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幼年猪半月板体外器官培养模型的建立
目的:观察幼年猪半月板在体外器官培养条件下的组织变化特点,为在体外器官培养下进行半月板研究提供实验依据.方法:1月龄幼年猪8头,取双膝内、外侧半月板,从每个半月板体部横行切取宽约8mm标本1份,共32份标本,进行体外器官培养.分别于培养0、2、4、6周后随机取出8个标本行组织学检查,HE染色观察半月板内侧1/3区域,计数每个视野的细胞数,比较各时间点间的差异；番红O染色观察半月板内侧1/3区域,记录染色程度,半定量评分,比较各时间点间的差异.结果:培养0、2、4、6周后,各时间点间每高倍视野的细胞数差异有统计学意义(P＜0.05),两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).培养0、2、4、6周后,各时间点间番红O染色半定量评分差异有统计学意义(P＜0.05),两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:随体外器官培养时间延长,幼年半月板软骨细胞密度及活性逐渐下降.体外器官培养模型适合半月板的短期研究.
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兔椎间盘器官与脊柱运动节段离体培养条件下髓核组织的变化
目的:比较离体培养的兔椎间盘器官及脊柱运动节段两种模型椎间盘髓核组织的变化.方法:将21只新西兰白兔随机分为器官组8只,节段组13只,处死后在无菌条件下分别取出椎间盘器官和脊柱运动节段各50个,在高渗培养基中进行整体培养(410 mOsm/kg),于培养前及培养后第3、7、14、21天,两组各取10个椎间盘分别进行HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化、蛋白多糖含量和髓核细胞活力测定.结果:培养21d器官组与培养14 d节段组HE染色示椎间盘组织结构基本保持完整,21 d节段组椎间盘组织形态学破坏;21d器官组与14d节段组Ⅱ型胶原免疫组化染色强度差异无统计学意义(P＞0.05),21 d节段组染色变浅,与之前各时间点及器官组相比差异有统计学意义(P＜0.05);蛋白多糖PAS/AB染色7d内两组强度无降低,14 d两组强度均有所减弱,21d节段组染色强度进一步减弱,改变比器官组更为明显;髓核细胞荧光检测两组7d时强度较培养前变化不明显(P＞0.05),21d器官组与14d节段组强度略有降低,但与之前时间点比较差异无统计学意义(P＞0.05),21d节段组髓核细胞荧光强度减弱,细胞活性降低,与之前各时间点及器官组比较差异明显(P＜0.05).结论:14d内脊柱运动节段可作为研究生物力学对椎间盘影响的离体实验模型.
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DegraPol支架上培养人气管软骨细胞体外合成组织工程软骨
目的 探讨以人气管软骨细胞(HTC)为种子细胞在新型生物材料DegraPol泡沫支架上体外合成组织工程气管软骨的可行性.方法 从肺移植供体(9例)取人气管软骨片段,胶原酶消化,将所获软骨细胞传代培养,将传代至6～8代的HTC种植到DegraPol支架上体外静态培养.种植前行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色.于体外静态培养第2小时末和第3、7、21、42天取HTC-DegraPol复合物用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性;培养3周后取HTC-DegraPol复合物制备组织学检测标本行阿辛蓝染色观察硫酸软骨素分泌情况,并制备扫描电镜标本观察HTC在DegraPol支架中培养后的超微结构.结果 HTC在传代培养中显示稳定的增殖活性并分泌Ⅱ型胶原.种植到DegraPol支架中后培养2 h和3、7、21、42 d时MTT法测定的A值分别为0.112±0.004、0.151±0.021、0.170±0.035、0.176±0.023和0.213±0.023(每个时点n=4).培养21、42 d与培养2h比较,活性HTC数量差异均有统计学意义(P＜0.05).阿辛蓝染色显示HTC-DegraPol复合物的基质分泌硫酸软骨素,证实HTC-DegraPol复合物具有软骨样结构.扫描电镜观察显示新生软骨在DegraPol材料表面和中央均有形成,但以表面为主.结论 HTC可以在体外良好扩增并以多孔生物材料DegraPol为支架体外合成组织工程气管软骨,但培养条件应进一步优化.
