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成年大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的分离、培养与鉴定
目的在嗅球成鞘细胞(OECs)移植到脊髓可有助于损伤神经纤维再生的基础上,分别对嗅球和嗅粘膜的OECs进行培养,探索自体嗅粘膜作为OECs供体的可能性. 方法根据OECs、成纤维细胞和星形胶质细胞贴壁时间的不同,采用差时贴壁方法分离出OECs,培养14div后进行NGFRp75和GDNF的免疫细胞化学染色. 结果按形态学和免疫组织化学特性,培养的嗅球和嗅粘膜OECs可分为3 类:双极细胞、三级细胞和扁圆细胞,其中以双极细胞多.嗅粘膜的双极成鞘细胞的突起更加细长. 结论差时贴壁细胞分离法是一种简单、经济、实用的成鞘细胞分离方法.鼻腔嗅粘膜OECs的形态学和免疫细胞化学特性与嗅球OECs基本相同,本实验为临床开展自体嗅粘膜OECs修复脊髓损伤的研究提供参考.
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成鼠自体鼻腔嗅粘膜组织和嗅粘膜成鞘细胞系修复脊髓锥体束损伤的实验研究
本研究分为两部分,第一部分用Wistar大鼠40只,将取自大鼠左侧鼻中隔后部嗅粘膜组织作为脊髓移植块(1?mm\+2),植入同体大鼠脊髓(T10)后索内的锥体束缺损处(2?mm).
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阿尔茨海默病患者嗅粘膜免疫病理观察
目前阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)的临床诊断主要依赖临床神经心理学检查,通过排除法得出.国外报道嗅粘膜(olfactory mucosa, OM)免疫病理染色可能成为AD诊断的客观指标,为此我们对OM免疫病理特点及其对AD的临床诊断价值进行了探讨.
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慢性鼻窦炎嗅觉障碍患者嗅上皮超微结构观察
目的观察慢性鼻窦炎嗅觉障碍患者嗅上皮的超微结构变化。方法对35例住院行鼻内窥镜手术治疗伴有嗅觉缺失鼻窦炎患者的嗅上皮取活体组织，光镜下将嗅上皮按病变分为正常、萎缩和呼吸上皮化生组，透射电镜分别观察各组超微结构变化。结果①光镜下正常的嗅上皮细胞表面超微结构出现支持细胞微绒毛消失、嗅泡内微管结构消失或空泡化致嗅泡变形、嗅纤毛变形或减少、少量纤毛化生等改变；②萎缩的嗅上皮超微结构改变的特点：轻、中度萎缩主要为支持细胞上部的细胞器和膜限制性的电子致密囊泡明显减少或消失、空泡化，基底细胞退行性变；重度萎缩为细胞结构不清，多为双层细胞结构，细胞核染色质呈斑块状凝聚、核空泡化或核固缩；细胞质内均出现内质网扩张，线粒体肿胀、嵴排列紊乱、减少或空泡状改变；③呼吸上皮化生区域，丛状纤毛细胞与支持细胞、嗅泡样结构间隔分布，即嗅上皮细胞呈岛状分布。结论炎症导致嗅上皮细胞由表层及里层各种超微结构异常程度与嗅上皮萎缩程度呈正相关；慢性鼻窦炎嗅觉障碍患者嗅上皮超微结构变化与分型分期无关。
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电刺激大鼠嗅粘膜对嗅球酪氨酸羟化酶的影响
电刺激嗅粘膜诱发嗅性诱发电位（olfactory evoked potentials, OEP）作为一项客观而灵敏的电生理检测技术，具有广阔的科研前景。本实验以电刺激大鼠嗅粘膜，成功记录到大鼠OEP，并通过免疫组化的方法观察了电刺激对嗅球神经元中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）表达的影响。
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电刺激嗅粘膜诱发嗅觉诱发电位的实验研究
长期以来,人们一直依赖患者的主观感觉对嗅觉功能进行评判,其可靠性和定量性都很差.在术中全麻状态下更无法进行.为探索一种不受患者主观因素和状态影响的客观测试嗅觉功能的方法,本实验取家兔10只,雌雄不限,体重平均(2.0±0.2)kg,用质量浓度为3.5 g/100 ml戊巴比妥钠溶液腹腔注射(35 mg/kg)麻醉后,将自制刺激电极置于鼻腔嗅区粘膜,记录电极置于同侧头皮表面近嗅球部皮下,参考电极置于对侧相应位置.接地电极置于枕部皮下,在隔声屏蔽室内进行电刺激嗅觉粘膜诱发嗅觉诱发电位的检测.电刺激的提供及信号记录均由日产MEB-5304K型诱发电位仪完成.电刺激条件:脉宽0.5 ms的方波,PPS 2次/s,扫描时间100 ms,叠加20次,刺激强度从0.2～4.0 mA递增.在刺激频率、刺激时间一定的情况下,改变刺激强度,改变鼻腔刺激电极位置.
