首页 > 文献资料
-
增强免疫组化检测方法的探讨
近,在宫颈癌病因多因素分析研究中,对1995~1999年收集的46例经病理学诊断的宫颈癌和38例慢性宫颈炎的活检标本,采用免疫组织化学方法做了PCNA、p53、C-erbB-2、RB、E6等指标的检测。在免疫组化技术的具体操作和运用中,如何增强其检测效果,减少非特异性染色,摸索出了一些经验,现介绍如下。1 材料与方法1.1 免疫生化试剂 SP试剂盒、DAB试剂盒、单克隆抗体购于北京中山生物技术有限公司(系美国ZYMED公司的产品)。1.2 标本 系病理科宫颈癌手术送检标本和部分活检标本。1.3 方法 经10%福尔马林固定,常规石蜡制片。切片厚度为5μm,采用SP法做多种抗体免疫组化染色,同时设阳性、阴性和空白对照。选取相应的阳性切片,分4组对影响免疫组化染色效果的部分因素作对比实验。①抗原修复的不同方法:酶消化、微波炉、压力煮沸;②一抗稀释度1∶30、1∶50、1∶100;③一抗孵育时间:4℃过夜、37℃1~2h;④二抗、三抗的孵育时间:37℃30min、37℃45min。基本步骤:切片常规脱蜡至水,H2O2处理10~15min,抗原修复,PBS冲洗5min×3次,加山羊血清10~15min,加一抗孵育。PBS洗,加二抗孵育,PBS洗,加三抗孵育,PBS冲洗,DAB显色,苏木素复染,脱水、透明、封固。
-
用PCR检测隐孢子虫
隐孢子虫(Cryptosporidium)是Tyzzer于1907年首先在实验小鼠胃肠道内发现的一种能广泛感染脊椎动物的寄生原虫。该虫已被公认为人和动物腹泻的重要病原体,是引起三大肠道病病原体之一,已受到国内外学者的重视。在发达国家与发展中国家腹泻病人中,隐孢子虫感染率分别为0.6%~7.3%与3%~13%。国内1986年陈义民等在兰州犊牛中首次发现隐孢子虫,次年韩范等在南京首次发现人体病例[1]。此后许多地区均报道有隐孢子虫感染。该病多发于免疫抑制的患者,而免疫功能正常虽无临床症状者但也能够排出卵囊,污染环境。更要注意的是隐孢子虫卵囊在自来水中存活率很高,在1993年正是隐孢子虫污染了饮用水,造成美国的Milnoukee暴发400 000人的大流行[2]。1995年报道小剂量(50%感染剂量ID50为132个卵囊)的卵囊足以引起血清呈阴性的健康自愿受试者感染[3]。由于隐孢子虫形体小,对恶劣环境有较强的抵抗力,无特异性染色,光镜下缺乏明显特征,少量卵囊足以使人感染,因而建立一种敏感性高、特异性强的的检测方法是当前隐孢子虫病防治和流行病学调查研究工作迫切需要解决的问题之一。近年来发展起来的聚合酶链式反应(PCR)技术,有快速、简便、准确、高度敏感与高度特异等优点。Laxer等[4]和Webster等[5]先后将该技术成功地应用于隐孢子虫检测,为建立敏感性高、特异性强的隐孢子虫检测方法开辟新途径。本文就当前在检测隐孢子虫中所使用的PCR方法综述如下。
-
外周神经碳酸酐酶染色法的体会
碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)又称碳酸脱水酶,是一种催化CO2水合反应和碳酸脱水反应的酶,在调节各种组织电解质、液体和酸碱平衡中起重要作用.CA广泛分布于红细胞、胃小管上皮细胞、胃腺壁细胞、破骨细胞、胰腺、唾液腺及神经胶质细胞中.在评价周围神经趋化性再生作用的强弱、鉴别感觉神经纤维和运动神经纤维时常用碳酸酐酶组织化学法作定量或半定量评价.Riley[1]于1981年将碳酸酐酶法用于鉴别外周神经的感觉神经,其酶染色的作用结果是形成黑色颗粒,此法能使感觉神经轴突着色,而运动神经纤维不着色.但由于这种方法在染色时非特异性染色太强,影响结果判定.我们在实际操作中对此法进行改进,提高了染色效果,报告如下.
