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左归丸、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导的影响
目的:研究左归丸、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)成脂诱导的影响,并探讨其相关的作用机制.方法:将90只SD雌性大鼠,随机选取10只作为正常组,其余80只再随机选取10只经双侧腰背部切口切除卵巢周围少量脂肪组织作为假手术组,其余70只以相同切口切除双侧卵巢作为模型组,分别以正常组,假手术组,模型组,左归丸组(18.9 g·kg-1),右归丸组(20.52 g·kg-1),共同药组(15.12 g·kg-1),滋阴药组(12.96 g·kg-1),补阳药组(8.1 g·kg-1)和戊酸雌二醇片组(0.36 mg· kg-1)共9组,对BMSCs进行干预,流式细胞仪鉴定BMSCs,用油红O检测脂滴的形成;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测过氧化物酶体增殖物激活受体y(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ),脂蛋白脂肪酶(lipoprotein,LPL),脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4) mRNA的表达;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhaneer binding proteinβ,C/EBPβ)蛋白的表达.结果:与正常组比较,模型组BMSCs明显向脂肪细胞分化,PPARγ,LPL,FABP4 mRNA表达及C/EBPβ蛋白的表达明显升高(P＜0.05);与模型组比较,左归丸、右归丸及其拆方均可抑制BMSCs向脂肪细胞分化,其中右归丸组可明显下调PPARγ,LPL,FABP4 mRNA,降低C/EBPβ的蛋白的表达(P＜0.05).结论:左归丸、右归丸及其拆方均能抑制BMSCs的成脂分化,且右归丸抑制成脂分化的作用优于左归丸,以及补阳药及二者的共同药组.
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大鼠白色和棕色脂肪来源的间充质干细胞成脂分化特性的比较
目的 探讨白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)来源的间充质干细胞成脂分化特性的差异.方法 雄性SD大鼠15只,3只用于细胞分离培养,12只用于细胞移植.体外分离培养WAT和BAT两种来源的脂肪干细胞,用油红O染色检测两种干细胞的成脂分化率,用免疫荧光技术检测成脂诱导、分化后的细胞是棕色脂肪细胞还是白色脂肪细胞.4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记两种来源的于细胞后移植至腹股沟区,分别在第1、2、3周取材,免疫荧光技术检测植入细胞的分化趋向.结果 WAT来源的干细胞增殖速度明显快于BAT来源的干细胞,前者成脂分化率为0.205±0.069,后者为0.165 ±0.053,两种干细胞的成脂诱导率差异无统计学意义(P＞0.05).两种干细胞分别植入体内后,在第1、2、3周发现,两种干细胞均表达棕色脂肪特异性蛋白解耦联蛋白1(UCP1).结论 WAT和BAT来源的干细胞在体外及体内诱导成脂后均分化为棕色脂肪细胞.
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人滑膜间充质干细胞的分离培养与鉴定
背景：软骨一旦损伤将很难自我修复，组织工程学修复损伤软骨是目前的研究热点。组织工程学中找到合适的“种子细胞”至关重要。滑膜间充质干细胞（SMSCs）因较其他来源的间充质干细胞成软骨能力、增殖能力更强，且细胞容易获取、对机体损伤小等优点，越来越受到研究者的青睐。
目的：探讨人SMSCs体外分离、培养的方法与步骤，探索对SMSCs进行鉴定的新方法。
方法：关节镜下获取11例行关节镜手术患者的滑膜组织，按照Pei等[6]的方法分离培养滑膜干细胞；从细胞形态学观察、细胞生长曲线分析、CCK-8测定增殖活力、流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原、对SMSCs进行成脂/成骨/成软骨诱导、免疫细胞荧光染色以及RT-PCR检测成脂/成骨/成软骨相关基因的表达等方面对SMSCs进行鉴定。
结果与结论：按照Pei等的方法可以成功地从人滑膜组织中分离出干细胞，分离出的干细胞具有间充质干细胞特异性表型和多向分化潜能。 -
左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
目的 研究左、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs) PPARγ LPL、FABP4mRNA的影响.方法 分别以空白对照组(CON)、模型组(OVX)、假手术组(SHAM)、左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)、共同药组(GTY)、滋阴药组(ZYY)、补阳药组(BYY)和补佳乐组(BJL)共9组对BMSCs进行干预,MTT法检测各组BMSCs增殖情况;流式细胞仪鉴定BMSCs;用Q-PCR法检测过氧化物酶体增殖物激活受体y(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ,PPARγ),脂蛋白脂肪酶(lipoprotein,LPL),脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)mRNA的表达.结果 左、右归丸及其拆方均可显著下调BMSCs PPARγ、LPL、FABP4mRNA的表达,其中YGW组可显著下调PPA Rγ LPL、FABP4的mRNA(P＜0.05).结论 左、右归丸及其拆方均能抑制BMSCs的成脂分化,且“右归丸”抑制成脂分化的作用优于“左归丸”,以及纯阳药及二者的共同药组.
