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酶消化法体外分离培养的大鼠嗅鞘细胞形态及表型特征
目的:目前国内外研究介绍的嗅鞘细胞培养方法存在繁杂或重复性差的问题,不利于实际应用.为此实验应用酶消化法体外分离培养大鼠嗅鞘细胞,观察其形态学及表型特征.方法:实验于2005-11/2006-03在上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所完成.①选取新生1周龄雄性SD大鼠1只,浸人体积分数为0.75的乙醇中3 min,碘伏消毒.打开前颅,暴露嗅球,完整取下两个嗅球,放人4℃预冷的DMEM抗菌液中清洗2遍,洗掉嗅球表面的血液等杂质,剥下嗅球被膜,将嗅球用眼科剪剪碎,加入质量浓度为2.5 g/L的胰酶,在37℃孵育箱磁力搅拌下孵育15 min,DMEM终止消化.细胞液过100μm细胞筛,离心去除上清液,用DMEM稀释细胞浓度至1×109L-1,种植于无包被处理的6 孔细胞培养板内常规培养.按差速贴壁法在培养18～20 h后吸出细胞悬液,重新种植于包被神经生长因子低亲和力受体p75的6孔细胞培养板内.观察细胞生长情况,每2～3 d换液1次,培养14 d.②将培养不同时间的嗅球成鞘细胞于倒置显微镜、透射电镜下观察其形态变化,并行苏木精-伊红染色.使用免疫组化法检测嗅鞘细胞的特征性标志神经生长因子低亲和力受体p75的表达情况,阳性表达为棕黄色,无着色为阴性.结果:①倒置显微镜形态学观察:差速贴壁培养第2天可见有较多嗅鞘细胞贴壁生长,细胞突起较短,胞体较大,透亮度一般,成团或散在生长,较难辨认细胞的形态.5～6 d可见较典型的嗅鞘细胞形状,主要以梭形和多突起细胞为主,细胞立体感强、透亮、杂质细胞较少、本底清楚,亦可见有少量成纤维细胞开始生长.9 d时嗅鞘细胞数量明显增加,其生长方向呈较一致的条索状.至14 d无论在细胞数量及质量上都呈明显的降低趋势.②苏木精-伊红染色结果:细胞多呈梭形,还可见扁平细胞,核为圆形或椭圆形,有时见双核,胞浆充实无空泡.③透射电镜形态学观察:细胞形态多为双极梭形,少数为3极,核不规则,核膜明显,可见核仁,染色质均匀分布于核中,异染色质可在核膜下形成块状结构,胞体表面有伪足样短突起,胞浆内有丰富的粗面内质网系统及线粒体.胞膜有时可见伪足样突起形成皱褶.④神经牛长因子低亲和力受体p75免疫组化检测结果:大鼠嗅鞘细胞神经生长因子低亲和力受体p75免疫反应呈阳性.结论:酶消化法体外分离培养的大鼠嗅鞘细胞表达特征性标志神经生长因子低亲和力受体p75.
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预损伤嗅黏膜对自体嗅鞘细胞体外培养的作用
目的:比较预损伤嗅黏膜与正常嗅黏膜来源的嗅鞘细胞生长特性和生物学活性的差异.方法:雄性成年SD大鼠10只,随机分为嗅黏膜损伤组、正常组.5只,组.嗅黏膜损伤组大鼠麻醉后采用自制弯头针,深入鼻腔内直至鼻中隔后1/3处,针尖抵住鼻中隔后切割数下至出血,填塞酒精棉条压迫止血.正常组大鼠不做任何处理.伤后7 d取两组大鼠鼻中隔,将双侧鼻黏膜后1/3从鼻中隔刮下,胰酶消化后体外分离培养嗅黏膜嗅鞘细胞,调整浓度至1×109 L-1,采用改良NASH差速贴壁法进行纯化.结果:嗅鞘细胞纯度达70%时.正常组需14 d,嗅黏膜损伤组需12 d.正常组培养7 d后细胞进入对数期,嗅黏膜损伤组培养5 d后细胞进入对数期,两组嗅鞘细胞进入平台期后生长趋于缓慢,数量维持在106左右.在细胞生长周期的相同时间点.嗅黏膜损伤组嗅鞘细胞活性大于正常组(t=19.001 3,P<0.001),两组嗅鞘细胞分泌的神经营养因子3质量浓度基本相似(P>0.05).结论:预损伤处理嗅黏膜能够加快嗅黏膜嗅鞘细胞的增殖分化,且活性较高.