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缺血再灌注损伤对SD乳鼠器官型脑片神经再生的影响
目的 探讨缺血再灌注损伤对SD乳鼠器官型脑片中神经再生的影响.方法 制备P3 SD乳鼠的全脑器官型脑片,随机分为缺血再灌注组和正常对照组,观察脑片生长情况,培养3天后,两组再分别分为2个亚组,分别给予药物和空白干预,依次列为I组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组,通过倒置显微镜及免疫荧光染色观察各组脑片在1、3、7天的改变.结果 缺血再灌注组室下区、海马齿状回可见巢蛋白阳性新生细胞,而正常对照组未见新生细胞;药物干预后,两组均出现大量新生细胞,但正常对照组单位区域新生细胞数量多于缺血再灌注组(P<0.01);Ⅲ组较I、Ⅱ组明显增多(P<0.01),随着培养时间延长,两组新生细胞均向外迁移,上述区域新生细胞密度逐渐减少.结论 缺血再灌注损伤可以促进SD乳鼠器官型脑片神经再生,但同时也损伤了神经再生的潜能.
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大鼠颅骨体外培养矢状缝牵引成骨模型的建立
目的 探讨建立幼年SD大鼠颅骨器官体外培养矢状缝牵引成骨模型.方法 取19日龄的SD大鼠颅顶骨矢状缝组织块,随机分为对照组和实验组进行体外器官培养.实验组加力约3.92×10~(-3)N(0.4 g)力.对照组不加力.培养24 h结束时,进行大体观察及倒置显微镜下观察;并经苏木精-伊红染色后进行组织学观察.结果 大体观察及倒置显微镜下观察发现,实验组骨缝逐渐明显加宽,至加力24 h,所有标本矢状缝未见断裂.组织学观察发现,缝两侧区域为成骨活跃部位,两侧骨化前沿交错排列.缝内可见纤维结缔组织、成骨细胞、成纤维细胞及毛细血管,缝内组织与硬脑膜相连.对照组骨缝保持正常发育,未见明显变化,以成骨细胞为主.结论 大鼠颅骨骨缝器官可以在体外培养中成功存活并继续生长.
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靶向Wnt10b的小干扰RNA抑制胚胎皮肤毛囊发育的初步研究
目的 利用小干扰RNA(siRNA)抑制皮肤Wnt10b基因的表达,观察Wnt10b基因沉默能否抑制毛囊的发育并探讨其潜在机制.方法 化学合成siRNA-Wnt10b,将siRNA转染体外培养的胎鼠背部皮肤,荧光定量PCR检测转染后不同时间段皮肤组织Wnt10b和p-连环蛋白(β-catenin) mRNA的表达,Western blot检测转染后72 h皮肤组织的Wnt10b和β-catenin蛋白含量.将转染后72 h的皮肤组织石蜡包埋、切片,HE染色,镜下观察各组毛囊发育情况并做统计学处理.结果 siRNA-Wnt10b转染后的24、48 h,胎鼠背部皮肤Wnt10b mRNA的表达呈不同程度下降；但β-catenin mRNA表达未随Wnt10b mRNA水平的起伏而明显波动；转染后72 h,Wnt10b蛋白和β-catenin的蛋白表达同时减少,新形成毛囊数量也随之减少(t=3.254,P=0.002).结论 在体外器官培养的环境中,siRNA-Wnt10b能够抑制胎鼠背部皮肤组织Wnt10b蛋白的表达,减少新形成毛囊的数量；Wnt10b可能只在蛋白水平上调控细胞β-catenin的表达.
