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嗅鞘细胞移植治疗帕金森病动物模型的相关研究
目的 利用大鼠同种异体嗅鞘细胞移植的方式对帕金森病模型大鼠进行治疗,初步探究在PD模型大鼠脑内移植嗅鞘细胞能否成为治疗帕金森病的一种有效手段.方法 提取和培养原代OECs,利用6-OHDA两点注射法建立帕金森病动物模型,通过APO诱导方式验证模型及检测治疗效果,通过HE染色进行大鼠黑质细胞形态学观察,利用抗TH荧光染色细胞计数对比治疗前后TH阳性神经元表达情况差异.结果 从嗅鞘细胞移植后的第4周开始,PD模型的行为学诱导旋转圈数明显减少.HE染色结果示:PD模型大鼠毁损侧的黑质致密部的神经元变性明显,且TH阳性神经元数量降低,经OECs治疗后的帕金森大鼠的患侧黑质部位神经元变性改善,且TH阳性神经元含量明显增高.结论 嗅鞘细胞能够改善帕金森模型大鼠的行为学变化.嗅鞘细胞能够提高帕金森模型大鼠患侧黑质部位多巴胺神经元含量.
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嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓损伤后水通道蛋白-4的影响
目的: 探索大鼠嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury SCI)后水通道蛋白-4(AQP-4)和后肢功能的影响.方法: 取Wistar大鼠150只,随机分为正常组(50只)、模型组(50只)、OECs移植组(50只),模型组和OECs移植组用改良的Allen法制成脊髓损伤模型,造模成功后,其中OECs移植组在损伤处移植嗅鞘细胞,模型组移植DF-12培养液.于术后1、3、7、14、21、28 d进行BBB (Basso-Beattle-Bresnahan)运动功能评分,应用免疫组织化学技术检测脊髓组织AQP-4的表达,并用图像分析仪进行定量分析.结果: 术后3～28 d,OECs移植组的BBB评分较模型对照组明显提高,术后第1天,模型组和OECs移植组受损脊髓灰质、白质中AQP-4的表达明显增加;第3天时均达到高峰,但OECs移植组低于模型组(P<0.05).第7、14、21、28天,与模型组比较,OECs移植组AQP-4表达也较低(P<0.01).结论: OECs移植使脊髓损伤后AQP-4表达减少,这可能有利于抑制脊髓水肿、消除脊髓继发性损伤,保存残存正常脊髓组织并促进神经轴突再生,改善其肢体运动功能.
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痿症方联合嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓慢性压迫损伤后NCAM-mRNA表达的影响
目的:研究痿症方联合嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)的移植对脊髓慢性压迫损伤后神经细胞黏附因子(neural cell adhesion molecule, NCAM)的影响,探索OECs促进脊髓再生的机制.方法:将体外培养的OECs制成细胞悬浮液移植到脊髓慢性压迫损伤的动物模型中,运用适时定量逆转录-聚合酶链反应(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)的方法检测NCAM-mRNA表达.结果:脊髓损伤后脊髓组织中NCAM-mRNA的表达增加,与正常组相比具有非常显著性差异(P<0.01);嗅鞘细胞移植利痿证方均能增强NCAM-mRNA的表达,与模型组相比具有显著性差异(P<0.05);痿证方中药血清培养的嗅鞘细胞移植也能增强NCAM-mRNA的表达,与单纯嗅鞘细胞移植组相比具有显著性差异(P<0.05).结论:大鼠脊髓慢性损伤后脊髓组织中NCAM-mRNA的表达增强,嗅鞘细胞移植和痿证方均能进一步增强NCAM-mRNA的表达,两者具有协同作用.
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新生大鼠嗅鞘细胞的体外培养和纯化
目的 建立一种可行的体外培养和纯化嗅鞘细胞(OECs)的方法.方法 利用显微外科技术,从新生大鼠脑中取出嗅球的嗅神经组织,去除脑膜和微血管,消化后细胞接种在含有10%的DMEM/F12(1:1)培养液中于体外进行培养,应用含血小板凝集抑制素、牛垂体提取液的DMEM/F12培养液,将这些细胞接种于p75包被的培养皿中纯化培养.用P75抗体免疫组织化学染色鉴定OECs,计算纯化度.结果 OECs的外形主要以突起细长的双极和三极为主,随时间延长细胞生长排列呈现一定方向性.P75抗体免疫组化呈阳性.此方法获得的OECs纯度可达90%以上.结论 本研究所建立的培养方法可行,适宜从新生大鼠中获得嗅鞘细胞.