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壳聚糖支架复合嗅鞘细胞修复坐骨神经损伤
背景：嗅鞘细胞可促进中枢神经损伤修复。将壳聚糖与胶原结合制备复合工程材料，已经广泛应用于组织工程化神经导管的构建。
目的：探讨嗅鞘细胞复合壳聚糖用于治疗大鼠坐骨神经损伤的修复作用。
方法：建立坐骨神经缺损大鼠模型，用联合培养的原代培养大鼠嗅鞘细胞和壳聚糖支架连接于缺损处，设为嗅鞘细胞结合壳聚糖组；单纯壳聚糖支架组用单纯壳聚糖支架连接缺损；空白单纯壳聚糖支架组不作任何处理。
结果与结论：建模后1-4周分别检测大鼠坐骨神经功能指数，运动诱发电位潜伏期以及组织学检查发现，与嗅鞘细胞结合壳聚糖组大鼠坐骨神经功能指数显著升高(P<0.05)，运动诱发电位潜伏期显著低于单纯壳聚糖支架组和空白对照组(P<0.01)，且嗅鞘细胞结合壳聚糖组有新生的神经达到远侧端，周围少有炎症反应。说明嗅鞘细胞结合壳聚糖支架修复坐骨神经损伤效果较好。 -
黄芪注射液对体外培养嗅鞘细胞增殖及其分泌神经营养因子的影响
背景:单独黄芪注射或嗅鞘细胞移植均可促进多种神经元的存活及脊髓损伤后神经功能的恢复,若联合嗅鞘细胞移植和中药黄芪注射液治疗脊髓损伤,是否可达到更好临床效果?目的:观察黄芪注射液对嗅鞘细胞增埴及其分泌神经营养因子的影响.方法:分离培养新生24 h内SD大鼠嗅鞘细胞并纯化,采用免疫组织化学方法鉴定.取培养至第8天的嗅鞘细胞,种植于多聚赖氨酸包被的96孔板,置于37℃、体积分数5%CO2培养箱饥饿24 h后,加入2mg/L,20mg/L,200mg/L,2 g/L,20 g/L黄茛注射液作用24 h,采用MTT法和流式细胞仪检测黄芪注射液对嗅鞘细胞增殖的影响:采用ELISA法测定培养上清中胶质细胞源性神经营养因子的水平.以血清培养液组为阴性对照.结果与结论:与阴性对照组比较,2,20 mg/L质量浓度黄芪注射液可明显促进嗅鞘细胞增殖(P＜0.05,P＜0.01):不同质量浓度黄芪注射液均增加嗅鞘细胞G1细胞比例,减少S、G2期细胞所占比例,但差异无显著性意义(P＞0.05),但各质量浓度黄芪注射液均显著减少嗅鞘细胞凋亡数量(P＜0.05):2 mg/L质量浓度黄芪能对嗅鞘细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子有显著的促进作用.结果说明黄芪注射液可协同嗅鞘细胞促进脊髓损伤的恢复.
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嗅鞘细胞静脉移植治疗脊髓损伤
背景:嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤在众多疗法中效果较佳,成为有前景的治疗方法之一.目前移植方法为局部移植,存在操作复杂、创伤大、重复移植治疗困难等缺点.寻找一种简单易行且疗效好的移植方法成为各国学者研究的热点.目的:分析嗅鞘细胞静脉移植治疗脊髓损伤的可行性和疗效.方法:制备Wistar 大鼠脊髓半切模型,随机分4 组:嗅鞘细胞髓内局部移植组、嗅鞘细胞静脉移植组、D/F12 静脉移植组和空白对照组.定期行CBS 功能评分及组织学检查,评价脊髓修复情况.结果与结论:嗅鞘细胞髓内局部移植组、嗅鞘细胞静脉移植组的功能恢复和组织学改变优于D/F12 静脉移植组和空白对照组,嗅鞘细胞髓内局部移植组、嗅鞘细胞静脉移植组间无显著差别.说明嗅鞘细胞静脉移植可向脊髓损伤部位迁移并修复脊髓损伤,其疗效与嗅鞘细胞髓内局部移植相当.
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以差速贴壁与化学药物并胰酶限时消化法纯化新生大鼠嗅鞘细胞:优于单一差速贴壁和化学药物法吗?