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大鼠嗅粘膜原代培养细胞的分类及细胞社会学特性研究
目的:探讨嗅粘膜的细胞社会学特性,为嗅粘膜混合细胞移植治疗中枢神经系统损伤提供可行性研究资料.方法:自成年大鼠鼻中隔活体剪取部分嗅粘膜制成细胞悬液接种于玻璃培养皿,用含10%胎牛血清的F12培养基培养,动态观察细胞的贴壁、生长及分化过程,并用波形蛋白(vimentin)、层粘连蛋白(laminin)、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)及神经生长因子受体p75(nerve growth factor receptor p75, NGFRp75)抗体作免疫细胞化学染色,对阳性细胞进行形态学鉴定.结果:体外培养的嗅粘膜细胞中包含成纤维细胞、神经干细胞、嗅细胞和嗅鞘细胞等,不同类型细胞的形态及生长特性存在差异.结论:嗅粘膜细胞之间具有协调的细胞社会学关系;成体嗅粘膜混合细胞群移植治疗中枢神经系统损伤的可行性具有细胞社会学基础.
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慢性鼻窦炎嗅粘膜P物质的观察
慢性鼻窦炎是鼻科常见疾病，其发病往往与感染、变态反应相关，这类患者常伴有嗅觉障碍。为进一步研究慢性鼻窦炎、嗅觉障碍与变态反应的相关性，我们对慢性鼻窦炎患者嗅粘膜进行了P物质(substance P)的观察。材料和方法1 标本来源患者组：选自1997年4～8月北京同仁医院耳鼻咽喉科因慢性鼻窦炎入院行鼻窦内窥镜手术患者55例，男性31例，女性24例，年龄范围1 6～65岁，平均年龄42.6岁。术前经鼻窦CT检查，并根据1996年郑州耳鼻咽喉科学会研究的慢性鼻窦炎分型、分期标准进行诊断。术中取患者嗅粘膜。对照组：选用单纯鼻中隔偏曲行鼻中隔矫正术的病人11例，取其嗅粘膜作对照。2 嗅粘膜P物质免疫组化检测标本用10％的中性福尔马林液固定，固定时间约24小时。标本按石蜡切片常规脱水、浸蜡、包埋，用轮转式石蜡切片机切片，采用SLAB免疫组织化学染色方法试剂：一抗采用兔抗多克隆SP抗体，二抗为生物素性山羊抗兔IgG，辣根酶标记链霉素亲和。显色剂：底物二氨基联苯胺(DAB)。同时设有阳性对照和阴性对照。P物质阳性标准：同阳性对照比较，胞核或胞浆着棕色，胞核颜色较深，胞浆内有棕色、粗大颗粒的细胞为P物质阳性细胞，并由阴性对照排除非特异性染色，根据阳性细胞的计数分为阴性，全片未见P物质阳性细胞;P物质阳性1分，全片少量散在P物质阳性细胞；P物质阳性2分，较多呈阳性细胞(一个视野内>5个阳性细胞)。
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嗅粘膜源性嗅鞘细胞移植联合NGF对脊髓损伤的修复
目的:探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)移植联合神经生长因子(nerve growth factor, NGF)修复脊髓急性损伤的可行性和疗效,并观察二者的协同作用.方法:自成年Wistar大鼠嗅粘膜取材,采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制纯化相结合的方法培养纯化嗅鞘细胞.建立大鼠脊髓半切模型,并随机分成对照组(A组),OECs组(B组)和OECs+NGF组(C组),在不同时段进行肢体活动的BBB评分.8周后取脊髓标本进行组织学检查,评价对脊髓损伤的修复作用.结果:B组和C组2周后BBB评分高于A组(P＜0.05),C组自4周后明显优于A组和B组(P＜0.01).组织学检查表明,C组可明显促进轴突再生.结论:OECs联合NGF具有良好的脊髓损伤修复作用,且二者具有明显的协同作用.