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体外培养小鼠耳蜗Corti器对庆大霉素的吸收
目的 观察庆大霉素-德州红耦联物在体外培养小鼠耳蜗Corti器的分布情况,比较不同时间庆大霉素吸收的差异.方法 分离小鼠耳蜗Corti器,体外培养,培养液中加有庆大霉素-德州红耦联物,分别于培养后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、3 d.4 d和7 d收集标本,荧光染色后行激光扫描共聚焦显微镜观察基底膜庆大霉素的分布情况.结果 小鼠耳蜗Corti器在培养3 h后即可见外毛细胞的纤毛和胞体两侧的胞膜有庆大霉素分布;随着培养时间的延长,庆大霉素在Corti器中的所有细胞均见分布,尤以外毛细胞明显,主要聚集在毛细胞顶端纤毛的下方;培养24 h后庆大霉素在外毛细胞的聚集达到高峰,而在支持细胞未见明显的聚集;体外培养7 d后在毛细胞胞质中仍可见庆大霉素分布.结论 小鼠Corti器体外培养可用来动态检测庆大霉素在耳蜗细胞的吸收和聚集情况.
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硫酸链霉素对体外培养大鼠前庭毛细胞的损害作用
目的 探讨硫酸链霉素对离体培养条件下大鼠前庭毛细胞的损害特征.方法 取出生后3～4 d的大鼠球囊斑和椭圆囊斑进行离体前庭器官培养,经培养过夜后再用不同浓度的硫酸链霉素培养液继续培养24 h.应用荧光标记的鬼笔环肽对前庭毛细胞的静纤毛和表皮板进行染色,同时应用Topro-3 DNA探针显示细胞核的形态,在激光共聚焦显微镜下计数和摄像.结果 在离体培养条件下,对照组前庭毛细胞生长良好,随着培养液中硫酸链霉素浓度的增加,毛细胞的密度逐渐降低.培养24 h后,0.25 mmol/L硫酸链霉素可造成大约10%的前庭毛细胞缺损,1 mmol/L硫酸链霉素损害的毛细胞数量在50%左右,3 mmol/L硫酸链霉素破坏的毛细胞数量超过75%.细胞核染色显示硫酸链霉索引起的前庭毛细胞损害伴随着细胞核浓缩或破碎现象.存活毛细胞的数量随着硫酸链霉素浓度的增加而减少,但前庭的支持细胞未发生明显病变.结论 在体外培养条件下,硫酸链霉素可引起剂量依赖性的大鼠前庭毛细胞缺失,其损伤机制可能与凋亡有关.
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硫酸链霉素引起的大鼠体外培养耳蜗毛细胞凋亡
目的 探讨在离体培养条件下硫酸链霉素是否通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的激活而导致大鼠耳蜗毛细胞凋亡.方法 将出生后3～4 d的大鼠耳蜗基底膜取出进行离体培养,培养过夜后用0.1 mmol/L硫酸链霉素培养液继续培养24 h.终止培养前1 h应用碳氧荧光素标记的肽荧光甲基酮(carboxyfluorescein labeled peptide fluoromethyl ketone,FAM-peptide-FMK)标记的caspase-6,caspase-8,或caspase-9指示剂作用1 h,然后应用异硫氰酸四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine iso-thiocyanate,TRITC)标记的鬼笔环肽(phalloidin)标记毛细胞的纤毛和表皮板,再应用Topro-3 DNA探针对细胞核进行染色,后在共聚焦显微镜下观察.结果 1 mmol/L硫酸链霉素引起的耳蜗毛细胞缺失在底回约为80%,在顶回约为20%.经链霉素作用后,耳蜗毛细胞的细胞核发生浓缩和碎裂,同时可见cmpase-6,caspase-8和caspase-9阳性表达.结论 硫酸链霉素可以引起离体培养的大鼠耳蜗毛细胞凋亡,上游和下游的caspase激活可能是其主要途径.
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Lgr5阳性干细胞在3D培养中形成类器官的研究进展
干细胞是人体中组织器官再生的基石,如何充分利用其多能性促进机体细胞、组织和器官的修复或再生是生物医学研究中长久以来的热点和重点.Lgr5阳性细胞是机体中具有多能性分化能力的干细胞样细胞之一,存在于小鼠或人类的多种器官或组织中.目前研究表明,单个或少量的Lgr5阳性干细胞可以在3D培养体系中生长形成多种类器官(organoid),这些类器官的某些生物学及生理学特性与其来源的器官类似或一致.这些实验拓宽了研究者的视野,同时也开辟了一种新的干细胞研究方向.对于内耳细胞再生研究来说,Lgr5阳性内耳干细胞正是近年来刚被证实的内耳多能性细胞群.如何从来源于Lgr5阳性干细胞的类器官研究中获得灵感或经验,对于内耳干细胞的研究具有前瞻性指导意义.本文将对Lgr5阳性干细胞在3D培养体系中形成类器官的相关研究进行综述,以期为类内耳器官的形成与应用提供新思路.