背景:目前国内外对嗅鞘细胞培养条件的报道各不相同,个别方法重复性较差,不利于实际应用.目的:观察差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞的效果,并与化学药物法、差速贴壁法培养结果进行比较.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-06在福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系实验室完成.材料:新生2 d的SD大鼠8只,由福建医科大学试验动物中心提供.方法:无菌条件下完整取出大鼠双侧嗅球,剥除嗅球表面的软脑膜及毛细血管网,剪成0.5 mm~3的小块进行胰蛋白酶消化,过筛后按4.0×10~8L~(-1)密度种植于包被多聚左旋赖氨酸的培养瓶中进行原代培养.设立4组:①未经纯化的常规对照组.②化学药物组加入5 μmol/L阿糖胞苷抑制成纤维细胞分裂.③差速贴壁组采用Nash差速贴壁法纯化嗅鞘细胞.④差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组首先采用Nash差速贴壁法去除大部分成纤维细胞,而后对于少量残留的成纤维细胞加入阿糖胞苷处理,培养6 d贴壁细胞大部分融合后,加入1.25 g/L胰蛋白酶消化1 min,显微镜下见突起回缩、细胞变圆、少量细胞浮起时终止消化.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态,NGFR p75免疫细胞荧光染色结果.结果:体外培养的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长;未经纯化的常规对照组培养7 d时视野内成纤维细胞已达60%以上,至14 d成纤维细胞完全长满;经过纯化处理的另外3组始终以嗅鞘细胞居多,嗅鞘细胞的形态与原代基本相同.存活的双极和3极嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性反应,但化学药物组、差速贴壁组嗅鞘细胞纯度偏低,仅为75%:差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组嗅鞘细胞纯化效率明显增高,达85%以上.结论:实验结果证实了差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法的三合一操作技术,是一种高效率的纯化培养嗅球嗅鞘细胞的方法.
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细胞联合移植修复大鼠脊髓损伤的可行性
背景:嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞均可修复脊髓损伤,两者联合能否发挥出更佳的修复效果还不太清楚.目的:观察嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞联合移植修复脊髓损伤的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/2007-10在临沂市人民医院和昆明医学院完成.材料:健康清洁级成年SD大鼠,雌性,体质量220～280 g,分为:正常对照组(n=5)、嗅鞘细胞移植组(n=10)、骨髓间充质干细胞移植组(n=10)、联合细胞移植组(n=10)、手术对照组(n=10).方法:分离大鼠嗅球组织和股骨,分离培养嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞.暴露大鼠脊髓予以尖刀离断制备完伞脊髓损伤动物模型,正常对照组仅打开椎板未行脊髓离断,嗅鞘细胞移植组、骨髓间充质干细胞移植组、联合移植组分别在断端及远近端注射嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞及嗅鞘细胞+骨髓间充质干细胞悬液,采取3点注射,3点的注射深度分别为0.5 mm、1.0 mm和1.5mm.手术埘照组在脊髓离断后仅注射培养基.主要观察指标:将嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞制成细胞悬液后接种培养,并应用P75抗体和BrdU抗体对联合培养的细胞进行免疫荧光鉴定.移植后评定大鼠脊髓功能恢复情况,并观察病理学改变和细胞存活情况.结果:联合培养的细胞部分相互编织成网,部分呈条索状,荧光鉴定双标阳性者为嗅鞘细胞,只发红色荧光而不发绿色荧光者为骨髓间充质干细胞.移植嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞的大鼠脊髓功能均有改善,移植4周后,联合移植组脊髓功能恢复优于细胞移植组.病理学观察显示,手术对照组脊髓结构破坏严重,损伤处可见大量空洞及神经元胞体萎缩,周围存在较多的空洞及组织液化,细胞数目较少,神经纤维排列紊乱;移植鞘细胞及骨髓间充质干细胞后脊髓结构仍破坏严重,但是空洞面积较少,有较多细胞存在,神经纤维排列较为整齐,荧光显微镜下见脊髓损伤处有较多的细胞核发出红色荧光,在脊髓损伤处的远近端也见有较多阳性细胞存在,联合移植组可见两种细胞同时存在,但细胞分布乱,无明显的捧列方向,未见明显的迁徙现象.结论:嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞在体外可以很好的联合培养,修复脊髓损伤,并且联合移植的恢复效果较单一细胞移植更为理想.
