鼠,观察术后7天和21天嗅鞘细胞在脊髓内的存活情况,并对脊髓组织切片进行CNTF和FGF-2免疫荧光组织化学染色,计数阳性细胞并计算阳性面积百分比.结果:嗅鞘细胞在体外培养和移植后都能表达CNTF和FGF-2.同未移植组对比,移植组脊髓CNTF和FGF-2表达明显增强(P<0.05),神经元和少突胶质细胞数量增加(P<0.05),星型胶质细胞数量无明显改变.结论:嗅鞘细胞移植入损伤的脊髓后能分泌CNTF和FGF-2,并使脊髓组织内CNTF和FGF-2的表达增加,引起神经元和少突胶质细胞数量增加.
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大鼠嗅粘膜原代培养细胞的分类及细胞社会学特性研究
目的:探讨嗅粘膜的细胞社会学特性,为嗅粘膜混合细胞移植治疗中枢神经系统损伤提供可行性研究资料.方法:自成年大鼠鼻中隔活体剪取部分嗅粘膜制成细胞悬液接种于玻璃培养皿,用含10%胎牛血清的F12培养基培养,动态观察细胞的贴壁、生长及分化过程,并用波形蛋白(vimentin)、层粘连蛋白(laminin)、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)及神经生长因子受体p75(nerve growth factor receptor p75, NGFRp75)抗体作免疫细胞化学染色,对阳性细胞进行形态学鉴定.结果:体外培养的嗅粘膜细胞中包含成纤维细胞、神经干细胞、嗅细胞和嗅鞘细胞等,不同类型细胞的形态及生长特性存在差异.结论:嗅粘膜细胞之间具有协调的细胞社会学关系;成体嗅粘膜混合细胞群移植治疗中枢神经系统损伤的可行性具有细胞社会学基础.
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嗅鞘细胞移植在修复损伤脊髓中的作用
一般认为,中枢神经系统损伤后其再生、修复和功能恢复是绝对不可能的,脊髓损伤一直是全世界医疗界棘手的问题.1981年神经学家在基础研究中证实中枢神经损伤后的神经结构修复是可能的,掀起了各国学者对脊髓修复研究的又一次热潮,其中关于细胞移植的研究开展得尤有成效.
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嗅鞘细胞移植治疗帕金森病的研究进展
帕金森病是一种十分常见的神经系统退行性疾病，其发病机制至今尚不明确。目前，帕金森病的治疗以口服药物补充脑内多巴胺为主，但长期服用药物治疗后临床效果可能减弱，且会产生严重的运动并发症。因此，学者们考虑通过移植多巴胺能神经组织的方法，来补充帕金森病患者脑内所缺失的多巴胺能神经元。嗅鞘细胞具有独特的生物学特性，且对中枢神经系统疾病具有较好的治疗作用，已成为当下研究的热点。作者将嗅鞘细胞移植治疗帕金森病的相关研究作一综述。
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嗅鞘细胞条件培养液对PC12细胞神经丝蛋白、突触蛋白、突触素蛋白表达的影响
目的:观察嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)条件培养液对PC12细胞神经丝蛋白(neurofilament protein,NF)、突触蛋白(synapsin)和突触素蛋白(synaptophysin)表达的影响,探讨嗅鞘细胞条件培养液促神经细胞分化生长的作用机制.方法:原代培养并纯化OECs,收集培养上清制备成嗅鞘细胞培养液(OEC culture medium,OECCM),与Pc12细胞培养24、48、72 h,观察细胞形态学变化;通过免疫荧光法检测PC12细胞NF的表达及分布;蛋白质印迹法检测NF、突触蛋白和突触素的相对含量.结果:OECCM培养的PC12细胞长有突起,并随着培养时间的延长,细胞形态酷似神经元;免疫荧光染色显示NF起初在核周分布,OECCM作用后NF的分布范围逐渐增加,其分布面积与β-tubulin分布面积的比值显著增高(P＜0.05).蛋白质印迹法显示OECCM组NF、突触蛋白(synapsin)和突触素蛋白(synaptophysin)的表达水平明显高于对照组(P＜0.05).结论:嗅鞘细胞能分泌一些促PC12细胞分化的因子.这些因子能促进PC12细胞NF骨架的组装,并诱导神经元功能蛋白的表达,使该细胞在结构和功能上向神经元分化.