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重组人碱性成纤维细胞生长因子对人脂肪干细胞分化为脂肪细胞的影响
目的 探讨不同浓度重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibro-blast growth factor,rh-bFGF)对体外培养的人脂肪来源干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)诱导分化为脂肪细胞的影响,通过实验寻找促进hASCs向脂肪细胞转化的佳浓度.方法 取健康脂肪抽吸者脂肪混悬液进行分离提取hASCs,进行hASCs的培养、鉴定和成脂诱导分化,并在成脂诱导的细胞中分别加入0 ng/ml rh-bFGF作为对照组,加入10、20、40 ng/ml外源性rh-bFGF作为实验组.MTT比色法检测成脂细胞的增殖速率,油红O染色定性分析新形成脂肪细胞的时间,利用Western印迹法检测成熟脂滴表面标记蛋白CIDEC的表达.结果 添加40ng/mlrh-bFGF的脂滴形成平均时间为(11.5±1.9)h,检测细胞增殖的吸光度值平均为0.52±0.10,10、20、40 ng/mlrh-bFGF对细胞的增殖均有促进作用,尤以40ng/ml浓度为明显,40ng/mlrh-bFGF成熟脂滴表面蛋白CIDEC的表达量高于其他组.结论 在hASCs成脂诱导剂中添加rh-bFGF能有效促进成脂细胞的增殖速率,加速hASCs向脂肪细胞的分化,其中以40ng/ml rh-bFGF为佳浓度.
关键词： 人脂肪来源干细胞 重组人碱性成纤维细胞生长因子 脂肪细胞 成脂诱导 -
脂肪干细胞的分离提取、鉴定及与脂肪颗粒的混合移植研究
目的 分离提取脂肪干细胞(ADSCs),对其进行成脂、成骨的鉴定,并与脂肪颗粒混合移植,观察移植后的脂肪组织的存活情况.方法 取大鼠腹股沟脂肪,磷酸盐缓冲液清洗,0.1％Ⅰ型胶原酶37℃消化1h,离心,取沉淀,用含10％血清的DMEM培养基进行培养、传代,取第3代ADSCs用于成脂、成骨鉴定;另取第3代ADSCs用于移植,分为两组:ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组、脂肪颗粒1.5 mL组,分别移植于大鼠背部两侧,共移植24只大鼠,分别于2周、l、3个月时脱颈椎处死8只大鼠,再取出背部脂肪组织.结果 大鼠AD-SCs成脂、成骨诱导后,经油红O、茜素红染色呈阳性,移植2周、1个月时,两组取出的脂肪组织的体积变化不大;但移植3个月后,取背部脂肪组织,称重:脂肪颗粒1.5 mL组平均重量为(0.4551±0.0024)g,而ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组的平均重量为(0.7798±0.0033)g,两组脂肪组织的重量差异有统计学意义(P＜0.05).结论 原代分离、培养的ADSCs生长状况良好,具有向成脂、成骨分化的能力,与脂肪颗粒混合移植后组织的存活率高,并能够改善脂肪颗粒单独移植时的液化吸收情况.