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胚胎嗅鞘细胞移植治疗脊髓炎后遗症:32例应用ASIA评分自身对照
背景:动物实验研究已证实,采用细胞移植、神经营养因子注入或移植等方法可改变损伤脊髓局部环境,促使损伤脊髓恢复部分功能.目的:开展嗅鞘细胞移植治疗脊髓炎后遗症的临床实验,观察其对脊髓损伤的恢复作用.设计:非随机自身对照.单位:山东省泰安荣军医院外二科病房.对象:选择2004-06/2007-07来源于全国各地的陈旧性脊髓炎患者32例,伤后时间为0.5～7年.患者经各种传统治疗及肢体功能锻炼后神经功能无明显改善,并遗留各种感觉运动及植物神经功能障碍.男21例,女11例,年龄5～48岁,急性病毒性脊髓炎18例,急性化脓性脊髓炎8例,结核性脊髓炎6例,发病后均曾给予大剂量甲基强地松龙、地塞米松、抗炎、抗免疫及各种神经营养药物治疗.26例临床表现均为完全性损伤.6例为不完全性损伤,患者对治疗知情同意,治疗方案经过医院伦理委员会批准.胚胎嗅球来自流产胚胎,由患者或家属自愿捐献.方法:取胚胎嗅球,经细胞分离、培养、纯化7～14 d,后消化成单细胞混悬液,然后在手术显微镜下移植到患者损伤脊髓区域的上下方.术后2周～2个月,采用2000年美国脊髓损伤学会制定的ASIA评分标准进行术后评定,并进行手术前后对比.主要观察指标:①感觉功能变化.②运动功能变化.结果:嗅鞘细胞移植术后0.5-2年,32例患者感觉和运动功能均有明显改善(运动功能:51.53±13.41,55.72±10.50;轻触觉:63.06±15.98,69.53±11.68;疼痛觉:64.03±15.01,69.50±12.20,P均＜0.01).结论:嗅鞘细胞移植能够有助于脊髓炎后遗症患者的神经功能恢复,但长期疗效有待于进一步观察.
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嗅鞘细胞移植对脊髓半横断大鼠骨骼肌的影响
背景:现有研究表明嗅鞘细胞移植可促进脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能的恢复,但多数实验是以动物行为学评分作为观察指标.目的:实验拟进一步观察嗅鞘细胞移植后6周脊髓半横断损伤大鼠后肢小腿三头肌组织形态学的变化.设计、时间及地点:细胞观察,于2006-10/2007-03在四川大学华西基础医学与法医学院神经生物学开放实验室完成.材料:清洁级2.5月龄雌性SD大鼠40只,由自四川大学华西医学中心提供.细胞培养过程中使用的阿糖胞苷为ROCHE产品.方法:5只大鼠麻醉后取出脑双侧嗅球,采用差速贴壁与阿糖胞苷抑制相结合的方法分离培养纯化嗅鞘细胞,第14天分别收集培养上清液和密度为1×1010L-1细胞悬液备用.剩余35只大鼠设立两组:正常组5只,不做任何处理;模型组30只,于T11～12节段建立脊髓半横断损伤模型后,又分为5个亚组:8只移植纯化的嗅鞘细胞悬液,6只移植纯化的嗅鞘细胞培养上清液,6只移植未纯化的嗅鞘细胞悬液(主要是嗅神经成纤维细胞),5只移植未纯化的嗅鞘细胞培养上清液,5只移植DMEM/F12培养液.移植量12μL/只,在脊髓半横断损伤上、下各1mm处多点注射移植4μL,同时在半横断处填充的明胶海绵内注入8μL.主要观察指标:移植后6周取左侧后肢小腿三头肌,苏木精-伊红染色观察肌细胞形态变化,图像分析软件测量肌细胞横截面积和直径.结果:[1]正常组肌细胞近似圆形或多边形,多核,核分布于外周.各移植组肌细胞均变小,核深染,其中移植DMEM/F12培养液组变化为明显.[2]各移植组肌细胞横截面积及直径较正常组均明显减少(P<0.05),其中移植纯化的嗅鞘细胞组减少程度轻(P<0.05),移植DMEM/F12培养液组减少程度严重(P<0.05),移植未纯化的嗅鞘细胞、纯化/未纯化的嗅鞘细胞培养上清液3组间无明显差异(P0.05).结论:移植纯化的嗅鞘细胞悬液脊髓半橫断损伤大鼠后肢小腿三头肌萎缩的程度轻,肌细胞组织学变化小.
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嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑损伤:可行性分析及效果验证
背景:脑损伤是中枢神经系统的一种严重刨伤,如何促进脑损伤后的神经再生和功能恢复尤为棘手.嗅鞘细胞有利于神经元存活,并促进轴突再生.目的:进一步探讨嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑损伤的可行性及效果.方法:健康成年SD雄性大鼠90只,取10只用于制备嗅鞘细胞,剩余80只随机均分为2组,采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,1周后细胞移植组经颈动脉将2×10~6个嗅鞘细胞注入脑缺血大鼠体内,模型对照组同法注入等体积无菌生理盐水.采用爬行记分法检测神经功能缺损情况,苏木精-伊红染色检测损伤脑组织病理变化,免疫组化染色法测定损伤脑组织中胶质原纤维酸性蛋白和神经营养因子受体p75的表达.结果与结论:与模型对照组比较,脑缺血再灌注后1,2,3,4周细胞移植组神经功能缺损评分均明显降低(P＜0.05);损伤脑组织病理变化减轻,神经细胞变性及坏死数量明显变少,间质水肿较轻.细胞移植组在梗死半球可见大量胶质原纤维酸性蛋白和神经营养因子受体p75阳性细胞,对侧半球及血管内皮细胞处也可见少量分布;模型对照组呈阴性表达.结果进一步验证了嗅鞘细胞移植治疗大鼠缺血性脑损伤是可行有效的.