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大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分裂增殖和免疫细胞化学特性
目的:体外培养大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),观察其形态、分裂增殖和免疫细胞化学特性,探索自体嗅黏膜嗅鞘细胞作为OECs来源的可能性.方法:采用差时贴壁的方法分离培养成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞,相差显微镜下观察细胞形态和分裂增殖;用免疫组化方法观察GFAP、NGFRp75、S-100、NGF、BDNF、NT-3的表达.结果:培养的细胞根据形态来分,可分为双极、多极和偏平状;细胞分裂时先回缩成球形,分裂成两个子球,再伸出突起,变成梭形或多极形.GFAP、NGFRp75、S-100、BDNF和NT-3表达阳性.结论:在含血清培养基上,大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞能正常分裂增殖和分泌神经营养因子.
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大鼠嗅黏膜和嗅球嗅鞘细胞体外分离培养比较
目的:比较大鼠嗅黏膜(olfactory mucosa,OM)和嗅球(olfactory bulb,OB)的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)在体外分离培养中增殖和分化以及生物学特性的差异.方法:取SD大鼠OM和OB用差速贴壁法在体外分离培养OECs,扫描电镜观察两组OECs的形态,并用S-100和p75NGFR免疫荧光抗体双标记检测两组OECs在体外增殖和分化的情况.结果:扫描电镜观察到OM OECs以双极样为主;OB OECs有双极样、三极样和扁圆形3种形态,其中以双极样为主.免疫荧光双标结果显示:OM和OB组均有较多的S-100和p75NGFR双标阳性细胞,OM OECs胞体多为梭形,突起细长:OB OECs的形态多样,有双极样、三极样和扁圆形,胞体呈长梭形、圆形或三角形.两组OECs胞体面积和细胞周长相比较差异均无统计学意义.结论:OM OECs与OB OECs一样都能在体外分离培养与增殖.OM OECs与OB OECs分化成熟后的细胞无明显差异.
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嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的临床研究进展
脊髓损伤(spinal cord injury)的治疗是一个世界性难题,人们尝试过各种各样的方法,包括:(1)应用神经营养因子、生长因子促进轴突再生[1];(2)拮抗抑制轴突再生的生长抑制蛋白[2];(3)外周神经移植[3];(4)细胞移植(雪旺氏细胞,胚胎干细胞等[4]);但都没有明显的效果.
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新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究
目的探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的体外培养和纯化方法,为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础.方法用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs,比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果,根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度,同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察.结果体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞,其突起细长.未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势,三种纯化方法均能使接种14 d后的OECs纯度均值大于75%.p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法.结论新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的;在脊髓损伤再生研究中,较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法,差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法.
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新生大鼠嗅鞘细胞在再生丝素膜上的生长
目的观察新生大鼠嗅鞘细胞在再生丝素膜上的生长情况,探讨再生丝素膜在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中成为细胞培养基质的可能性.方法采用静置贴壁培养法体外培养分离的新生大鼠嗅鞘细胞,免疫酶和免疫荧光方法染色鉴定,观察在再生丝素膜上嗅鞘细胞的生长,并用MTT法测定细胞生长曲线.结果再生丝素膜对新生大鼠嗅鞘细胞的贴壁能力和形态未见明显改变,也未见明显毒性,并能支持细胞正常生长,呈现正常的生长繁殖曲线.结论再生丝素膜对新生大鼠嗅鞘细胞具有良好的细胞相容性.
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成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的分离、培养、纯化与生物学特性的研究
目的 探讨成年大鼠嗅球嗅鞘细胞(OECs)的分离、培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫细胞化学特性.方法 采用原代培养技术,从成年大鼠的嗅球分离培养OECs,用差速贴壁+Thy1.1抗体及补体等方法纯化培养OECs,并用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)扩增OECs,倒置相差显微镜下观察OECs的形态变化特点及生长情况,采用GFAP、NGFRp75、S100等抗体行免疫细胞化学染色,根据NGFRp75免疫细胞化学染色结果统计培养的OECs的纯度,并计算OECs的增殖率.结果 体外培养的成年大鼠OECs主要为双极或三极细胞,其突起细长.差速贴壁+Thy1.1抗体及补体纯化法的纯化效率高于其他两种.免疫细胞化学染色显示,培养的成年大鼠OECs呈现GFAP、NGFRp75、S100蛋白染色阳性.bFGF能明显促进OECs的增殖(P＜0.01),对OECs的形态、纯度没有明显影响.结论 差速贴壁+Thy1.1抗体及补体纯化法是一种高效率的纯化培养OECs的方法,bFGF能明显促进OECs的增殖.
