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嗅鞘细胞与中枢神经损伤修复
中枢神经损伤特别是脊髓损伤的修复,至今仍然是医学界的一个难题.其原因是中枢神经的再生能力低下及外在环境对轴突再生的抑制作用.国内外已进行了大量的实验来研究中枢神经损伤的修复问题.
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嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤进展
脊髓损伤的治疗一直是科学家和临床医生面临的颇具挑战性问题,近百年来没有多大进展!近年来,髓内细胞移植治疗脊髓横断损伤取得了一定疗效,为严重脊髓损伤的治疗提供了新的方法.其中,移植成髓鞘的细胞取得了较好的疗效,如:雪旺氏细胞,少突胶质细胞,嗅鞘细胞.所有的这些细胞中,嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells OECs)使轴突再生和髓鞘化的效果好,被许多学者认为是佳的移植细胞.有可能在脊髓损伤的治疗上取得突破!
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骨髓间充质干细胞与嗅鞘细胞联合移植治疗脊髓损伤的早期观察
[目的]探讨自体骨髓间充质细胞和异体嗅鞘细胞共培养及其联合移植修复脊髓损伤的可行性,为临床治疗提供一种新方法.[方法]无菌条件下采集自体骨髓间充质细胞和胎龄4～6个月的引产胎儿的嗅鞘细胞,分别培养至传代后再共培养,将共培养的混合细胞通过手术直视下移植至脊髓损伤部位.[结果]8例脊髓损伤患者接受自体骨髓间充质细胞和异体嗅鞘细胞联合移植,并获得l～6个月的随访,所有接受细胞移植的8例患者术后均无不良反应,其中1例术后1个月开始出现双下肢深浅感觉恢复,其余7例比细胞移植前无明显改善.[结论]自体骨髓间充质细胞和异体嗅鞘细胞共培养两者之间无相互抑制现象,近期观察二者联合移植修复脊髓损伤是安全的.
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人嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞体外共培养的实验研究
[目的]通过体外共培养观察人嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖分化的影响.[方法]取5个月以上引产胎儿嗅球及骨髓,分离培养及鉴定OECs及MSCs,携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺相关病毒转染标记OECs,双苯亚甲胺荧光染料标记MSCs,将两种细胞按1∶1比例进行共培养,MSCs单独培养组为阴性对照组,免疫细胞化学方法检测MSCs表达巢蛋白(nestin)、神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)情况.[结果]MOI值为1×106时OECs表达GFP阳性率为84.89％,对细胞生长活性无明显影响.共培养时两种细胞生长良好,共培养7d未见形态学改变,经复方丹参注射液诱导后部分MSCs呈现神经元样改变,表达nestin、NSE、NeuN、NF-M、GFAP特异性标志,且共培养组的分化率明显高于单独MSCs培养组,有显著性差异.[结论]OECs可通过分泌可溶性物质及细胞之间的相互作用启动MSCs分化程序,提高MSCs向神经细胞分化率.
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嗅鞘细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究
[目的]探讨嗅鞘细胞静脉移植治疗脊髓损伤的可行性和疗效.[方法]制备Wistar大鼠脊髓半切模型,随机分4组:局部移植组(A)、静脉移植组(B)、D/F12静脉移植组(C)、空白对照组(D).定期行CBS功能评分及组织学检查,评价脊髓修复情况.[结果]A、B两组功能恢复和组织学改变与对照组有显著差别,A、B两组间无显著差别.[结论]嗅鞘细胞静脉移植可向脊髓损伤部位迁移并修复损伤脊髓,该移植方式即简化了操作,又有较好疗效,具有良好的临床推广和使用价值.
