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低氧微环境促进嗅黏膜间充质干细胞向神经元分化及其相关机制
目的:研究低氧微环境下利用嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)上清液诱导嗅黏膜间充质干细胞(olfactory mucosa mesenchymal stem cells,OM-MSCs)更多地向神经元分化及其相关的机制.方法:分离培养OECs和OM-MSCs,应用流式细胞仪和免疫荧光方法分别进行鉴定;实验将OM-MSCs分为3％O2+低氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)抑制剂利非西呱(lificiguat,YC-1)+OECs上清诱导组(A组)、3％O2+OECs上清诱导组(B组)及21％O2+OECs上清诱导组(对照组)o采用免疫荧光检测分化后的神经元,采用定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)和Western印迹分别检测HIF-1α的mRN及βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)的表达,再用膜片钳检测分化后的神经元钾离子通道开放情况.结果:实验各组相比较,B组OM-MSCs诱导后免疫荧光显示βⅢ-tubulin表达多,Q-PCR显示B组HIF-1α表达明显增高(均P＜0.05);Western 印迹表明B组中βⅢ-tubulin蛋白表达显著增多,而胶质细胞标志物GFAP表达明显降低(均p＜o.05);且诱导分化后的神经元经膜片钳检测发现钾离子电流.结论:低氧微环境下的OM-MSCs经OECs上清液诱导能显著提高其向神经元分化的比例,并明显降低了神经胶质细胞的产生,且与细胞HIF-1α信号通路被激活有关.
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嗅鞘细胞与神经修复支架材料的相互作用
目的:探讨一种提取高纯度和一定数量的嗅鞘细胞(OECs)的新方法,并研究其与神经支架修复材料PLGL的生物相容性.方法:从新生的 Wister 大鼠身上分离制备嗅鞘细胞并与PLGL共同培养.测量其接触角、吸附率、存活率等.结果:PDLLA的接触角(84.5°±1.5°)明显大于PLGL的接触角(52.6°±0.8°).PLGL的吸附率(80%)明显高于PDLLA(57%).PLGL的细胞存活率(88%)明显高于PDLLA(76%).结论:PLGL比PDLLA具有更好的亲水性、存活率以及良好的细胞生长状况.
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健脾补土法组方含药血清对体外嗅鞘细胞低氧/复氧损伤模型P65、P50及磷酸化IκBα表达的影响
目的：探讨健脾补土法组方含药血清对体外嗅鞘细胞低氧/复氧损伤模型核因子KB（nuclear factor-kappa B,NF-KB）的亚单位P65、P50及NF-KB抑制蛋白（P-IκBα）表达的影响。方法将原代培养的嗅鞘细胞分为5组：正常血清对照组、正常血清+低氧组、低氧+依达拉奉含药血清组、低氧+健脾补土法组方含药血清组、正常血清+低氧+NF-KB抑制剂/抗氧化剂（PDTC，50μmol/L）组，采用微需氧袋低氧/复氧的方法诱导嗅鞘细胞形成脑缺血再灌注损伤样模型，用Western blot法检测嗅鞘细胞胞浆P65、P50、P-IκBα和胞核P65、P50的含量。结果与正常血清对照组比较，正常血清+低氧组胞浆和胞核P65、P50，胞浆P-IκBα表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与正常血清+低氧组比较，低氧+依达拉奉组、低氧+健脾补土组、正常血清+低氧+PDTC组、低氧+健脾补土+PDTC组胞浆和胞核P65、P50，胞浆P-IκBα表达均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论健脾补土法组方能通过抑制嗅鞘细胞缺氧/复氧损伤后P65、P50、P-IκBα的过度表达，对NF-κB通路的活化具有抑制作用。
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嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的作用机制及临床应用进展
脊髓损伤是一种中枢神经系统损伤性疾病,脊髓神经元和轴突损伤减少导致神经功能缺失,对患者的生活质量造成影响,目前医学上对脊髓损伤患者的治疗仍缺乏有效的治疗手段.嗅鞘细胞是兼具星形胶质细胞和雪旺细胞双重特性的一种细胞,具有强大的修复神经损伤、改善神经退行性病变的潜能,通过嗅鞘细胞移植能够达到一定程度的神经功能修复.本文就嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的机制及研究进展进行综述.