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嗅鞘细胞移植对脊髓损伤区勿动蛋白表达的影响
背景:近年来人们认为只要能抑制脊髓损伤后神经再生的不利因素就能促进损伤脊髓的再生,抑制因子包括髓鞘相关抑制分子和胶质瘢痕.其中髓鞘相关抑制分子主要有勿动蛋白、髓磷脂相关糖蛋白及少突起胶质细胞髓鞘相关糖蛋白.目的:观察嗅鞘细胞移植前后脊髓损伤区勿动蛋白的动态变化.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-09/2007-05在西安交大医学院教育部环境与基因重点实验室完成.材料:8周龄成年SD大鼠40只,体质量(2.50±0.25)kg,雌雄不拘,随机数字表法分为正常组、模型组、嗅鞘细胞组、DF12对照组,10只/组.另取30只健康成年雄性SD大鼠用于嗅鞘细胞的取材,体质量200～250 g.方法:除正常组外,其余各组均建立全横切脊髓损伤模型.嗅鞘细胞组将原代培养12 d的嗅鞘细胞悬液调整为1×1011 L-1,在距损伤缘上下各1 mm处分4点应用微量注射器注射,深度1.0 mm,每处各注射1 μL.DF12对照组同法每点注射等量DF12培养液,模型组、正常组不进行任何处理.主要观察指标:各组分别于移植后1,4,8周采用免疫组织化学技术动态检测脊髓损伤区勿动蛋白的变化.同时在移植后8周行嗜银染色检测组织形态学变化.结果:①勿动蛋白的变化:正常组勿动蛋白吸光度值明显低于其余3组(P < 0.05).移植后1,4,8周,嗅鞘细胞组脊髓损伤区勿动蛋白均明显低于模型组和DF12对照组(P < 0.01),而模型组和DF12对照组差异无显著性意义(P > 0.01).②组织形态学变化:嗅鞘细胞移植8周后,除正常组外,其余各组均可见明显的神经纤维再生,但模型组与DF12对照组大部分纤维排列紊乱,再生纤维方向性较差;嗅鞘细胞组可见明显的新生轴突,且神经纤维跨越损伤部位修复脊髓损伤,无论在数量还是质量上均优于模型组及DF12对照组.结论:嗅鞘细胞移植可能通过降低脊髓损伤区勿动蛋白水平促进损伤脊髓的修复.
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嗅鞘细胞移植术后脊髓损伤患者功能的评价
目的:目前国际上应用广泛的神经功能评估标准是2000年美国脊髓损伤学会制定的ASIA标准.通过实践作者发现ASIA标准主要偏重于神经学检查的评估,对于植物神经功能如大小便功能、出汗及皮肤营养等功能性的情况不能很好的评估.作者也曾经制定了ASIA标准的功能观察补充表,虽然此表能够较好的反映出脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植术后植物神经功能的变化,但是必须要和ASIA标准同时使用,互为补充,使用较为繁琐.观察北京西山脊髓功能量表的使用效果.方法:选择2007-07/11来源于全国各地的陈旧性脊髓损伤患者21例,男17例,女4例,年龄8～54岁,损伤时间0.5～18年.受伤原因:创伤性脊髓损伤17例,手术创伤1例,生物源性损伤即脊髓炎3例.损伤节段:颈段8例,胸腰段13例.脊髓损伤程度:14例为完全性脊髓损伤,7例为不完全性脊髓损伤.13例曾行脊髓减压手术治疗.21例均接受过不同种类的神经营养因子等治疗.患者自愿接受细胞移植治疗并签自愿接受协议书.4～6个月中期引产胚胎由家属自愿捐献,并经过医院伦理委员会批准.取胚胎嗅球,经细胞分离、培养、纯化7～14 d,后消化成单细胞混悬液,然后在手术显微镜下移植到患者损伤脊髓区域的上下方.术后1～2个月,采用北京西山医院脊髓损伤功能量表进行术前和术后评定对比,该量表共9大项16小项,采用4分制,正常3分,差为0分,总分0～48分,0～16分为重度残障,17～32分为中度残障,33～47分为轻度残障,48分正常,能全面地体现患者的功能变化,不仅包括运动感觉的变化,还包括了膀胱、直肠、肌张力、皮肤营养状况、泌汗、性功能、疼痛、生存和生活质量的评价.结果:21例患者均进入结果分析.嗅鞘细胞移植术后1～2个月,21例患者的脊髓功能评分都有明显提高(术前:21.33±10.29,术后:25.19±11.16,P < 0.01)结论:西山医院脊髓功能量表能较全面的反映出术后脊髓患者功能的变化,使用较简便.