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树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导
目的：探讨树鼩骨髓间充质干细胞（ BM-MSCs）的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化，倒置相差显微镜进行形态学观察。用成脂诱导液（ DMEM/F12＋10％FBS＋100 U/mL青霉素＋100μg/mL链霉素＋1.0μmol/L地塞米松＋0.2 mmol/L吲哚美辛＋0.01 mg/mL胰岛素＋0.5 mmol/L IBMX）和成骨诱导液（高糖DMEM＋10％FBS＋100 U/mL青霉素＋100μg/mL链霉素＋50 ng/mL BMP-2）对分离的树鼩BM-MSCs分别定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果原代和传代细胞为梭形或三角形，可增殖形成克隆。 BM-MSCs成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴，成骨诱导后茜素红染色可观察到矿化结节。结论密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养树鼩BM-MSCs简便可行，获得的BM-MSCs可体外诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。
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两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞向脂肪细胞分化的比较
目的 比较两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)的成脂分化能力,探寻更为适宜的ADSC成脂诱导方案.方法 提取3例临床患者的脂肪干细胞(hADSCs)及出生6周大鼠的脂肪干细胞(rADSCs),将hADSCs、rADSCs分别接种于六孔板,分为未诱导组、成脂诱导Ⅰ组和Ⅱ组,分别使用普通培养基、成脂诱导培养基Ⅰ和Ⅱ,培养10 d后以油红O染色,镜下观察及检测490 nm吸光度值(A490),比较脂滴形成情况.结果 未诱导的hADSCs和rADSCs均呈成纤维细胞样生长,成脂诱导培养3d后出现脂滴;油红O染色显示,成脂诱导组脂滴呈橘红色,hADSCs和rADSCs的成脂诱导Ⅱ组形成的脂滴均明显大于诱导Ⅰ组,统计学分析显示hADSCs的成脂诱导Ⅱ组测得的A490明显高于诱导Ⅰ组(P＜0.01);而两组的rADSCs的A490无明显差异(P＞0.05).结论 hADSCs和rADSCs在两种诱导培养基中均可成脂分化,但成脂诱导Ⅱ组优予成脂诱导Ⅰ组.
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全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性
背景：饲养层细胞多数利用丝裂霉素C来处理，虽丝裂霉素C抑制了细胞增殖，但是细胞仍处于有分泌功能的活性状态，能够分泌不同的细胞因子。而骨髓中的非间充质骨髓细胞和血浆中的各种分泌因子，保持间充质细胞生长的微环境，提高间充质干细胞的产量。
目的：探究全骨髓培养法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。
方法：采用全骨髓贴壁法纯化扩增C57小鼠的骨髓间充质干细胞，检测细胞增殖的动力学变化、细胞表面的免疫标志物、多向分化的潜能及细胞周期的变化。
结果与结论：全骨髓培养法获得的小鼠骨髓间充质干细胞具有黏附于塑料培养器皿的能力，流式细胞仪检测表达CD45，CD105和Sca-1，不表达CD34，CD133和C-kit等间充质干细胞的表面标记特征；细胞倍增时间(57.11±1.5) h；诱导后具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力；细胞周期分析表明64%的细胞处于G 0-G 1期。提示全骨髓培养法获取的C57小鼠骨髓间充质细胞具有间充质干细胞的生物学特征。 -
全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势
背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低，体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞，对进一步研究至关重要。
目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。
方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞，进行形态学观察，流式细胞仪检测细胞标记物表达，分别进行成骨、成脂诱导分化。
结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓间充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样；表达CD29、CD90，不表达CD45；成骨、成脂诱导分化后，茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小，可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。 -
