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嗅鞘细胞培养液对海仁藻酸损伤脊髓神经元一氧化氮产生的影响
目的研究嗅鞘细胞培养液(OECCM)对海仁藻酸(KA)损伤后原代培养脊髓神经元的作用,进一步探讨其保护的作用机理.方法采用原代细胞培养法,分别培养了胚胎小鼠脊髓神经元和成年大鼠的嗅神经鞘细胞(OECs),收集OECCM.通过给予KA建立体外的损伤模型,KA分别作用6,8,12 h后,加入OECCM继续培养24～36 h.然后进行抗神经元型一氧化氮合酶(ncNOS)免疫细胞化学染色,观察细胞ncNOS表达情况,并对各组ncNOS阳性神经元数目进行统计,同时运用四唑盐(MTT)比色法检测神经细胞活性;后对不同组的一氧化氮合酶(NOS)阳性细胞染色情况、阳性细胞数目和细胞活性进行比较.结果KA作用后,一氧化氮(NO)都出现异常表达,但与实验组(OECCM干预组)相比,OECCM处理组NO表达水平明显低于单纯KA损伤组.OECCM处理组NOS阳性细胞数目(6 h组,34.3±5.25;8 h组,40.6±3.68),明显低于对照组(6 h组,42.3±3.48;8 h组,54.5±6.30)(P＜0.01),在KA损伤12 h时,两组NOS阳性细胞数(52.3±5.23 vs 61.32±6.45)(P＜0.05);而细胞活性(6h,0.372±0.034;8 h,0.312±0.026)明显高于对照组(6 h,0.283±0.041;8 h,0.219±0.033)(P＜0.01),12 h时两组细胞活性没有明显差异(0.199±0.012 vs 0.202±0.032)(P＞0.05). 结论OECCM中可能含有一些保护脊髓神经元免遭KA损伤的因子,这些因子可能在参与抑制NOS异常表达起了重要作用.
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神经组织工程种子细胞研究进展
神经系统损伤与再生修复的研究是当今神经科学领域的热点.随着成体神经干细胞的发现、材料技术和细胞培养技术的发展,组织工程学方法为神经损伤的治疗带来了希望[1].组织工程的核心是建立种子细胞和支架材料的三维空间复合体.种子细胞的培养是组织上程的基本要素,细胞主要来源于自体、同种异体、异种组织细胞等.本文就近年来神经组织工程种子细胞的研究进展进行综述.
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嗅鞘细胞的可塑性研究
2004年诺贝尔医学和生理学奖得主Richard Axel和Linda Buck证实:原来认为不具备分化能力的小鼠嗅感觉神经元能够再次进入细胞周期发生分裂,这一发现是嗅觉神经系统可塑性的典型体现.
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人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化
目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.
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自体嗅黏膜联合多细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展
细胞及组织移植修复脊髓损伤(SCI)是一种极具前景的治疗方法,目前研究的移植细胞有嗅鞘细胞(0ECs)、雪旺细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脐血干细胞等,移植方法从单一细胞发展到多种细胞联合；修复环境和神经营养因子也有可能对受损神经修复起重要作用.本文就自体OECs联合多细胞移植治疗SCI作一综述.
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黄色人种和白色人种晚期脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植疗效比较
目的:探讨黄色人种和白色人种晚期脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植疗效.方法:回顾分析2004-2005年收治的完全性脊髓损伤接受黄种人胚胎嗅鞘细胞移植的患者60例,其中黄种人和白种人各30例.将胚胎嗅鞘细胞移植到脊髓损伤部位的上下两点.所有患者在胚胎嗅鞘细胞移植术前和术后2～6周按ASIA标准评价,比较不同人种对胚胎嗅鞘细胞移植后功能恢复的疗效.结果:(1)黄种人组手术前后ASIA评分变化,轻触觉(48.77±25.00)分→(54.27±23.29)分(P=0.005);痛觉(49.40±24.76)分→(55.67±23.19)分(P=0.002);运动评分(36.67±18.99)分→(41.40±18.73)分(P=0.000).白种人组轻触觉(35.07±24.69)分→(41.77±23.62)分(P=0.000);痛觉(35.53±25.17)分→(39.20±22.55)分(P=0.000);运动评分(28.83±20.41)分→(31.77±19.54)分(P=0.000).(2)黄种人组和白种人组患者轻触觉、痛觉、运动评分改善情况差异无显著性[(5.50±10.03)分vs.(6.70±7.01)分,(P=0.557);(6.93±9.57)分vs (5.67±6.58)分,P=0.515;(4.73±6.26)分vs. (2.93±3.60)分,P=0.197].结论:胚胎嗅鞘细胞移植能帮助晚期脊髓损伤患者恢复部分神经功能,黄色人种和白色人种嗅鞘细胞移植后疗效差异无显著性.