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成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化实验
背景:嗅鞘细胞的纯化方法以及嗅鞘细胞纯度的不同被认为与嗅鞘细胞移植后的效果有关.因此,开发高效、便于统一的纯化方法对嗅鞘细胞移植研究的标准化非常重要.目的:为嗅鞘细胞移植研究的标准化提供一个高效、便于统一的纯化方法.设计:随机对照实验.单位:东南大学临床医学院附属中大医院骨科,东南大学临床医学院中心实验室,东南大学临床医学院实验动物中心.材料:实验于2006-02/08在东南大学临床医学院中心实验室完成.选用28只成年雌性SD大鼠,体质量200～250 g;DMEM/F-12(GIBCO);2.5 g/L胰蛋白酶(GIBCO);左旋多聚赖氨酸(SlGMA);牛垂体萃取液(SIGMA);胎牛血清(杭州四季青生物试剂公司);兔抗p75抗体(SIGMA);生物素化羊抗兔IgG(武汉博士德生物技术公司);MTT试剂盒(SlGMA).方法:将SD大鼠嗅球中分离出嗅鞘细胞的原代培养物,体外培养8 d,将培养物分为4组:差速贴壁组、免疫吸附组、改良方法组、对照组.①改良方法组细胞悬液接种到未经包被的培养瓶在37℃、体积分数为0.05CO2的环境中孵育1 h,将上清液接种到培养瓶中(底面用1 mg/L的兔抗p75抗体润湿后在37℃下烘干,再用DMEM/F-12洗涤1次).上清液在这种已包被兔抗p75抗体的培养瓶中37℃、体积分数为0.05 CO2下孵育45min,DMEM/F-12洗涤5遍以清除未贴壁的细胞,用细胞刮刀收获贴壁细胞、离心、重新悬浮在含20 mg/L牛垂体萃取液和10万U/L青链霉素的D/F-10S中;Nash差速贴壁组细胞按Nash的方法进行操作;抗p75抗体免疫吸附组细胞按照Ramo'n-Cueto的方法进行操作;上述纯化方法获得的3组细胞悬液分别接种到包被左旋多聚赖氨酸的24孔细胞培养板中,在37℃、体积分数为0.05 CO2的环境中培养14 d.对照组未经纯化的细胞悬液同样重新悬浮在含20 mg/L牛垂体萃取液和10万U/L青链霉素的D/F-10S中并接种到包被左旋多聚赖氨酸的24孔细胞培养板中,培养条件同其他组.②在各组处理结束后2,5,8,10,12,14 d进行嗅鞘细胞纯度比较,每组每个时间点都随机选择15个视野计算嗅鞘细胞比例,这15个数值的平均值代表嗅鞘细胞纯度,从而评估这种改良方法的纯化效率.③分别用MTT法检测处理后第14天各组细胞活力.主要观察指标:各组嗅鞘细胞纯度、处理后14 d细胞活力检测结果.结果:①改良方法组每个时间点的嗅鞘细胞纯度都高于其他3组(P＜0.05～0.01),各组嗅鞘细胞纯度都随培养时间延长而降低,但改良方法组的纯度变化小,改良方法组后1个时间点的纯度仍然很高(92.1±1.2)%,而其他组高只有(85.2±2.2)%.②处理结束后第14天,改良方法组嗅鞘细胞细胞活力与其他组细胞活力差异无显著性(P=0.895).结论:本组纯化成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的改良方法是高效的,而且对嗅鞘细胞的活力无额外损害,将有益于嗅鞘细胞研究的标准化.
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不同保存方式下嗅鞘细胞的活性
背景:获取和寻找适合的保存方式对嗅鞘细胞实验和临床应用有重要的意义.目的:探索合适的嗅鞘细胞低温保存方式.方法:取对数期生长的嗅鞘细胞,冻存1,3,6 个月进行复苏.结果与结论:MTT 比色法及锥虫蓝染色显示5%二甲基亚砜-6% 羟乙基淀粉处理的细胞活性高,其次是10%二甲基亚砜处理的细胞,5%二甲基亚砜的保护作用差.冰箱降温或程控降温仪降温方式及不同的冻存时间对嗅鞘细胞活性影响不明显.因此,推荐用5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉作为嗅鞘细胞冻存低温保护剂.