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大鼠嗅粘膜内细胞色素P450 2A3的发育表达
目的:研究细胞色素P450 2A3(cytochrome P450 2A3,CYP2A3)在大鼠嗅粘膜表达变化的规律.方法:应用免疫组化方法观察胎鼠、幼鼠及成年鼠嗅粘膜内CYP2A3的免疫表达.结果:大鼠嗅粘膜内CYP2A3的表达始于孕17 d,随胎仔发育表达不断增强,生后3周达一峰值,并持续增长至成年期.固有层Bowman's腺细胞内CYP2A3表达强度从出生后3周开始超出支持细胞.结论:嗅粘膜内CYP2A3酶表达与嗅感受神经元功能发育基本同步,二者可能存在共同的生长调控因子,而Bowman's腺细胞是嗅粘膜内CYP2A3酶表达及发挥功能活性的主要部位.
关键词： 细胞色素P450 嗅粘膜 Sprague-Dawley大鼠 -
人嗅粘膜内细胞色素P450 2A6的发育表达
目的:探讨细胞色素P450 2A6(cytochromeP450 2A6,CYP2A6)在不同胎龄胎儿嗅粘膜内的发育表达.方法:应用免疫组化法观察CYP2A6在胚胎发育16、18、22、28和38周胎儿嗅粘膜内的表达情况.结果:CYP2A6的表达始于孕18周,在支持细胞核上区胞浆顶端阳性着色,彼此相连呈一条带状,上皮中、下层个别支持细胞核下区也呈现稍弱的免疫阳性反应.到孕22周时,固有层Bowman腺细胞浆内开始出现CYP2A6阳性着色,但此时Bowman腺体数量较少,腺细胞仅单层排列围成腺腔.随胎儿发育CYP2A6表达强度不断增大,孕28周时整个支持细胞的阳性着色更加清晰,固有层内Bowman腺数量明显增多,并且腺细胞呈多层排列,胞浆内CYP2A6阳性强度开始超出上皮层内的支持细胞.孕38周时免疫反应达峰值,其中支持细胞的染色勾画出其独特的极性结构:细胞核上区宽阔,胞浆内CYP2A6染色清晰,而核下区逐渐缩窄,以足状突的形式附着于基膜上.结论:人胎儿发育时期嗅粘膜内有CYP2A6酶表达,并且与嗅感受神经元发育基本同步,二者可能存在共同的调控因子.固有层Bowman腺细胞内CYP2A6的开始表达时间晚于上皮层支持细胞,但却是嗅粘膜内CYP2A6表达的主要部位以及嗅素代谢转化的主要场所.
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人鼻腔嗅粘膜嗅鞘细胞的原代培养和免疫组化观察
目的 建立人鼻腔嗅粘膜嗅鞘细胞(OECs)的体外培养方法. 方法 利用鼻窦镜选取上鼻甲嗅区粘膜,原代培养嗅鞘细胞,进行形态学观察. 结果 成功培养出人鼻腔嗅粘膜OECs,为扁平的双极、多极形态,对P75、GFAP呈阳性反应,纯度在5%左右. 结论 人鼻腔嗅粘膜培养OECs的方法实用可行,但须在取材部位和纯化方面进一步探讨.