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神经干细胞与嗅鞘细胞移植对脊髓全横断大鼠后肢运动功能的影响
目的 探讨神经干细胞(NSCs)与嗅鞘细胞(OECs)移植对脊髓全横断大鼠后肢运动功能的影响.方法 SD大鼠行T11脊髓全横断术后,随机分为NSCs移植组、OECs移植组、联合移植组和对照组.术后将取自绿色荧光蛋白(GFP)转基因胚胎小鼠海马和新生小鼠嗅球的、经培养鉴定后的NSCs和OECs,以明胶海绵做载体分别或联合移植到各移植组动物脊髓损伤处,对照组不移植细胞,用BBB评分法评价1～8周大鼠后肢运动功能恢复的程度.8周后移植各组动物行左心室主动脉内4%多聚甲醛灌注,取横断处上下各约1 mL脊髓,连续冰冻切片(片厚20μm),置于荧光显微镜下观察切片中有无绿色荧光细胞,确定NSCs及OECs的存活情况.结果 NSCs及OECs细胞在移植脊髓损伤后能存活,并向周围迁移;术后3和4周末,NSCs组、OECs组和联合移植组大鼠运动功能均较对照组有明显改善(P＜0.05);且3周时,联合移植组和OECs组比NSCs组后肢运动功能变化显著(P＜0.05);而联合移植组和OECs组比较后肢运动功能未见显著差别(P＞0.05).结论 NSCs、OECs和联合移植在早期均可促进脊髓全横断大鼠运动功能恢复;OECs组、联合移植组效果均优于NSCs组;联合移植对大鼠运动功能恢复在早期没有显现佳作用.
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CFDA-SE和Hoechst两种荧光标记技术在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中的应用
目的 将CFDA-SE和Hoechst两种常用的细胞荧光标记技术在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中的应用进行比较,选出一种更适合的方法进行推广.方法 取20只脊髓完全横断的SD大鼠,其中10只移植用CFDA-SE标记的嗅鞘细胞,另10只移植用Hoechst标记的嗅鞘细胞.结果 两种标记方法都能成功标记上,但Hoechst对移植后组织的污染率较高,CFDA-SE染色清楚,对受区组织干扰较少.结论 CFDA-SE相比Hoechst在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中进行荧光标记更清楚、更准确,值得推广.
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嗅鞘细胞修复脊髓损伤的研究进展
对嗅鞘细胞的生物学特性及其对脊髓损伤的研究进展进行回顾,总结嗅鞘细胞的研究和应用成果,为探讨脊髓损伤的修复对策提供指导和实验方法,以期为改善脊髓损伤的临床治疗效果提供新的思路和方法.
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嗅球和嗅黏膜来源的嗅鞘细胞对脊髓损伤小鼠的治疗效果比较
目的 体外分离、培养不同来源的嗅鞘细胞,并鉴定其生物学特性,比较不同来源的嗅鞘细胞生物活性,评价其对脊髓损伤模型小鼠的疗效的差异.方法 差速贴壁法分别培养嗅球和嗅黏膜来源的嗅鞘细胞,免疫荧光染色检测该细胞特异性蛋白S100、P75的表达,并对二者生长曲线及在不同代次、不同浓度梯度条件下神经营养因子分泌情况进行检测,实时定量PCR(qRT-PCR)鉴定二者脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT-3)、神经营养因子4(NT-4)、轴突膜蛋白生长相关蛋白43(GAP-43)、微管相关蛋白(MAP-2)基因表达,并分别将两种细胞移植入脊髓横断小鼠模型中,以小鼠神经功能评分及脊髓内移植细胞分布情况进行评估.结果 所获得不同来源的嗅鞘细胞呈双极、三极样形态生长,且S100、P75蛋白表达均为阳性,嗅黏膜来源细胞不表达MAP-2,高表达GAP-43,嗅球来源的细胞低表达MAP-2和GAP-43,嗅球来源细胞生长活性大于嗅黏膜来源的细胞,其中嗅黏膜细胞来源分泌营养因子高于嗅球来源的细胞,小鼠神经功能评分显示嗅黏膜来源细胞治疗脊髓损伤模型效果明显高于嗅球来源的嗅鞘细胞.结论 两种来源的嗅鞘细胞存在生物学差异,嗅黏膜来源细胞治疗脊髓损伤效果高于嗅球来源的嗅鞘细胞,可以作为临床应用的种子细胞.