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微囊化异种嗅球组织细胞悬液移植脊髓损伤大鼠核因子κB表达的变化
背景:研究发现,微胶囊包裹异种嗅球组织细胞可以减少免疫排斥反应,促进损伤脊髓的功能修复,但其作用途径尚不清楚.目的:观察微囊化异种嗅球组织细胞移植于脊髓损伤大鼠后核因子κB的表达及活性变化.方法:家兔用于制备异种嗅球组织细胞悬液.SD大鼠分为4组,即假手术组、微囊组、细胞组及单纯损伤组,后3组在建立大鼠脊髓半横断损伤模型后分别于损伤处植入明胶海绵吸附的10 μL微囊化异种嗅球组织细胞、10 μL异种嗅球组织细胞以及10 μL生理盐水.采用苏木精-伊红染色观察脊髓组织的病理学改变,免疫组织化学染色观察核因子κB的表达变化.结果与结论:脊髓损伤后大鼠神经元细胞浆及细胞核内核因子κB表达增加,24 h达高峰水平,3 d后开始逐渐降低,7 d基本降至正常.微囊组脊髓核因子κB阳性细胞数少于单纯损伤组及细胞组(P < 0.05).提示微囊化异种嗅球组织细胞移植对脊髓损伤后核因子κB的活性表达起抑制作用,有益于减轻核因子κB介导的炎性反应.
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嗅鞘细胞移植修复坐骨神经缺损
背景:研究表明,嗅鞘细胞有利于神经元存活并促进轴突再生.目的:验证局部注射嗅鞘细胞治疗大鼠周围神经损伤的可行性.方法:体外分离、培养SD大鼠嗅鞘细胞.40只SD大鼠切除坐骨神经1.0 cm,植入异体神经1.0 cm.随机分为2组,嗅鞘细胞组局部注射嗅鞘细胞,生理盐水组局部注射生理盐水.术后3个月检测体感诱发电位及运动诱发电位,光镜、电镜观察神经电生理恢复情况.结果与结论:电镜观察嗅鞘细胞组大鼠在损伤区有较多神经纤维通过,明显多于生理盐水组(P < 0.01).嗅鞘细胞组大鼠体感诱发电位及运动诱发电位的潜伏期及波幅明显优于生理盐水组(P < 0.01).提示局部注射嗅鞘细胞能更好地恢复周围神经损伤后的功能.
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自体嗅鞘细胞联合β-七叶皂甙钠修复大鼠脊髓全横断损伤
背景:神经损伤时移植嗅鞘细胞能促进轴突再生,减少星形胶质细胞增生.目的:探讨自体嗅鞘细胞移植联合中药β-七叶皂甙钠对脊髓继发性损伤的保护作用.方法:制作SD大鼠脊髓损伤模型,随机分为对照组(注射生理盐水)、自体嗅鞘细胞移植组、自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠治疗组.结果与结论:脊髓损伤后脊髓血管源性水肿、基质金属蛋白酶9表达上调,大鼠运动功能缺失,经自体嗅鞘细胞移植及自体嗅鞘细胞联合β-七叶皂甙钠治疗后脊髓水肿明显减轻、基质金属蛋白酶9表达下调,大鼠运动功能恢复,以自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠治疗效果更明显.说明白体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠可更有效修复损伤脊髓,发挥保护作用.