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嗅鞘细胞的分离、培养和纯化技术及应用研究进展
嗅鞘细胞(OECS)是存在于嗅觉系统中的一种特殊类型的胶质细胞,它起源于嗅基底膜,分布在嗅球、嗅神经并可伴随嗅束迁徙入脑.它不同于星形胶质细胞和雪旺细胞,但同时具有这两种细胞的特性,存在并迁徙于周围神经和中枢神经[1].
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慢性鼻窦炎鼻息肉伴发嗅觉障碍病人iNOS在嗅粘膜中的表达
目的探讨诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)在慢性鼻窦炎鼻息肉嗅觉障碍发病过程中的作用.方法30例慢性鼻窦炎嗅觉障碍病人经临床分型分期,行嗅觉功能检查后,取嗅粘膜标本,行NOS的免疫组化染色,光镜观察.结果慢性鼻窦炎鼻息肉2型2,3期和3型的嗅粘膜中iNOS的表达显著高于1型和2型1期(P＜0.05).并与嗅觉障碍的严重程度呈正相关.结论iNOS可能参与了慢性鼻窦炎所致嗅觉障碍的嗅觉损害过程,损害程度与慢性鼻窦炎鼻息肉的临床分型分期有关.
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成年大鼠嗅粘膜细胞原代培养及形态学研究
为了探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞(OECs)的分离与纯化培养方法并对其形态学进行研究,我们自鼻腔嗅粘膜取材后采用差速贴壁、机械刮除和阿糖胞苷(Ara-c)抑制相结合的纯化培养方法培养嗅粘膜细胞,并分不同阶段进行镜下观察及p75NGFR和GFAP免疫组化染色鉴定.结果显示,自嗅粘膜组织可以培养出四种细胞:梭形细胞、双极细胞、窝形细胞和大细胞.其中大部分梭形和双极细胞呈p75NGFR或GFAP免疫反应阳性,属于OECs.结果提示本文介绍的培养方法可以培养出嗅粘膜OECs;差速贴壁、机械刮除和Ara-c抑制相结合方法可纯化OECs.
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成年大鼠活体嗅粘膜原代培养细胞中神经干细胞的生长特性及形态学观察
为建立成年活体嗅粘膜神经干细胞的简便、实用的体外培养方法,进而为神经干细胞自体移植治疗中枢神经系统损伤的研究提供更为安全的候选细胞,本实验自成年大鼠活体分离剪取部分嗅粘膜经胰酶消化制成细胞悬液,接种于玻璃培养皿,用含10%胎牛血清的F12培养基培养,动态观察神经干细胞克隆球的形成及分化过程,并用nestin、NSE、GFAP、vimentin及laminin等抗体作免疫细胞化学染色,对阳性细胞进行形态学鉴定.结果显示,成年大鼠经嗅粘膜活体取材后,可长期存活.成体嗅粘膜细胞混合体外培养时不同类型细胞的贴壁时间存在差异,神经干细胞呈球形,不直接贴附于培养皿,仅粘着在首先贴壁的扁平基底细胞上分裂形成克隆球,球内细胞nestin免疫细胞化学染色阳性.原代培养14 d后克隆球不再生长,球周细胞逐渐向外迁移分化为嗅细胞和嗅鞘细胞.提示,成体嗅粘膜神经干细胞可在普通培养基中形成干细胞克隆球,嗅粘膜中的其它细胞作为神经干细胞的基底饲养细胞有助于干细胞克隆球的形成;活体分离成体嗅粘膜作混合细胞体外培养获取神经干细胞的方法简便、安全、可行;本结果为嗅粘膜神经干细胞自体移植治疗中枢神经系统损伤的可行性研究提供了动物实验资料.