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医用耳脑胶在脊髓手术中的应用
神经外科脊柱脊髓手术中脑脊液漏和脑脊液囊肿是较常见的并发症[1-3].近我科对24例晚期脊髓损伤施行嗅鞘细胞脊髓内移植手术时,采用医用耳脑胶封闭切口,获得满意效果,现报告如下.
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单次差速贴壁法纯化培养大鼠嗅神经鞘细胞的实验研究
目的:探讨单次差速贴壁法纯化培养成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的可行性.方法:选取8～10周龄的成年SD大鼠,无菌条件下切取嗅球、剪碎,胰酶消化制成细胞悬液后接种,采用18 h单次差速贴壁的方法纯化培养嗅鞘细胞,定期在倒置显微镜下观察嗅鞘细胞的形态学变化及生长情况,并对其行神经生长因子受体p75抗体(NGFR p75)及碘化丙啶的免疫荧光鉴定,同时计算嗅鞘细胞的纯度.结果:通过18 h单次差速贴壁法纯化培养的嗅鞘细胞经NGFR p75免疫荧光鉴定后,纯度可达70%～80%,形态上以双极和三极细胞为主,伴有少许单极及多极细胞.结论:应用18 h单次差速贴壁法纯化培养嗅鞘细胞是一种简便、稳定、经济、快捷的方法.
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条件培养基、Forskolin与bFGF对嗅鞘细胞增殖效应的研究
目的 研究对比多种不同增殖剂及其联合剂扩增原代嗅鞘细胞的效应.方法 将纯化的嗅鞘细胞按照随机化原则分为六组分别行增殖剂干预:①空白对照组；②有血清条件培养基组；③Forskolin组；④bFGF组；⑤Forskolin+bFGF组；⑥有血清条件培养基+Forskolin+bFGF干预组.每组干预3d后应用免疫染色和BrdU掺入法全面评估各增殖剂及其联合试剂对嗅鞘细胞生长增殖的影响效果.结果 三种增殖剂较空白对照组都可促进嗅鞘细胞活性(P＜0.05),且其联合试剂均可明显促进嗅鞘细胞增殖(P ＜0.001).结论 三种增殖剂对嗅鞘细胞均有增殖效应,且其联合作用可以大幅提升嗅鞘细胞的数量,其叠加效果明显.
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嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤修复的研究进展
脊髓损伤是重要的致残因素,常遗留严重的残疾,包括运动功能丧失(瘫痪)、感觉障碍、膀胱排尿功能紊乱、肌痉挛、关节挛缩、疼痛、褥疮、心理障碍、性功能不全、甚至呼吸障碍.长期以来,国内外研究人员对脊髓损伤治疗手段的开发进行了大量的基础和临床试验,但迄今为止尚无特异性治疗方法,脊髓损伤后再生修复的研究一直是神经科学领域的前沿课题.
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嗅鞘细胞和间质干细胞用于治疗脊髓损伤的研究进展
脊髓损伤(SCI)的临床治疗主要以手术结合免疫治疗为主,但是往往不能收到良好的效果.干细胞能发挥神经保护和促进神经再生的特点,因而近年干细胞治疗SCI成为研究的热点之一,并在基础和临床研究中均获取得一定的进展.本文就嗅鞘细胞和间质干细胞用于治疗SCI的研究做一简要综述.