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胎鼠嗅球分离培养出神经干细胞的研究
目的研究胎鼠嗅球中分离培养产生神经干细胞(NSCs)的情况.方法取孕16～18d的孕鼠,取胎鼠的嗅球,用含10%FCS的培养基培养传代分离出的细胞,免疫细胞化学方法鉴定培养和传代出的细胞,对染色阳性的细胞计数检测纯度.结果P75染色阳性证明分离培养的细胞为嗅鞘细胞(OECs);来源于嗅球的细胞培养出的神经球行Nestin染色阳性证明为NSCs;传代OECs纯度为95%～98%.结论胎鼠嗅球中可分离培养出NSCs,OECs可稳定传代,可以作为移植用的种子细胞.
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嗅鞘细胞移植治疗脑出血的实验研究
目的研究OECs移植治疗大鼠脑出血的疗效.方法制作大鼠脑出血模型,3 d后OECs移植,记录对照组和移植组的大鼠运动功能,及神经前体细胞及移植细胞在体内存活、分化和迁徙的情况.结果OECs组的神经前体细胞比对照组多,运动功能的改善显著好于对照组,免疫细胞化学方法证实OECs移植后能存活、迁徙.结论OECs移植后可以增加神经前体细胞的数量,改善脑出血运动功能.
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嗅鞘细胞与大鼠尾状核神经元共培养的实验研究
目的观察嗅鞘细胞对大鼠尾状核神经元生长的影响.方法嗅鞘细胞与大鼠尾核神经元在无血清培养液中共培养,观察神经元生长变化.结果神经元与嗅鞘细胞共培养下神经元生长良好,轴突延长并形成网络状.结论嗅鞘细胞与大鼠尾状核神经元共培养可促进神经元生长.
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人骨髓间质干细胞和嗅鞘细胞移植对大鼠急性脊髓损伤功能修复的比较研究
目的 对比人骨髓基质细胞(BMSCs)与人胚嗅鞘细胞(OECs)移植对大鼠脊髓损伤功能修复的影响.方法 将45只SD大鼠分成脊髓损伤后BMSCs移植组(BMSCs组)、OECs移植组(OECs组)和PBS对照组(PBS组),通过BBB评分、运动诱发电位(MEP)评估脊髓传导功能的改善状况,免疫组织化学方法检测移植细胞存活和分化情况,病理形态学方法观察组织结构修复情况.结果 BMSCs组BBB评分高于OECs组(P＜0.05);两细胞治疗组MEP潜伏期明显缩短(P＜0.05);BMSCs组嗜银染色可见脊髓损伤近端有较多再生纤维向远端延伸,形成神经纤维束,而OECs组再生纤维较少;两种移植细胞均可在损伤处部分存活,BMSCs组可见BMSCs来源的细胞Nestin、NF、GFAP的阳性表达.结论 BMSCs移植比OECs移植能更有效促进大鼠急性脊髓损伤修复.
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OECs移植联合IN-1抗体修复急性脊髓损伤的实验研究
目的:研究嗅鞘细胞移植联合轴突生长抑制蛋白抗体IN-1局部持续注射对大鼠横断性脊髓损伤的修复作用.方法:成年雄性SD大鼠40只,建立胸脊髓全横断损伤模型,随机分成单纯对照组(10只)、嗅鞘细胞移植组(10只)、IN-1抗体微泵注射组(10只)和嗅鞘细胞移植联合IN-1抗体组(10只).应用NF200免疫组化染色和免疫荧光染色对脊髓损伤区神经纤维再生进行形态学观察.采用BBB评分评估大鼠后肢功能恢复情况.结果:横断损伤共有9只大鼠死亡.术后8周可观察到Hoeehet标记的嗅鞘细胞在体内存活并在脊髓内迁移;联合治疗(OECs+IN-1)组和OECs组可见脊髓损伤区杂乱无序的再生轴突,但无连续性神经纤维通过损伤区;IN-1组和对照组脊髓残端萎缩,未见轴突再生.后肢功能运动平均BBB评分:对照组、IN-1抗体组、细胞移植组和联合治疗组分别为7.70±0.24、7.89±0.15、10.50±0.25、11.33±0.24.结论:OECs移植联合IN-1抗体可促进损伤的脊髓神经轴突的存活和再生,较单纯应用OECs或IN-1能更好的促进脊髓损伤修复和大鼠后肢功能恢复.