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不同保存方式对嗅鞘细胞活性的影响
[目的]探索嗅鞘细胞佳保存方式.[方法]20例对数生长期OECs,随机分为5组,分别加入10%DMSO、5%DMSOfi%HES、5%DMSO,冰箱降温或程控降温仪降温并液氮保存,定期复苏,通过观察细胞形态、MTT 比色法、台盼蓝染色法检测细胞活性.[结果]同种降温方式下,5%DMSO-6%HES组细胞活性优于另两组,差异显著;同种低温保护剂下,冰箱降温与程控降温仪降温并液氮保存相比,差异不显著;同种保存方式下低温保存半年,各组回收率差异不显著.复苏标本不洗涤,室温下放置不同时间,细胞活性均下降,其中10%DMSO组下降大.[结论]推荐5%DMSO-6%HES作为OECs冻存低温保护剂;小样本保存应选用冰箱降温液氮保存方式,大样本保存可选用程控降温仪降温或冰箱降温,并液氮保存方式;OECs低温保存半年仍具有较好的细胞活性.
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溶血磷脂酸对嗅鞘细胞形态增殖及表达脑源性神经营养因子的影响
[目的] 观察溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对体外培养的嗅鞘细胞(olfactory ensheathingcells,OECs)形态、增殖和表达脑源性神经营养因子(brain-derived neurotropic factor,BDNF)的影响.[方法] 取成年大鼠原代OECs经纯化后培养,分别用1、5、10、20、50 μm/L的LPA干预一定时间后,用免疫荧光染色法、MTT、Western Blot技术分别观察OECs形态变化、增殖和表达BDNF的情况.[结果] LPA使OECs形态由突起形向扁平形转变,去除LPA可逆转这种转变;1～50 μm/L的LPA均能促进其增殖,干预后60 h达到增殖高峰,浓度为10μm/L时促增殖作用显著;1～50μm/L的LPA均可上调其表达BDNF.[结论] LPA能使OECs形态由突起形向扁平形发生可逆性变化;能促进OECs增殖并具有时间和浓度依赖性;能上调OECs表达BDNF.
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大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脊髓神经干细胞分化的研究
[目的]观察大鼠嗅神经鞘细胞上清液对脊髓神经干细胞共培养发生的诱导分化作用.[方法]采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,分时段MTT法检测细胞活性,选取佳状态细胞无血清培养后取上清液,与3代纯化后的神经干细胞共培养,观察分化过程,免疫荧光法鉴定诱导结果.[结果]MTT法分6个时段检测纯化后的嗅鞘细胞,发现9 d及12 d细胞活性高.使用无血清嗅鞘细胞上清液与脊髓神经干细胞共培养发现诱导作用明显,向神经元样细胞及胶质细胞分化的比例分别达到53%和42%.[结论]嗅鞘细胞在体外培养的不同时间段活性不同,无血清的嗅鞘细胞上清有明显诱导神经干细胞向成熟神经元分化的作用.
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嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞的诱导分化作用研究
[目的]探讨大鼠嗅神经鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞的诱导分化作用.[方法]通过差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在接种培养后的9～12 d,收集并制备嗅鞘细胞条件培养液,与纯化培养第3代的骨髓基质干细胞共培养,观察其诱导分化后的形态学变化,免疫荧光染色鉴定诱导分化结果.[结果]发现大鼠嗅鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞有明显的诱导分化作用,在72 h时荧光显微镜下观察并计算MAP-2和GFAP阳性细胞的比率分别为55%、23%.[结论]大鼠嗅鞘细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠骨髓基质干细胞向神经样细胞分化的作用.
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嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究
目的:观察移植的嗅鞘细胞(OECs)在损伤脊髓中的迁移特性.方法:将OECs用双苯亚甲胺染色,植入12只SD大鼠半横断脊髓的头端(A组),植入12只大鼠半横断脊髓的尾端(B组),对照组(C组)12只植入没有损伤的脊髓内.术后1、2、4、6周观察脊髓中OECs的分布.结果:A组和B组OECs分别在白质中向头端和尾端迁移,但越过断端的数量少,C组不迁移.结论:OECs的迁移主要沿着轴突进行,向头端和尾端迁移的数量和速度都没有明显区别,但6周时只有少量OECs能越过损伤区.OECs在没有损伤的脊髓白质中不进行迁移.