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差速贴壁结合神经营养因子3体外纯化培养人胚嗅鞘细胞
目的:采用差速贴壁结合神经营养因子3的方法对人胚嗅球嗅鞘细胞进行原代纯化培养,探讨简单实用的嗅鞘细胞体外培养方法.方法:将差速贴壁后人胚嗅鞘细胞间隔48 h用含100 mL/L胎牛血清和含NT3的DF12培养液交替进行体外培养.观察嗅鞘细胞的生长变化,采用形态学和P75免疫细胞化学染色进行细胞及纯度鉴定.结果:体外培养的人胚嗅鞘细胞P75染色呈阳性反应,呈双极、三极细胞,细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.在体外培养9 d时可以获得95%的嗅鞘细胞,12 d时为83%,且细胞状态良好.结论:差速贴壁法结合间断NT3应用是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法.
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小鼠嗅鞘细胞培养的初步研究
目的:研究小鼠嗅鞘细胞(OECs)体外培养的不同方法,为获取数量多、活性好、形态优的嗅鞘细胞提供一定的实验基础.方法:4只出生2～3个月的BALB/c小鼠,经枕骨大孔取嗅球,剥离嗅球外周两层制成细胞悬液.采取未纯化培养对照组、一次差速贴壁结合阿糖胞苷( Ara-c)纯化与多聚左旋赖氨酸包被培养板培养组(纯化包被组)和一次差速贴壁结合Ara-c纯化与未用多聚左旋赖氨酸包被培养板培养组(纯化未包被组)分别培养小鼠OECs,观察其原代和传代培养的细胞生长状况及形态,并进行免疫细胞化学鉴定.结果:纯化未包被组OECs早中期无论数量还是形态都优于纯化包被组,而未纯化对照组的OECs早中期数量明显优于纯化组.结论:一次差速贴壁结合Ara-c纯化未包被进行小鼠OECs培养是一种简捷有效地方法.
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预变性成年大鼠嗅神经后嗅球嗅鞘细胞的培养
目的:对预变性大鼠嗅神经后嗅球嗅鞘细胞的形态学及免疫组化进行研究,探讨获取自体激活嗅鞘细胞简单而实用的方法.方法:建立嗅神经切断模型,大鼠(12只)均在显微镜下暴露左侧嗅球,而预变性嗅神经组(6只)切断大鼠左侧嗅神经,3 d后取材采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅鞘细胞,在不同时间进行NGFRp75 免疫组化染色鉴定及形态学观察.结果:嗅鞘细胞发生代偿性肥大,数量及纯度高,此方法成功培养出自体激活的嗅鞘细胞.结论:预变性嗅神经是获取成年大鼠自体激活嗅球嗅鞘细胞的简单而实用的方法.
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经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞
目的:采用经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞(OECs),以探求更加简单、高效的嗅黏膜OECs取材和培养纯化方法.方法:成年雄性SD大鼠6只,采用经改良的方法剥取嗅黏膜,然后用改良差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs.倒置相差显微镜下观察细胞生长情况以及形态并照相,培养7 d、14 d细胞行NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定,并根据免疫细胞化学染色结果计算细胞纯度.结果:体外培养的嗅黏膜OECs形态主要有扁圆形或油煎蛋形、梭形或双极、多突起形.嗅黏膜OECs NGFRp75免疫细胞化学染色阳性.培养7 d嗅黏膜OECs纯度为90%,培养14 d嗅黏膜OECs纯度为85%.嗅黏膜OECs长可以存活35 d.结论:经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs具有简单、高效的优点,培养的嗅黏膜OECs的纯度完全可以达到细胞移植的要求.