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嗅鞘细胞复合细胞外基质凝胶移植对周围神经损伤后运动神经元的保护作用
目的探索周围神经损伤后嗅鞘细胞(OECs)和细胞外基质(ECM)凝胶复合移植对周围神经运动元的保护作用.方法将Wistar大鼠20只随机分为实验组、对照组.每只大鼠均切断右侧坐骨神经,之后以硅胶管套接于坐骨神经切断部位,实验组囊内给予OECs制成1×10ml的ECM凝胶,对照组囊内给予磷酸缓冲液(PBS)0.05ml.术后2周,应用酶组织学方法进行相应阶段脊髓前角α运动神经元一氧化氮合酶(NOS)和乙酰胆碱脂酶(AchE)染色,通过标准网格法进行神经元计数并应用计算机图像分析测定胞体的直径和面积.结果与正常侧相比,对照组损伤侧脊髓前角α运动神经元NOS活性明显增高,实验组差异无显著性(P＞0.05),损伤侧实验组3.8±1.4,对照组11.4±2.6,差异非常显著性.对照组损伤神经元胞体直径(27.83±5.28)cm,面积(630.24±52.27)cm2,未损伤侧直径(23.31±3.87)cm,面积(438.47±142.14)cm2,损伤明显增加.结论周围神经损伤后,嗅鞘细胞复合细胞外基质凝胶对脊髓前角运动神经元具有保护作用.
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MMP-2／Notch1转染的嗅鞘细胞移植对急性脊髓损伤的作用
目的：观察 MMP-2／Notch1转染嗅鞘细胞（OEG）移植对急性大鼠脊髓损伤的作用。方法将构建的 MMP-2／Notch1的质粒导入嗅鞘细胞，并移植入急性脊髓损伤大鼠体内，连续观察12周，与接受单纯OEG移植的脊髓损伤大鼠进行比较。结果移植转染MMP-2／Notch1能够增强嗅鞘细胞的迁移能力，移植到脊髓损伤大鼠体内与对照组比较，能减少组织的缺损、轴突的坍塌、神经元的坏死凋亡，抑制胶质细胞的过度增殖。结论 MMP-2／Notch1转染的嗅鞘细胞相对于单独转染嗅鞘细胞能更有效的促进脊髓损伤功能的修复。
关键词： 脊髓损伤 MMP-2/Notch1 嗅鞘细胞 转染 大鼠 -
嗅鞘细胞移植后通过分泌MMP-3在RCS-P+大鼠视网膜中迁移
目的 初步研究将嗅鞘细胞( olfactory ensheathing cells,OECs)及嗅球成纤维细胞(olfactory nerve fibroblasts,ONF)混合细胞移植到皇家外科学院大鼠(Royal College of Surgeon rat,RCS-P+ rat)的视网膜下腔后,OECs/ONF迁移进入视网膜的机制.方法 离体实验中,取成年RCS-rdy+-P+大鼠的嗅球培养OECs/ONF至14d行OECs/ONF的基质金属蛋白酶-3(matrix- metalloproteinase-3,MMP-3)细胞免疫荧光染色.收集5、8、11、14 d OECs/ONF培养液上清,与普通培养液超滤后进行酶联免疫吸附实验( ELISA),检测MMP-3的含量变化.在体实验中,制作40只RCS-P+大鼠单眼视网膜下腔细胞移植,并以对侧眼作为伪手术组以及相同天龄未处理大鼠作为对照组.术后7、14、21、28 d用ELISA法检测细胞移植组、伪手术组及未处理组大鼠视网膜中MMP-3含量的变化.将携带绿色荧光的慢病毒感染后的OECs/ONF移植到4只RCS-P+大鼠视网膜下腔,激光共聚焦显微镜观察移植后7、14、21 d及28 d OECs/ONF在视网膜中迁移情况.结果 离体实验中,培养14d时OECs/ONF的MMP-3免疫细胞化学染色阳性.OECs/ONF培养液上清MMP-3含量分别为5d(2.83±0.80)、8 d(6.34±1.12)、11 d(11.65±1.35)、14 d(19.11 ±2.11),明显高于普通D/F12+ 10％ FBS培养液(1.65±0.44) (P＜0.01)；在体实验中,移植后21 d及28 d,OECs/ONF移植组视网膜MMP-3的含量[(1.80±0 29)、(3.96±0.51)]明显高于伪手术组[(1.17±0.20)、(1.83±0.26)]和未处理组[(1.19±0.17)、(1.92±0.25)](P＜0.01),伪手术组与未处理组之间无明显统计学差异(P＞0.05).激光共聚焦显微镜观察可见移植后7～28 d,OECs/ONF 在视网膜中迁移,远能够达到神经节细胞层.结论 OECs/ONF移植到RCS视网膜下腔后,可能通过分泌MMP-3在RCS-P+大鼠视网膜中迁移.