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OECs移植联合应用尼莫地平促进大鼠脊髓损伤后功能恢复
目的:探讨嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植联合应用尼莫地平,恢复大鼠脊髓损伤后的功能.方法:将成年大鼠分为脊髓半切洞损伤组(A组),脊髓半切洞损伤+OECs移植组(B组)和脊髓半切洞+OECs+尼莫地平移植组(C组).手术后应用联合行为评分(CBS),感觉诱发电位(SEP)和运动诱发电位(MEP)检查,测定脊髓功能恢复情况.结果:3组CBS得分A组＞B组＞C组,SEP和MEP潜峰时,均A组＞B组＞C组.统计分析均差异显著性(P＜0.05).结论:移植OECs+尼莫地平能促进损伤脊髓功能的恢复.
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嗅鞘细胞移植预防失神经骨骼肌萎缩
目的:了解嗅鞘细胞移植对失神经后骨骼肌萎缩的作用.方法:大鼠坐骨神经切断后骨骼肌内包埋,进行DMEM和嗅鞘细胞的移植,在术后4、8、16和32周进行诱发电位、肌肉湿重、骨骼肌病理学改变和肌纤维截面积检查,对结果进行统计学分析.结果:嗅鞘细胞移植与对照组相比在肌肉功能和抗肌萎缩方面都有明显优越的作用.结论:嗅鞘细胞移植对失神经骨骼肌有恢复功能和对抗肌萎缩的作用.
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成年大鼠嗅球成鞘细胞的原代培养及形态学研究
目的:探讨大鼠嗅球成鞘细胞(olfctory ensheathing cells,OECs)分离与纯化培养方法并对形态学进行研究.方法:取材后采用差速贴壁和阿糖胞苷(Ara-c)抑制相结合的纯化培养方法培养嗅鞘细胞,并分不同阶段进行观察和NGFRp75和GFAP免疫组化染色鉴定.结果:成功培养出高纯度的嗅鞘细胞,胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形三种类型,突起细长编织成网状为其特点.结论:差速贴壁和Ara-c抑制相结合的纯化培养方法兼收了两者的优点,实践证实是一种简单经济而又有实效的嗅鞘细胞培养方法.
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嗅鞘细胞在周围神经中迁移特性的初步研究
目的:了解OECs在周围神经中的迁移特性.方法:从新生乳鼠嗅脑中培养出OECs,用荧光染色剂hochest标记,注入大鼠坐骨神经中,在不同的位置对坐骨神经与脊髓造成损伤,观察OECs的迁移情况.结果:1个月后取病理标本观察,坐骨神经中损伤一侧OECs迁移距离大于未损伤侧,但若损伤在脊髓,或脊髓中注射OECs在坐骨神经处进行损伤时对细胞两侧迁移没有影响.结论:在周围神经中,嗅鞘细胞不表现为中枢趋向性,而表现为一定的损伤趋向性,且其迁移的速度较慢.
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腺病毒介导的BDNF基因在体外嗅鞘细胞中的表达及其生物学活性实验研究
目的:用重组腺病毒载体Ad-BDNF感染体外培养的嗅鞘细胞,从基因转录和蛋白表达水平检测BDNF基因在体外OECs中的表达,对OECs表达的BDNF生物学活性进行观察.方法:提取细胞总RNA进行RT-PCR扩增BDNF基因,应用ELISA方法检测其培养上清中BDNF含量,并通过与原代脊髓神经元共培养观察BDNF活性.结果:实验证实经BDNF重组腺病毒感染的OECs中有BDNF的转录;其培养上清应用ELISA方法分析,在感染后24h即有BDNF的表达,并可以维持3-5d的高峰表达.与BDNF重组腺病毒感染的OECs共培养的脊髓神经元可以在无血清条件下存活3-5d.结论:重组腺病毒BDNF基因可以在OECs中稳定、高效表达,其表达的BDNF具有促进脊髓神经元存活的生物活性.
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成年鼠嗅鞘细胞的纯化培养与免疫组化观察
目的:对文献报道的嗅鞘细胞(OECs)纯化方法进行改进,为基因治疗和细胞移植修复脊髓损伤实验研究提供高纯度的种子细胞.方法:本实验综合使用了阿糖胞苷、BPE及NGFR抗体纯化了原代培养的成年Wistar大鼠的OECs,并对纯化的OECs细胞免疫特性进行观察.结果:本实验得到OECs纯度可达98%,其特性与文献报道一致.结论:本实验综合使用了阿糖胞苷、BPE及NGFR抗体纯化了原代培养的成年Wistar大鼠OECs,纯度可达98%.而且培养周期大大缩短,节约了时间,为进一步的实验研究奠定了基础.