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利用器官培养方法观察磷酸钙骨水泥浸提液对成骨细胞的影响
目的 通过利用新生小鼠颅盖骨体外器官培养模型,观察磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)浸提液对成骨细胞的作用,为研究磷酸钙骨水泥的降解成骨机制提供依据.方法 剪取74只新生乳鼠两侧颅顶骨,分别培养于BGJb培养液(空白对照组)、BGJb培养液+浸提6h的磷酸钙骨水泥浸提液(实验1组)、BGJb培养液+浸提14 d的磷酸钙骨水泥浸提液(实验2组),通过甲基噻唑基四唑法、碱性磷酸酶活性检测和实时PCR检测钙、磷离子对细胞的体外增殖、碱性磷酸酶活性和骨钙蛋白表达的影响.结果 与空白对照组相应时间点相比,实验1组颅盖骨培养3、5、7、9d的细胞增殖能力持续增强(P＜0.05)(A值分别为0.563±0.047、0.932±0.065、1.325±0.139、1.395 ±0.108),培养3、7、10 d碱性磷酸酶活性[分别为(5.111 ±0.440)、(8.380±0.505)、(10.124±0.625) U/g prot]、骨钙蛋白表达(2-ΔΔCt值分别为4.41 ±0.52、21.24±2.17、31.84±3.51)持续增强(P＜0.05)；实验2组培养5、7、9d的细胞增殖能力降低(P＜0.05),培养7、10 d碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白表达降低(P＜0.05).结论 颅盖骨器官培养方法可作为磷酸钙骨水泥降解成骨机制的研究模型.
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离体血管器官培养方法及应用
器官培养是指从供体取得器官或器官组织块后,不进行组织分离,保持其原有器官的结构和连接,在体外移植和生长,在培养过程中,保持其形态及功能.与整体实验相比,器官培养具有条件恒定、因素单一、便于干预的优点.器官培养主要强调器官组织的相对完整性,重点观察在细胞正常联系及排列情况下,它们之间的相互影响及局部环境的生物调节作用.离体血管的器官培养为研究血管的发育、损伤、修复、再生、再狭窄提供了良好的模型[1].
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构建大鼠牙胚肾被膜下培养模型及其牙胚组织混合后的成牙能力
目的:通过取孕16 d的大鼠牙胚,植入同种异体大鼠肾被膜下,建立牙胚发育、形成的研究模型,人为干预发育中的牙胚,对比、观察该干预对牙胚发育、成牙能力的影响.方法:实验2004-04/08在解放军第四军医大学口腔组织工程中心实验室进行.①牙胚的获取:取孕16 d的SD胎鼠的下颌第一磨牙牙胚,随机取分离的磨牙胚4个样本,行常规组织学切片以确定牙胚发育期.其余牙胚分两组:正常组和混合组.混合组将组织剪成4小块,随意混合后组成一个混合牙胚,分别加入DMEM培养液置37℃孵箱中备用.②肾被膜下牙胚植入:取成年雄性SD大鼠10只,采用随机数字表法随机分为正常组和混合组,每组5只,于两组大鼠的肾被膜下分别植入上述两组牙胚.③8周时取植入物,常规进行大体及牙胚植入前、后组织学观察.结果:10只大鼠进入结果分析.①两组大鼠牙胚植入后大体观察:牙胚植入肾被膜下后可继续发育,8周时正常组形成类似于正常天然牙齿样的形态和组织结构,混合组则形成不完整的类牙样结构.②牙胚植入前及植入后组织学观察:植入前牙胚处于帽状发育期;植入后正常组形成类似于天然牙有序排列的组织结构;而混合组形成类牙样结构,与正常组有一定差别.结论:以肾被膜下为大鼠牙胚培养环境,成功建立了牙胚继续发育、牙齿形成的研究模型.该模型便于牙齿发育形成过程中人为干预的实施和观察.人为干扰后,牙胚能继续发育,形成类牙样结构.