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S100β对炎症条件下嗅鞘细胞的作用及机制
目的:明确S100β对干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)诱导的炎症条件下嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的作用,并探讨其发挥作用的机制.方法:将采用改良差速贴壁联合胰酶限时消化3 min法纯化培养的大鼠OECs分为空白对照组、炎症模型组、S100β组等3组,每组种板1×106/ml;空白对照组采用常规培养体系培养OECs,炎症模型组采用重组IFN-γ诱导炎症建立OECs体外炎症模型,S100β组在炎症模型组基础上加入S100β蛋白进行干预;采用免疫荧光染色进行OECs鉴定及纯度分析;利用MTT法检测OECs的增殖情况并筛选IFN-γ诱导OECs炎症模型的适宜浓度;利用TUNEL染色法判断各组OECs的凋亡状况;采用Real-Time PCR检测各组OECs表达炎症相关因子iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA水平.根据以上结果,判断在炎症环境中S100β对OECs的影响及可能机制.结果:采用改良方法原代培养的大鼠OECs能够获得80％纯度;与5 ng/ml的浓度相比,10 ng/ml的IFN-γ对OECs的抑制率更高,凋亡细胞更多;与炎症模型组比较,S100β干预组细胞增殖能力升高,凋亡细胞减少;炎症相关因子iNOS、IL-1β以及TNF-α的基因表达水平下降.结论:S100β可以下调IFN-γ激活的炎症因子iNOS、IL-1β和TNF-α的基因表达水平,提示S100β可能是通过抑制炎症因子的表达从而减少了OECs凋亡的发生.本研究结果为深入研究S100β联合嗅鞘细胞移植对周围神经损伤的修复作用奠定了基础.
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新生大鼠嗅鞘细胞的改良培养方法研究
目的:探讨新生大鼠嗅鞘细胞的分离、培养和纯化方法.方法:取2d内的新生大鼠嗅球组织,在解剖显微镜下分离取材,原代培养嗅鞘细胞,运用差速贴壁法和差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法两种方法进行纯化,在倒置显微镜下观察不同培养时间嗅鞘细胞的形态、数量和NGFRp75抗体免疫荧光结果,统计嗅鞘细胞的纯度.结果:嗅鞘细胞的纯度分别是差速贴壁组平均为60.41％±4.32％,差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法组平均为84.98％±4.03％.两组数据用t检验进行统计学分析,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:取材于新生大鼠；显微镜下分离脑膜；差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法纯化,都是良好的嗅鞘细胞培养方法.
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微囊化异种嗅鞘细胞移植联合中药修复大鼠脊髓损伤
目的:旨在探讨基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在异种嗅鞘细胞移植联合中药干预下脊髓损伤中的作用.方法:将188只SD大鼠随机分为正常对照组、单纯损伤组、异种嗅鞘细胞移植组、异种嗅鞘细胞移植联合中药治疗组,损伤组又设1、3、7、14、28 d5个时相点,免疫组织化学技术检测MMP-9的表达,同时电镜观察血脊髓屏障的变化.结果:脊髓损伤后血脊髓屏障的超微结构不同程度损害、MMP-9表达上调,经干预治疗后出现一定程度的恢复,MMP-9表达下调.结论:脊髓损伤后MMP-9表达水平增加与伤后血脊髓屏障损害的发生、发展密切相关,MMP-9在脊髓损伤后血脊髓屏障损害的病理生理过程中起重要作用.异种嗅鞘细胞移植联合中药对脊髓损伤有较好的修复作用.
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嗅鞘细胞的分离纯化及上清液中神经营养因子的测定
目的:创建理想的纯化嗅鞘细胞(OECs)的方法,并观察不同时间段OECs上清液中神经营养因子的含量,为选择OECs移植的佳时机提供理论依据.方法:采用差速贴壁法结合免疫亲和吸附法纯化培养OECs,采用荧光染色法鉴定OECs并进行纯度测定；采用ELISA法检测培养上清液中神经生长因子(NGF),脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质源性神经营养因子(GDNF)的水平.结果:通过上述方法,可以得到纯度85％以上的OECs,光镜下 OECs突起细长,以典型的双极或三极细胞为主,背景有少量扁平的、折光性差的细胞存在；NGF、BDNF和GDNF在上清液中均有存在,其中NGF含量高,NGF和BDNF含量随着培养时间延长逐渐升高,11 d达到高峰,GDNF仅在培养第11 d后检测到.结论:采用差速贴壁法结合免疫亲和吸附法可以获得较高纯度的OECs,培养11～14 d,OECs数量多且分泌旺盛,适合用于细胞移植.