-
中医科研中应用免疫组化减少非特异性染色的方法
免疫组化技术,因具有高度的敏感性和精确性已作为常规项目被广泛应用于中医药科研、研究生培养工作,但是由于在中医领域应用较晚,在方法和认识上还有一些局限,使初次应用者不能很好地区分和尽量减少非特异性染色,造成阳性和假阳性混淆不清,影响了诊断结果的客观性.因此在操作中应尽量减少非特异染色的出现,现将实际操作中摸索出的体会和方法介绍如下.
-
谈做好免疫组化的体会
免疫组织化学技术是一项技术性很强的综合性技术,它包括酶消化、抗原修复、抗体的稀释、内源性过氧化物酶的阻断、非特异性染色的消除、染色对照的准确设计等.总结多年的工作经验,本文作者就如何做好一张结构好、背景清晰可靠的免疫组化切片谈谈体会.
-
双抗夹心-ELISA快速诊断隐孢子虫病
隐孢子虫病为人兽共患的寄生虫病,常引起牛腹泻及产奶量下降等,也会引起婴幼儿和免疫缺陷患者腹泻.目前,诊断方法主要有直接镜检、染色镜检、免疫学方法(如ELISA和IFAT)及PCR方法等.直接镜检法费时、费力、检出率低且易与酵母菌相混淆,染色法也存在非特异性染色及检出率低的问题,IFAT和PCR方法虽特异性和敏感性较强,但要求的仪器设备和试剂等均较高,基层难以推广.为寻找快速、特异性较高且可直接判定结果的诊断方法,特进行本试验.
-
慢性鼻窦炎嗅粘膜P物质的观察
慢性鼻窦炎是鼻科常见疾病,其发病往往与感染、变态反应相关,这类患者常伴有嗅觉障碍。为进一步研究慢性鼻窦炎、嗅觉障碍与变态反应的相关性,我们对慢性鼻窦炎患者嗅粘膜进行了P物质(substance P)的观察。材料和方法1 标本来源患者组:选自1997年4~8月北京同仁医院耳鼻咽喉科因慢性鼻窦炎入院行鼻窦内窥镜手术患者55例,男性31例,女性24例,年龄范围1 6~65岁,平均年龄42.6岁。术前经鼻窦CT检查,并根据1996年郑州耳鼻咽喉科学会研究的慢性鼻窦炎分型、分期标准进行诊断。术中取患者嗅粘膜。对照组:选用单纯鼻中隔偏曲行鼻中隔矫正术的病人11例,取其嗅粘膜作对照。2 嗅粘膜P物质免疫组化检测标本用10%的中性福尔马林液固定,固定时间约24小时。标本按石蜡切片常规脱水、浸蜡、包埋,用轮转式石蜡切片机切片,采用SLAB免疫组织化学染色方法试剂:一抗采用兔抗多克隆SP抗体,二抗为生物素性山羊抗兔IgG,辣根酶标记链霉素亲和。显色剂:底物二氨基联苯胺(DAB)。同时设有阳性对照和阴性对照。P物质阳性标准:同阳性对照比较,胞核或胞浆着棕色,胞核颜色较深,胞浆内有棕色、粗大颗粒的细胞为P物质阳性细胞,并由阴性对照排除非特异性染色,根据阳性细胞的计数分为阴性,全片未见P物质阳性细胞;P物质阳性1分,全片少量散在P物质阳性细胞;P物质阳性2分,较多呈阳性细胞(一个视野内>5个阳性细胞)。
-
消除免疫组化非特异性染色方法研究(附60例分析)
免疫组化标记结果的判断是以观察组织片阳性或阴性染色为前提,观察阳性染色颗粒定位有助于区别特异性和非特异性背景的染色,如何消除和克服影响抗原定位的各种因素,是确保结果准确性的重要环节.在免疫组化染色中,我们注意了以下几点:染色过程中防止切片干燥;操作过程中PBS液(pH7.2)冲洗充分;用新配制的3%H2O2封闭10分钟;用免疫动物血清封闭10分钟;一抗孵育60分钟;二抗、三抗各孵育10分钟;DAB显影3~10分钟,镜下观察,仍然有时会出现非特异性染色.如何解决这一问题,在正常肾脏组织中含有多量内源性生物素,文献报道可用蛋清封闭能达到较好的染色效果.我们选取本院2002~2003年肾肿瘤组织60例分蛋清组和非蛋清组进行P170、GSTπ对照实验.