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人牙胚组织在裸鼠肾囊膜培养模式下的成牙能力
背景:建立一种科学可靠、简便可行,既可以人为进行干预,又不会影响牙齿继续发育的体外培养模式对于了解人类牙齿发育的组织学特点至关重要.目的:将流产人胚胎12周的磨牙牙胚植入到裸鼠肾囊膜下培养.观察其成牙情况,建立人牙胚再生的培养模式.设计、时间及地点:细胞水平的动态观察实验,于2005-03/2006-12在福建师范大学生命科学学院和发育与神经生物学福建省高校重点实验室完成.材料:12周流产人胚胎由福州市第二人民医院妇产科提供,6～10周龄Blab/c裸鼠.方法:无菌条件下分离新鲜的12周流产人胚胎下颌,分离磨牙牙胚.将牙胚移植到裸鼠肾囊膜下分别培养4,8,12和16周,取移植块.主要观察指标:以苏木精-伊红染色和Azon法染色后进行形态学观察.结果:生长4周的人牙胚内,可以观察到造釉器和牙乳头的细胞发生形态改变,牙上皮细胞和间充质细胞开始极化,胞体变长形成前成釉质细胞和前成牙本质细胞.生长8周时,前成釉质细胞和前牙本质细胞的极化变得更加明显,细胞已变成高柱状,在未来牙尖区域可发现少量牙本质的形成.培养12同时,可见连续完整的牙本质.生长16周的人牙胚,已经形成连续完整的成釉质细胞,牙釉质、牙本质和成牙本质细胞层.结论:肾囊膜是入牙胚组织体外培养的良好模式.
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微器官培养技术及其在前列腺癌研究中的应用
前列腺癌(prostate cancer,PCa)居西方国家男性中发生率的首位,也是第二癌症致死原因[1].导致前列腺癌致死的主要临床原因是前列腺癌容易发生骨转移,骨转移的发生率占所有前列腺癌患者的80％以上[2,3].已有研究表明,前列腺癌骨转移与肿瘤细胞与微环境(microenvironment)的相互作用有关,骨组织的微环境富含细胞因子、生长因子、祖细胞和造血细胞等,组成了适合前列腺癌细胞转移的微环境,促进了肿瘤细胞的黏附、增殖、迁移以及存活[4].
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带黑素细胞的组织工程化表皮膜片移植治疗白癜风的初步临床研究
目的 评估体外培养含黑素细胞自体表皮膜片移植技术治疗稳定期白癜风的临床有效性和安全性.方法 18 ～ 65岁皮肤科门诊稳定期白癜风患者,切取患者3～ 7.5 cm2正常皮肤组织,根据Green方法进行表皮组织片培养,约3周角质形成细胞形成具有一定张力的表皮片组织,即进行手术移植;术后患处加压包扎,2周后拆线,术后进行随访,并用Wood灯分析色素恢复情况,记录复色情况及不良反应,评价治疗效果.结果 2012年2-12月共入组患者15例,年龄18～62岁,随访时间12～24个月,失访1例.15例白癜风患者中6例达到100％复色,且均为节段型白癜风,6例达到75％～ 100％复色.面颈部患者复色效果优于躯干部位.结论 体外培养含黑素细胞的自体组织工程化表皮膜片移植技术用于治疗稳定期白癜风的安全性、有效性都较高,值得临床应用.
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无血清人头皮体外组织培养的研究
目的 探讨用无血清培养基进行人头皮体外组织培养的可行性及培养头皮的结构和功能变化.方法 用元血清William E培养基进行人头皮气/液界面培养,用解剖显微镜检测毛发生长情况,HE染色法观察头皮组织结构变化,细胞毒性试剂盒检测培养上清液中的乳酸脱氢酶活性.结果 头部皮肤经过22天的无血清William E培养基体外器官型培养,仍保持结构的完整性.毛干生长的长度在无血清William E培养基显著高于含血清MEM培养基(P《0.05).无血清William E培养基组分别在培养第2天和第16天LDH活性出现两个峰,而含血清MEM培养基在第12天出现峰值.随着培养时间延长,毛囊渐由生长期转变为退行期和休止期.结论 这一器官型头皮培养模型可用于头部皮肤及毛囊的研究.