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大鼠嗅鞘细胞移植对脊髓横断损伤的修复作用
目的 观察嗅鞘细胞(OECs)移植后在体内的存活情况和对脊髓横断伤的修复作用.方法 4月龄SD大鼠,体质量250g左右.显露T_9段脊髓,完全横行切断脊髓.A组(20只)在损伤远近端注射由成年SD大鼠嗅球分离、培养、纯化的OECs,B组(20只)在相同位置注射DMEM培养液,C组(10只)单纯做T_9节段的椎板减压.术后观察动物脊髓功能恢复情况,每2周测定1次后肢运动功能(BBB评分法),共12周.术后3个月取损伤段及其临近脊髓标本,做HE染色、嗜银染色、抗NF和p75免疫组化染色.利用p75免疫组化染色来观察OECs在体内存活情况.结果 手术后4周开始有运动功能恢复,在各个时间段BBB运动功能得分A组均显著高于B组(均P<0.001).A、B组都有神经纤维进入损伤区,在损伤近端,神经纤维数量A组显著多于B组(P<0.001),但都显著少于相应节段的C组(P<0.001).经过p75免疫组化的OECs存在于脊髓损伤段周围,远可到距离损伤区边缘1.0cm处.脊髓损伤再生神经纤维的数量与运动功能恢复成正相关(P<0.01).结论 OECs移植具有明显促进脊髓横断伤神经纤维再生和功能恢复的作用.
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免疫吸附法纯化人胚嗅鞘细胞的实验研究
目的:探索分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法.方法:分离人胚嗅球,采用胰酶消化获取单细胞悬液,应用含Forskolin、BPE的DMEM/F12培养基,接种于p75包被的培养皿,培养2周后细胞行免疫组化染色鉴定.结果:培养细胞形态多为2～4极细胞,成纤维细胞少,嗅鞘细胞纯度非常高,嗅鞘细胞标志物p75阳性.结论:嗅鞘细胞体外分离培养条件要求极高,应用p75免疫吸附纯化培养的嗅鞘细胞效果好.
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人胚嗅鞘细胞与胚胎脊髓组织联合移植对大鼠脊髓损伤的治疗作用
目的 探讨人胚嗅鞘细胞(OECS)和大鼠胚胎脊髓组织(ESC)联合移植在促进大鼠横断脊髓轴索再生方面有无协同作用.方法 将体外培养纯化的OECS及新鲜获取的胎鼠脊髓组织用作治疗大鼠脊髓半切洞损伤模型的移植物,通过对动物定期进行行为学评定,结合病理学观察,并通过辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺(HRP-TMB)逆行示踪技术,评价OECS和ESC对神经元存活、纤维再生的影响.结果 OECS和ESC联合移植对损伤脊髓具有明显保护作用并能促进宿主脊髓轴突再生,ESC不能帮助再生轴索返回宿主组织;而OECS除能帮助再生轴索突破胶质屏障外更能使再生轴突髓鞘化,并具有一定的迁移能力.结论 OECS和ESC联合移植在促进大鼠脊髓功能恢复中起到了互补和协同的作用.
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不同培养条件人嗅黏膜嗅鞘细胞生长情况比较
目的：研究鼻黏膜嗅鞘细胞在不同条件尤其在正常脑脊液中的生长情况，以利于实施自体嗅鞘细胞移植。方法设置5种不同培养条件进行比较，了解脑脊液培养条件下细胞的贴壁、增殖、形态学及细胞纯度的变化。结果普通培养基培养一周后改用脑脊液培养对细胞的增殖能力不造成很大影响，细胞形态及纯度也无明显变化。结论使用脑脊液培养作为自体细胞移植前的过渡将规避伦理学风险，临床是可行的。
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嗅鞘细胞促进大鼠坐骨神经损伤后神经功能恢复
目的 研究嗅鞘细胞(Olfactory ensheathing cells,OECs)移植对大鼠坐骨神经损伤后神经再生恢复的作用. 方法 取SD大鼠40只随机分成对照生理盐水(SAL)组和实验(OECs)组,予离断坐骨神经后直接予神经外膜缝合修复,在神经缝合处周围充填可吸收的明胶海绵,SAL组和OECs组明胶海绵内分别给予SAL和体外培养纯化的OECs;术后4、12周分别行大体观察,电生理检查和组织学检查. 结果 术后4、12周,SAL组和OECs组修复神经均有不同程度恢复,OECs组在运动神经传导速度、神经肌肉动作电位幅度和直径数据上有优于SAL组,但统计学上未见明显差异,而在有髓神经纤维数目方面明显优于SAL组(P＜0.05). 结论 在本实验条件下,嗅鞘细胞(OECs)对大鼠坐骨神经损伤后的神经功能恢复有部分的促进作用.