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两种不同纯度的嗅鞘细胞在体外存活与生长的比较
比较80%和50%两种纯度的嗅鞘细胞在体外培养条件下的存活与生长,为嗅鞘细胞体内移植选用佳纯度提供依据.分离、培养并纯化成年SD大鼠嗅鞘细胞,将纯化的嗅鞘细胞和收集到的贴壁成纤维细胞进行约80%和50%的比例混合后接种,继续培养1 d或3 d.所有细胞于不同时间点行P75免疫细胞化学,荧光染色,以罄定嗅鞘细胞的初始及其后培养过程中数量和纯度的变化.观察细胞状态,计数细胞总数和P75免疫阳性细胞数目,求得各组嗅鞘细胞数量和纯度并行统计学分析.结果显示:两种不同纯度嗅鞘细胞在培养1 d时形态正常,3 d时纯度为50%的嗅鞘细胞胞体依然饱满,突起更加纤长,数量和纯度亦无明显下降.而纯度为80%的嗅鞘细胞在培养3 d时已出现胞体萎缩和突起变短,数量从1 d时每一观察区域内的35±13显著下降为23±5(P=0.02).但纯度未发牛明显变化.结果表明50%纯度嗅鞘细胞的存活及生长状态优于80%者,提示细胞体内移植时应考虑选取50%纯度的嗅鞘细胞.
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一种新的培养嗅鞘细胞方法
为了建立一种新的培养嗅鞘细胞的方法,从而为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞.本研究取新生鼠的嗅球外两层经胰蛋白酶消化成单细胞悬液,经差速贴壁法纯化,观察并记录其形态特征;经HE染色以及神经生长因子蛋白受体p75(NGFR-p75)和S-100免疫组化染色鉴定并计算其纯度.结果显示,获得的嗅鞘细胞突起呈双极或三级,p75和S-100阳性细胞纯度达剑91%.上述结果提示该方法经济易行,所获得的嗅鞘细胞纯度高,活性好.
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嗅鞘细胞与氯化锂联合修复成年大鼠急性脊髓损伤的实验研究
为观察联合应用氯化锂(LiCl)后,嗅鞘细胞(OECs)移植对大鼠急性脊髓损伤修复效果,并探讨二者之间可能的相互作用,本研究利用多中心急性脊髓损伤打击器(MASCIS impactor)制作大鼠脊髓打击伤模型,然后随机分为OECs组、LiCl组、OECs +LiCl组及空白对照组.分期用实验性脊髓损伤运动功能BBB评分法对后肢运动功能评分,并进行组织学检查,评价及比较各组修复效果.结果显示:OECs组与OECs+LiCl组BBB评分较LiCl组与对照组在2周后各时段有显著性差异(P＜0.01);OECs +LiCl组BBB评分在4周后显著高于OECs组(P＜0.01);组织学检查观察到OECs组与OECs+LiCl组的组织学改变与LiCl组和对照组有显著性差异,而且OECs+LiCl组相对于OECs组表现出更明显的促神经纤维再生.以上结果提示OECs对脊髓损伤的修复作用在联合LiCl后更加显著,表明二者具有良好的协同作用关系.
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嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓半横断损伤后轴突再生及后肢功能恢复的作用
为了对嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后轴突再生及后肢功能恢复进行综合性的评价,本实验采用22只雌性成年SD大鼠,并随机分成A、B、C、D 4组.其中A、B、D组行左侧T11～T12节段脊髓半横断手术,然后A组移植嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)悬液;B组移植DMEM/F12培养液;D组移植核荧光试剂(Hoechst33342)标记的嗅鞘细胞,用于鉴定嗅鞘细胞在体内的存活情况;C组作为正常对照组.术后6周内,对大鼠进行BBB评分、IP斜板试验并观察皮质体感诱发电位(cortical somatesensory evoked potential,CSEP)、运动诱发电位(motor evoked potential,MEP)的潜伏期.将辣根过氧化物酶(HRP)注射到横断面尾段脊髓,逆行追踪观察横断面头段脊髓及对侧中脑红核内HRP逆标细胞数,并观察左侧后肢小腿三头肌肌细胞横截面积及直径的变化.结果显示:(1)移植后的OECs数量未见明显减少,细胞核形态较好,细胞未向头、尾侧迁移;(2)移植3周后BBB评分及IP斜板,试验A、B组较C组明显低(P<0.05),但A组明显高于B组(P<0.05);(3)A、B组的CSEP及MEP潜伏期较C组明显延长(P<0.05),但A组要比B组明显缩短(P<0.05);(4)HRP逆行追踪观察到对侧中脑红核大细胞区及脊髓T9～T11节段逆标细胞的数量,A组明显多于B组,但A、B组均少于C组;(5)左侧后肢小腿三头肌肌细胞的横截面积及直径,A、B组均较C组减少,但A组减小的幅度明显小于B组.以上结果表明OECs移植能促进半横断脊髓轴突的再生及后肢功能的恢复.