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大鼠嗅鞘细胞体外培养及免疫组化研究
目的:建立体外纯化培养嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的稳定方法并观察培养嗅鞘细胞(OECs)形态学特征.方法:原代培养成年雄性SD大鼠嗅球的嗅神经层和颗粒层中提取的OECs,利用差速贴壁和阿糖胞苷(Ara-c)抑制法除去混杂的成纤维细胞和星形胶质细胞以获得纯化的OECs.用P75抗体免疫组织化学染色鉴定OECs,计算纯化度.结果:此方法获得的OECs纯度可达93%以上.OECs的外形主要以突起细长的双极和三极为主,或无突起呈"煎蛋样",随时间延长细胞生长排列呈现一定方向性.结论:此方法稳定易复制,可获得高纯度的OECs.
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嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓损伤后bcl-2、bax基因表达的影响
目的:探讨嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后脊髓组织bcl-2、bax基因表达的影响.方法:64只SD大鼠随机分成生理盐水组(A组)和嗅鞘细胞移植组(B组);采用Allen WD法致伤力损伤T8脊髓,B组术后即刻给予嗅鞘细胞局部注射,A组局部注射等量生理盐水.采用RT-PCR和免疫组织化学染色(SABC方法)分别检测SCI后基因bcl-2、bax的mRNA水平和蛋白表达变化.结果:B组bcl-2 mRNA和蛋白较A组在各时间点的表达均明显升高,P＜0.01;B组bax mRNA较A组在各时间点的表达均明显降低,P＜0.01.结论:嗅鞘细胞移植可以促进脊髓损伤后bcl-2基因表达和蛋白产物的增加,抑制bax基因的表达和蛋白产物的增加,这可能是嗅鞘细胞移植对脊髓损伤具有保护作用的机制之一.
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嗅鞘细胞经低能激光照射后移植对大鼠脊髓损伤神经功能修复的影响
目的 探讨嗅鞘细胞(OECs)经低能激光照射(LPLI)后移植对大鼠脊髓横断损伤后功能修复的影响. 方法 24只SD大鼠T<,12>脊髓完全横断伤模型建模4周后,随机分为OECs移植组、经LPLI的OECs的移植组和空白对照组(DMEM培养液),应用BBB评分法、组织学评价以及Flurogold逆行示踪评价各组脊髓损伤的修复情况. 结果三组大鼠不同移植方式以及评分时间点对移植后下肢功能BBB评分结果的影响差异均有统计学意义(P=0.000),且组间差异均有统计学意义(P=0.000).经LPLI的OECs移植组大鼠头尾侧均可见NGFRp75阳性及GFAP阳性的OECs,OECs移植组则仅可见GFAP阳性的OECs,空白对照组未见NGFRp75阳性及GFAP阳性的OECs.OECs移植组和经LPLI的OECs移植组大鼠头尾侧及瘢痕区均可见Flurogold标记的神经纤维穿行,空白对照组未见Flurogold标记的神经纤维穿行. 结论 OECs及经LPLI的OECs均可促进损伤脊髓的功能恢复,OECs经LPLI后可能更具有促进损伤脊髓功能恢复的作用.
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胚胎干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展
脊髓损伤是中枢神经系统的严重创伤,常导致不可逆的感觉及运动功能丧失,主要表现为损伤平面以下感觉、运动功能丧失和大小便功能障碍,并由此引起的一系列并发症(褥疮、坠积性肺炎、尿路感染等).目前,细胞移植治疗脊髓损伤实验取得了一定的进展,为严重脊髓损伤的治疗提供r新的方法.细胞移植根据移植物的不同可以大体分为神经细胞移植和非神经细胞移植,移植物包括胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、嗅鞘细胞、活化巨噬细胞、骨髓基质干细胞等.其中胚胎干细胞移植治疗已是脊髓损伤的研究热点之一.