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共培养条件下骨髓基质细胞与嗅鞘细胞的相互作用
[目的]研究骨髓基质细胞与嗅鞘细胞共培养条件下,两种细胞之间的相互作用,为进一步行细胞联合体内移植提供理论基础.[方法]取大鼠骨髓基质细胞和嗅鞘细胞进行分离培养纯化及鉴定,将纯化后的骨髓基质细胞和嗅鞘细胞共培养,对共培养细胞进行形态学观察,检测间充质干细胞标记物Vimentin、NGF受体标记物P75、神经干细胞标记物Nestin.[结果]共培养部分细胞形态上具有神经细胞特征;经免疫荧光观察一部分细胞呈p75阳性,另一部分细胞呈Vimentin阳性,它们呈条索状包绕p75阳性细胞,细胞簇中央的细胞呈Nestin阳性.[结论]骨髓基质细胞和嗅鞘细胞能在体外共同存活、生长,且通过细胞的相互作用,能激活BMSCs向神经元样细胞分化的潜力,提示借助于细胞间的相互作用,采取恰当的细胞联合移植干预有可能弥补单一细胞类型自身的不足,这为BMSCs和OECs体内联合移植的可行性提供了理论依据.
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电针对嗅鞘细胞凋亡的实验研究
目的：探讨电针治疗对嗅鞘细胞在脊髓损伤修复过程中的细胞凋亡影响。方法制备完全离断的脊髓损伤动物模型，造模后分为治疗组和对照组。在造模后1周注射移植细胞，治疗组在细胞移植后给予低频直流电刺激，对照组单纯给予细胞移植。采取 H‐E染色、免疫荧光染色和T unel染色等方法观察脊髓损伤的修复程度，明确嗅鞘细胞移植后的存活情况。结果 H‐E染色显示治疗组脊髓结构较对照组清晰，神经纤维具有方向性。免疫荧光染色显示治疗组和对照组均有细胞在体内存活，但治疗组的细胞数量多于对照组，二者相比具有统计学意义（ P ＜0．05）。 T unel染色表明治疗组较对照组神经元细胞凋亡的数量少，二者差异具有统计学意义（ P ＜0．05）。结论电针治疗与嗅鞘细胞移植在修复脊髓损伤中能够相互促进和协同，明显减少嗅鞘细胞移植后的凋亡，具有促进嗅鞘细胞在体内存活的作用。
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嗅粘膜源性嗅鞘细胞移植联合NGF对脊髓损伤的修复
目的:探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)移植联合神经生长因子(nerve growth factor, NGF)修复脊髓急性损伤的可行性和疗效,并观察二者的协同作用.方法:自成年Wistar大鼠嗅粘膜取材,采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制纯化相结合的方法培养纯化嗅鞘细胞.建立大鼠脊髓半切模型,并随机分成对照组(A组),OECs组(B组)和OECs+NGF组(C组),在不同时段进行肢体活动的BBB评分.8周后取脊髓标本进行组织学检查,评价对脊髓损伤的修复作用.结果:B组和C组2周后BBB评分高于A组(P＜0.05),C组自4周后明显优于A组和B组(P＜0.01).组织学检查表明,C组可明显促进轴突再生.结论:OECs联合NGF具有良好的脊髓损伤修复作用,且二者具有明显的协同作用.
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成年大鼠嗅球成鞘细胞的分离培养及形态学研究
目的:探讨大鼠嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells OECs)的分离培养方法并观察其形态.方法:采用差时贴壁和阿糖胞苷(Ara-c)抑制相结合的方法培养嗅鞘细胞,并在不同阶段进行观察和行NGFRp75和GFAP免疫组化染色鉴定.结果:成功培养出高纯度的嗅鞘细胞,胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形3种类型,突起细长编织成网状.结论:差时贴壁和Ara-c抑制相结合的纯化培养方法是一种简单而又有实效的嗅鞘细胞培养方法.