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延迟植入嗅鞘细胞修复成鼠的胸髓损伤
背景:脊髓损伤后在一定的微环境中有再生的能力.嗅鞘细胞兼具星形胶质细胞和许旺细胞的特性,具有促进脊髓轴突再生的能力.目的:制作成鼠胸髓损伤模型,观察嗅鞘细胞对损伤脊髓轴突再生的作用.设计:观察性实验.单位:中山大学附属第二医院.材料:实验于2001-01/2002-11在中山大学附属第二医院完成.20只成年SD雄性大鼠,体质量(380±20)g,由中山大学实验动物中心提供(机构许可证号:SYXK(粤)2004-0020).低糖的DMEM培养液(L-DMEM,GibcoBRL公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、MBP(髓磷脂碱性蛋白,Sigma公司)、抗神经生长因子受体抗体(Sigma公司).应用随机数字表完全随机化分为细胞移植组和对照组,每组10只.方法:将成年SD大鼠麻醉断颈处死,无菌条件下取出完整嗅球分嗅神经.采用改良Allen法打击脊髓建立胸髓损伤模型.细胞移植组于损伤脊髓处注入10 μL嗅鞘细胞悬液(2.5×1010 L-1),对照组仅注入相同剂量DMEM/F12(1∶1)培养液.移植后6周通过组织学和免疫组织化学方法观察嗅鞘细胞对脊髓轴突再生的影响.主要观察指标;①抗神经生长因子受体抗体染色鉴定嗅鞘细胞.②髓磷脂碱性蛋白染色观察髓鞘的修复.③嗜银染色观察神经轴突再生.结果:细胞移植组有2只动物死亡,对照组有3只死亡,共15只大鼠进入结果分析.①细胞移植组可见损伤脊膜完整,较正常脊髓稍变细.苏木精-伊红染色见损伤区有多极细胞,且与脊髓组织有移行过度现象,说明存活的嗅鞘细胞与宿主融合良好.新生的轴突多呈束状,周围有小圆淋巴细胞浸润.嗜银染色可见再生轴突长入损伤区组织中,多与束状排列的多极细胞伴行;对照组脊髓损伤处明显变细,脊膜尚完整.苏木精-伊红染色见脊髓损伤区未见新生轴突.嗜银染色未见再生轴突.②细胞移植组可见多极细胞,多呈束状排列,胞浆内有大量抗神经生长因子受体抗体阳性颗粒存在,进一步证明嗅鞘细胞移植6周后仍然存活,且与宿主融合良好.髓磷脂碱性蛋白染色见损伤区有呈线状髓磷脂碱性蛋白阳性纤维,提示损伤区两端均有髓鞘样物质产生,且互相靠拢.同时多极细胞中也发现有髓磷脂碱性蛋白阳性物质存在,说明移植的嗅鞘细胞有产生髓鞘样物质的作用.对照组未见轴突再生.结论:嗅鞘细胞延迟植入成鼠打击伤后脊髓后,可存活并产生髓鞘样物质,促进宿主脊髓轴突再生.
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嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的临床研究现状
目的:对嗅鞘细胞生物学特性、培养纯化、嗅鞘细胞移植的可能机制及嗅鞘细胞移植在临床的应用等方面进行分析,介绍嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的研究现状.资料来源:以olfactory ensheathing cells,spinal cord injury,嗅鞘细胞,脊髓损伤为检索词检索PubMed数据库(2000/2009),中国期刊全文数据库(2000/2009).资料选择:纳入标准:①文章所述内容应与嗅鞘细胞及脊髓损伤密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:①重复性研究.②Meta分析.结局评价指标:嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展.结果:嗅鞘细胞具有与许旺细胞和星形胶质细胞相似的特征.目前嗅鞘细胞移植的动物实验主要致力于提高轴突再生能力、替代细胞成分、阻止脱髓鞘病变和促进髓鞘再生等方面,移植的嗅鞘细胞具有促进感觉及运动功能恢复的客观结果,有些移植研究甚至已经进入了临床试验阶段.不过嗅鞘细胞移植由动物实验转化到临床应用还受到很多因素的影响,诸如移植剂量、细胞生长因子的活力,细胞移植的风险等,尤其是嗅鞘细胞移植后的近期及远期效果还需要进一步深入研究、评价,并且需要长时间的随访.有研究已经把用基因转染的嗅鞘细胞用于移植,在动物试验身上已经取得了满意的效果.结论:随着基因工程技术发展以及嗅鞘细胞移植修复神经机制的深入研究,嗅鞘细胞移植必将为临床治疗脊髓损伤的患者带来康复的希望.
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嗅鞘细胞移植治疗中枢神经系统疾病的基础研究
中枢神经系统疾病可以导致人们的神经功能缺损.同时,损伤区出现轴突受损,形成胶质瘢痕、空腔和裂隙.嗅鞘细胞作为自体移植佳的候选细胞,它可以分泌神经营养因子等起到不同程度地神经保护作用,刺激血管再生,促进未受损和受损害轴突的生长.嗅鞘细胞还可以改变损伤后内源性神经胶质的应答情况,并且在受到一定程度的脱髓鞘损害时能够将轴突再髓鞘化.近几年来,嗅鞘细胞移植逐渐成为了一种临床治疗手段应用于人类的中枢神经系统疾病.因此,嗅鞘细胞移植可以成为由细胞介导的神经修复策略,治疗许多中枢神经系统疾病.文章通过该研究领域大量的实验结果来阐述嗅鞘细胞移植治疗中枢神经系统疾病基础研究目前的情况.