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大鼠嗅鞘细胞和星形胶质细胞对神经干细胞分化作用的比较研究
目的 比较大鼠嗅鞘细胞与星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响.方法 分别从新生SD大鼠嗅球、海马、皮质分离、培养嗅鞘细胞、神经干细胞和星形胶质细胞.收集嗅鞘细胞、星形胶质细胞及其上清液,分别对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)进行诱导分化,倒置显微镜下观察细胞的生长情况,并采用免疫组化法对分化细胞鉴定和计数.结果 嗅鞘细胞组分化为神经元比率高于星形胶质细胞组(P＜0.01).结论 嗅鞘细胞较星形胶质细胞能更好地促进神经干细胞分化为神经元.
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体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞
目的 探讨体外培养的嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的影响.方法 实验分为OECs+MSCs共培养组和MSCs单独培养组,在7 d和14 d两时间点观察MSCs的分化情况.用p75抗体免疫细胞化学染色鉴定OECs细胞的纯度;用巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触后膜致密区蛋白(PSD)等抗体免疫细胞化学染色鉴定已分化的细胞表型.结果 体外培养的MSCs经OECs诱导后分化为神经元样细胞,这些细胞能够表达NF、MAP2和PSD等神经元标记物,而不表达星形胶质细胞标记物GFAP.在培养7 d,MSCs+OECs 7 d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs 7 d组比较有明显增高.在培养14 d,MSCs+OECs 14 d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs 14 d组比较,也有明显增高.结论 体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.
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嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓挫伤后急性期巨噬细胞向M2亚型极化的影响及意义
目的 观察嗅鞘细胞(OECs)移植对脊髓挫伤后急性期损伤区巨噬细胞向M2亚型极化的调控作用,探讨OECs移植促进脊髓损伤修复的机制. 方法 分离培养原代OECs,移植备用.暴露SD大鼠T10脊髓,并用NYU-Ⅱ撞击机将撞击棒(10 g)从25 mm高处垂直落下挫伤脊髓.伤后即刻将24只脊髓挫伤模型大鼠按随机数字表法分为对照组和OECs移植组,每组12只,分别将DMEM/F12培养基或OECs悬液(浓度3×104个/μL,1 μL×3次)注入损伤脊髓处.伤后1～9周时每周采用BBB评分法对大鼠进行运动功能评分.伤后1周时采用免疫荧光染色标记并计数损伤区M2型巨噬细胞及髓鞘相关抑制因子Nogo-A阳性细胞,同时采用Western blotting检测炎症因子白介素(IL)-4、IL-6蛋白的表达.伤后9周时采用HE染色观察损伤脊髓的病理改变. 结果 伤后1～9周时,OECs移植组每周BBB评分均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).伤后1周时,OECs移植组M2型巨噬细胞数量明显高于对照组(3.24％±0.56％ vs.0.63％±0.21％),Nogo-A阳性细胞数量、荧光强度均明显低于对照组[(43±24)个/视野vs.(207±88)个/视野;0.042±0.006 vs.0.062±0.011],抗炎因子IL-4蛋白表达量明显高于对照组(0.717±0.152 vs.0.183±0.063),促炎因子IL-6蛋白表达量明显低于对照组(0.550±0.124 vs.1.060±0.209),差异均有统计学意义(P＜0.05).伤后9周时,HE染色显示OECs移植组囊性空洞面积[(1.511 ±0.581) mm2]较对照组[(2.939±0.823) mm2]明显减小,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 OECs移植可促进脊髓损伤区巨噬细胞向M2亚型极化,并改善炎症微环境、抑制Nogo-A表达,从而促进脊髓结构和功能的恢复.