-
胰岛B细胞、A细胞的快速双染
组织学特殊染色技术及免疫组织化学技术已广泛应用于基础医学和临床医学的科研工作中.本快速染色法即用组织学醛品红染色法和免疫组织化学SP法在同一张切片上对胰岛B细胞和A细胞进行了双重染色,取得较好的效果,现作简单介绍.取大鼠胰腺,Bouin液固定,石蜡包埋,切5μm厚切片.双染步骤如下:第一步,胰岛B细胞的醛品红染色:切片脱蜡到水;入0.25%浓硫酸和0.25%高锰酸钾等量混和液中3min;蒸馏水洗后入5%草酸2min;蒸馏水洗;再经70%酒精后入醛品红染液15min;70%酒精分色后,蒸馏水洗.第二步,胰岛A细胞的免疫组化染色:将经醛品红染色后的切片,入3%甲醇双氧水室温孵育15min;蒸馏水洗后枸橼酸缓冲液(0.01M,pH6.0)(电炉加热煮沸92 ℃~98℃)进行抗原修复10min;PBS浸泡5min后,用正常羊血清室温封闭3 0min;弃去多余羊血清,滴加一抗(抗胰高血糖素抗体,1∶1500),37℃,孵育2hr;PBS室温洗10min后,滴加生物素标记的二抗,37℃,孵育40min ;PBS室温洗10min后,滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃,孵育40m in;PBS室温洗10min,DAB显色.结果及讨论:此染色方法在同一张切片上所观察到的胰岛B细胞呈蓝紫色,而胰岛A细胞呈棕黄色,两者颜色对比清晰.细胞核不着色.本方法可在一个工作日内完成,即提高了工作效率,又减少了免疫组织化学多重染色中步骤多、时间长,易受外界因素影响的限制,进而降低了非特异性染色.因此,该方法在科研工作中具有一定的应用价值.
-
Ⅰ抗孵育时间对免疫组织化学实验结果的影响
众所周知,抗原与抗体之间的结合具有高度的特异性,免疫组织化学技术应用这一原理,对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究.在神经科学领域,此项技术是不可缺少的.免疫组织化学染色方法有多种类型,但在染色过程中都需要采取一些基本的技术方法,以增强抗原、抗体的特异性反应,降低或消除非特异性反应,使染色达到佳效果.其中增强特异性染色的方法有多种,调整I抗孵肓时间是其中之一.本文探讨了不同的I抗时间对免疫组织化学实验结果的影响.
-
微波修复在冰冻切片免疫组化中的应用
微波修复法多用于石蜡切片,我们在长期的研究生免疫组化教学过程中,实行改良,将微波抗原修复法用于冰冻切片,取得了满意的效果,方法如:1.常规固定取脑组织冰冻切片.2.漂洗后3%H2 O2封闭10分钟,蒸馏水洗2分钟3次.3.微波抗原修复:入柠檬酸盐缓冲液(PH6. 0),用微波或电炉加热,循环3次后入1%BSA孵育15分钟.4.入一抗30分钟,转入二抗 20分钟,三抗20分钟,显色.结果讨论:1.与对照切片成比,阳性细胞染色增强,背景变浅,阳性检出率提高.由于常规的冰冻切片免疫组化方法所用的固定剂多含甲醛,醛基与蛋白质中的氨基交联,使抗原决定簇被掩盖,影响了免疫组化染色结果,使背景染色较深,阳性检出率较低.且这种作用随固定时间的增长而加重,用微波修复抗原的方法,可以使抗原决定簇暴露,有利于抗体结合.此外,部分因固定而被损伤的抗原决定簇也得到修复,因此能提高抗原的阳性检出率,增加染色强度,降低背景的非特异性染色.2.染色时间大大缩短.以往为保证染色效果,常规一抗孵育时间较长(12-24小时),而用微波修复后仅需 30分钟.因为微波修复法可使抗原暴露,利于抗原抗体结合,提高了反应速度,节省了时间 .综上所述,在冰冻切片中使用微波抗原修复的方法值得推广.