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嗅鞘细胞与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物材料的细胞相容性研究
目的 探讨嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物[poly(DL-lactide-co-gly-colide),PLGA]材料的细胞相容性.方法 将新鲜分离的OECs细胞悬液接种于PLGA膜上,然后用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长及细胞与材料的附着情况;MTT、流式细胞术等方法 测定OECs的细胞增殖和细胞周期变化.结果 PLGA膜上培养OECs的形态特征、增殖能力、细胞周期及倍体水平等与正常培养的OECs相比,均无显著性差异(P>0.05).结论 PLGA生物材料与OECs相容性好,适于构建组织工程化人工神经.
关键词： 嗅鞘细胞 聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物 细胞相容性 人工神经 -
NOV在嗅鞘细胞中的表达及活性检测
目的检测肾母细胞瘤过度表达基因(nephroblastoma overexpressed gene,nov)所编码产物(NOV蛋白)转染嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)后在OECs中的表达以及活性.方法本研究用nov转染原代培养大鼠OECs,用G418筛选,经过Western blot检测c-myc-NOV的表达以及通过背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)与NOV转染后OECs联合培养来对表达的nov活性进行鉴定.结果①Western-blot结果显示,转染了NOVcDNA的OECs总蛋白c-Myc抗体检测可见约28×103条带,即c-myc-NOV融合蛋白.未转染质粒的OECs总蛋白做对照,结果为阴性,无条带出现.②与nov修饰的OECs联合培养DRG有许多DRG细胞向外迁移,细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络.未修饰的OECs组只有少量的细胞迁移和突起生长,细胞迁移和突起生长都很局限.空白对照组DRG仅有细胞迁移.结论nov转染OECs后,并能促进与OECs联合培养的DRG细胞的迁移生长,表明产生了具有促神经细胞生长活性的蛋白.
关键词： 肾母细胞瘤过度表达基因 嗅鞘细胞 细胞培养 背根神经节 -
细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是中枢神经系统的严重创伤,常导致损伤平面以下肢体不可逆的感觉及运动功能丧失,给患者和社会带来极大的痛苦和负担.随着神经生物学和干细胞技术的发展,通过细胞移植以增加脊髓神经细胞数量、减少胶质瘢痕和空洞形成已成为可能,因此,细胞移植将有望成为一种有效治疗SCI的新方法.现将细胞移植治疗脊髓损伤的相关研究综述如下.
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嗅鞘细胞与脊髓损伤再生修复
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后再生修复困难,而嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植被认为是治疗SCI有潜力、希望的方法.本文就近年来关于OECs的生物学特性、在SCI中的应用及其机制研究方面作一简要介绍.
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嗅鞘细胞对骨髓基质干细胞增殖及Galc表达的影响
目的 嗅鞘细胞(OEC)和骨髓基质干细胞(BMSG)是两种可供移植用的种子细胞.联合应用两种细胞移植治疗神经疾病是较为乐观的策略,但作用机制尚待研究.方法 本实验利用MTT法和RT-PCR技术探讨OEC对体外培养BMSC增殖和基因表达的影响.结果 体外培养细胞生长良好,分别经CD44和P75染色鉴定为BM-SC和OEC.共培养的BMSC与单独培养的BMSC比较有更强的增殖能力,差异有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR结果 显示共培养BMSC中Gale基因表达明显较单纯BMSC者下调,差异有统计学意义(P＜0.05).本实验还检测了其它多种因子(β-TublinⅢ、APC、TGF-β2、IGF-1、Bel-2、Bax)表达,但均没有明显变化(P＞0.05).结论 OEC能促进BMSC增殖,其分子机制可能与OEC调节BMSC表达细胞因子有关,其中Galc是一个值得关注的分子.
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嗅鞘细胞移植对脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能的影响
目的 观察嗅鞘细胞移植物对脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能的影响.方法 30只雌性成年SD大鼠制成脊髓半横断损伤模型,并随机分成5组立即进行移植,A组移植纯化的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells ,OECs)悬液,B组移植纯化的OECs培养上清液,C组移植未纯化的OECs,D组移植未纯化的OECs培养上清液,E组移植DMEM/F12培养液,术后6 w内进行BBB评分和IP实验,用单因素方差分析进行统计学分析.结果 A组的BBB评分在3w后较其它组高,差异有统计学意义(P＜0.05),A组的IP实验结果在4 w后较其它组高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 纯化培养嗅鞘细胞移植能促进脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能恢复.