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年轻成年GFP大鼠嗅鞘细胞的分离培养与形态学特征
目的 建立年轻成年GFP大鼠嗅鞘细胞(OECs)的分离培养方法 ,为OECs移植治疗脊髓损伤奠定基础. 方法 解剖显微镜下、无菌环境取2.5月龄的GFP大鼠嗅球外层,经酶消化法分散后将细胞接种于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中.定期进行光电镜观察并摄片.在培养第10天进行S-100和NGFRp75的免疫细胞化学染色鉴定,并计算OECs的纯度. 结果 培养的GFP-OECs在荧光显微镜下呈绿色强荧光,形态以双极、多突起形为主,呈S-100、NGFR p75阳性,纯度在95%以上.电镜下形态与光镜下一致,但细胞结构更为精细. 结论 本文所用方法 简便易行,可分离出高纯度的GFP-OECs,其形态学特征与生物学活性无变异.源自GFP转基因大鼠的OECs可以作为一种有效的工具细胞,广泛应用于OEC在脊髓损伤修复中的研究.
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不同组织来源人嗅神经鞘细胞生物学与免疫学特性的对比研究
目的 比较成人嗅球与嗅黏膜来源的嗅神经鞘细胞(OECs)的生物学与免疫学特性,探讨后者取代前者行细胞或组织移植治疗的可行性. 方法 分别分离、培养、纯化两种来源的OECs,应用MTT法测定细胞活力,结合对比骨髓间充质干细胞(BMSCs)的免疫特性,应用免疫细胞化学染色、定量技术、流式细胞术、双向混合淋巴细胞反应等方法来比较分析不同组织来源的人OECs的生物学与免疫学特性.结果 两种OECs开始分化时间相同,细胞形态基本一致:生长曲线与活力曲线均走行一致,曲线大部分重合;免疫细胞化学p75~(NTR)染色两者均呈阳性;流式分析两种OECs均不表达CD34与B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、HLA-DR、CD40、CD40L等移植免疫标志:嗅球源性嗅神经鞘细胞组双向混合淋巴细胞反应抑制率(51.18%±6.01%)与嗅黏膜源性嗅神经鞘细胞组(51.00%±5.87%)、BMSCs组(52.79%±3.12%)比较,差异均无统计学意义(P<0.05).结论 成人嗅球与嗅黏膜来源的OECs在生物学与免疫学特性方面基本一致,可考虑使用来源更为便捷的成人嗅黏膜源性OECs代替嗅球源性OECs行细胞或组织移植治疗.
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嗅鞘细胞对原代培养神经干细胞增殖、分化的影响
目的 观察嗅鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)增殖、分化的影响.方法 新生大鼠脑OECs和NSCs原代培养,采用免疫荧光及免疫细胞化学方法鉴定相关细胞.取原代OECs分为2组,实验组去除培养孔的间隔,使OECs和NSCs共用一培养液体系;对照组不破坏培养孔的间隔,单独培养NSCs,其余同实验组.观察2组细胞增殖、分化情况.结果 原代培养的OECs表达神经生长因子受体(P75NGFR);原代培养的神经球表达巢蛋白(nestin),神经球分化的细胞表达神经丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).增殖实验中,实验组NSCs数量较对照组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05).诱导分化实验中,实验组4d、7d时NF200阳性细胞率较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明2种细胞共液培养时,OECs提高了NSCs向NF200阳性细胞分化率.结论 OECs可促进NSCs增殖,并提高了NSCs向神经元分化的效率.
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游离血红蛋白对体外培养成年大鼠嗅鞘细胞存活的影响
目的 观察不同浓度游离血红蛋白(FHb)对体外培养大鼠嗅鞘细胞(OECs)存活的影响. 方法 采用成年大鼠(2.5月)嗅球培养OECs,培养第8天用S-100免疫组化鉴定纯度后,将培养的OECs根据加入的FHb浓度分为1,10,50,100 μmol/L组及正常对照组,观察不同浓度FHb下OECs形态学变化;培养24 h后采用MTT实验检测不同浓度FHb组细胞活力;并用碘化丙啶(PI)和Hoechst33342荧光双染色观察检测细胞死亡. 结果 大鼠OECs纯度为(72±6)%;MTT试验显示各组细胞活力随血红蛋白浓度的升高而降低;PI/Hoechst33342双荧光染色显示在对照组未见PI染色阳性细胞,各FHb组细胞PI/Hoechst33342比例随血红蛋白浓度增加而升高. 结论 FHb对OECs有毒性作用且随浓度的增加而增加.