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甘草酸二铵对人毛囊生长作用及对Wnt/β连环蛋白信号通路的影响
目的 探讨甘草提取物甘草酸二铵对体外培养人毛囊生长的作用并检测Wnt/β连环蛋白信号通路相关分子的表达.方法 分别将体外分离人毛囊培养于0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L浓度的甘草酸二铵中10d,并设置不添加甘草酸二铵Williams E培养基组为对照组,显微镜下每日测量并记录其生长长度,观察毛囊形态改变并拍照.用免疫荧光评估毛母质细胞增殖情况及毛母质细胞中Wnt/β连环蛋白信号通路各主要分子β连环蛋白、GSK31β、p-GSK3β、Lef1表达情况.采用重复测量方差分析及单因素方差分析进行统计学分析.结果 重复测量方差分析显示,与对照组相比,仅0.01 μmol/L甘草酸二铵对毛囊生长的促进作用有统计学意义(P＜0.05),其余各组与对照组相比差异无统计学意义(均P＞ 0.05).与对照组相比,0.01μmol/L甘草酸二铵组毛囊进入退行期时间推迟,而其余各组与对照组相比均无明显变化.免疫荧光显示,与对照组相比,0.1、0.01、0.001 μmol/L浓度组毛母质细胞中ki67阳性细胞较多,而0.000 1 μmol/L浓度组无明显区别.单因素方差分析显示,β连环蛋白、p-GSK3β、Lef1在各组中的表达量差异有统计学意义(F=12.604、16.65、15.266,均P＜0.05),而GSK3β在各组中的表达差异无统计学意义(F=1.472,P＞0.05).LSD-t检验显示,与对照组相比,0.1、0.01、0.001 μmol/L浓度组毛母质细胞中β连环蛋白、p-GSK3β、Lef1表达量较多(均P＜0.05),而0.000 1 μmol/L浓度组与对照组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 0.01 μmol/L甘草酸二铵具有明显促进人毛囊生长的作用,可增强毛母质细胞增殖活性,延迟毛囊进入退行期,该作用可能与其激活Wnt/β连环蛋白信号通路相关.
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大鼠颅骨矢状缝牵引成骨的体外研究
目的:探讨建立幼年SD大鼠颅骨器官体外培养的方法,研究外源性张力对颅骨矢状缝成骨活动的影响.方法:取19日龄的SD大鼠颅顶骨矢状缝组织块,试验组加0.4 g力,对照组不加力.经器官培养后进行组织学观察和免疫组织化学检查,并检查胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)等mRNA的变化情况.结果:试验细骨缝内成骨细胞活跃,IGF-1阳性染色位于颅缝内成骨细胞,实验组IGF-1 mRNA表达量高于对照组. 结论:大鼠颅骨骨缝器官可在体外培养中成功存活并生长.外源机械张力可以扩宽骨缝,刺激成骨活动,可显著增加IGF-1的合成.
关键词： 颅缝 器官培养技术 胰岛素样生长因子-1 机械张力 -
建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化
目的:建立大鼠前庭器官的原代体外培养模型,并通过透射电镜观察前庭上皮细胞在佛波酯(PMA)作用前后的超微结构变化.方法:无菌条件下取出生2 d大鼠的椭圆囊上皮,体外培养1～7 d;从第2日开始用倒置显微镜观察、照相,试验组加入PMA 30 min,2 h和6 h,固定,透射电镜观察.结果:体外培养椭圆囊1 wk,12 h时可见成纤维细胞沿移植物边缘游出,2 d后内皮细胞聚集,呈铺路石样,透射电镜观察细胞无肿胀,胞膜、胞核完整,线粒体嵴无肿胀,纤毛无脱落;PMA各试验组细胞形态正常,核糖体密集,高尔基体较前发达,内质网轻度扩张.结论:大鼠前庭器官体外培养方法可行,为今后进一步研究提供了实验模型.