人羊膜间充质干细胞体外大量扩增的方法
背景：一个胎盘羊膜的面积约600 cm2，羊膜来源间充质干细胞即取材于胎盘上的羊膜。
目的：建立一种简单的体外分离培养人羊膜来源间充质干细胞的方法，并分析其生物学特性。
方法：采用胰酶和直接贴壁相结合的方法分离获取人羊膜来源间充质干细胞并进行体外培养，观察细胞形态，分析传代第5代细胞生长曲线，检测第5代细胞表面标志表达和检测细胞周期。取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导，冻存第4代细胞6个月后复苏，计数复苏后细胞存活率并绘制复苏细胞生长曲线。
结果与结论：原代接种后第9天有少许细胞爬出，15 d左右细胞达80%-90%融合，细胞以梭形为主。细胞传代后，细胞形态均一，螺旋状排列。传代细胞潜伏期48 h，对数增殖期4 d左右，对数增殖期后进入平台期。间充质干细胞表面CD34、CD14、CD19、CD45、HLA-DR 呈阴性表达，CD73、CD105、CD90呈阳性表达。茜素红染色及油红O染色阳性，证实具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力。流式细胞术细胞周期检测，S期占28%。冻存复苏后细胞存活率达90%以上，且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性。结果证实实验成功地建立了一种简化的人羊膜来源间充质干细胞大量扩增的方法。 -
脂肪源性干细胞的体外分离培养与鉴定
背景：脂肪间充质干细胞来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的潜能，有望成为组织工程的种子细胞。
目的：体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞并进行鉴定。
方法：取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪组织，0.075%I型胶原酶消化分离、培养脂肪源性干细胞，倒置相差显微镜下观察脂肪源性干细胞的细胞形态和增殖特征。取第3代细胞用 MTT 比色法描绘生长曲线，免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44，含有体积分数10%胎牛血清、地塞米松和胰岛素的 DMEM/F12定向诱导成脂分化，油红“O”染色成脂分化鉴定。免疫组化法鉴定向神经细胞诱导分化的结果。
结果与结论：分离出的大鼠脂肪源性干细胞生长曲线呈“S”形，强烈表达干细胞标志物CD44。成脂诱导分化经油红“O”染色呈橘红色。向神经细胞诱导分化后表达神经元标志物神经元特异性烯醇化酶。说明SD大鼠脂肪源性干细胞在体外具有易于分离培养和扩增，表达间充质干细胞相关表型，特定条件下可诱导分化的特点。 -
组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞
背景：研究显示兔脂肪干细胞的体外分离方法大多数为Ⅰ型胶原酶消化法，采用组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞尚不多见。
目的：采用组织块贴壁法从兔脂肪组织中分离培养兔脂肪干细胞，并进行成脂、成骨的诱导分化。
方法：采用组织块贴壁法分离出兔脂肪干细胞，进行体外培养，观察其形态特征。取对数生长期的第3代细胞，用MTT法绘制其生长曲线；流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况；分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化，油红O、茜素红染色定性鉴定。
结果与结论：体外培养的兔脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态，生长力旺盛。流式细胞术分析结果显示，第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD29，CD44，阴性表达CD45。兔脂肪干细胞经成脂诱导14 d后，油红O染色阳性；成骨诱导培养14 d后，茜素红染色阳性。提示组织块贴壁法可以分离培养出兔脂肪干细胞。 -
分离与鉴定人脂肪间充质干细胞来源的外泌体
背景:脂肪间充质干细胞是重要的种子细胞之一,可通过较简单的方法大量提取,但其储存条件较苛刻,运输不便,临床应用较困难.外泌体可由脂肪间充质干细胞分泌,其结构稳定,不易分解,为脂肪间充质干细胞在临床应用提供了新的可能性.目的:提取人脂肪间充质干细胞,鉴定脂肪间充质干细胞,诱导脂肪间充质干细胞多向分化,提取脂肪间充质干细胞来源的外泌体,鉴定脂肪间充质干细胞来源的外泌体.方法:收集青岛大学附属医院医学美容中心的正常成年女性行吸脂术后腹部浅层皮下脂肪组织,用酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞进行原代培养,用细胞贴壁法纯化,胰酶消化传代.选取第3代细胞分别行流式细胞学鉴定,成脂肪细胞诱导与鉴定;成骨细胞诱导与鉴定.取第3-6代脂肪间充质干细胞,收集细胞上清液,差速离心法提取外泌体,BCA法测定蛋白浓度,透射电镜观察外泌体形态,粒度仪测外泌体直径分布,免疫磁珠法和流式细胞学鉴定.结果与结论:①脂肪间充质干细胞形态为长梭形,形似成纤维细胞,排列紧密时呈巢状;②流式细胞学检测显示CD29,CD44,CD90及CD105均为阳性表达,CD34和CD45为阴性表达;③成骨细胞诱导至第9天碱性磷酸酶染色为蓝紫色,诱导至21 d时,茜素红S染色可见细胞外基质内出现红色钙结节;④成脂肪细胞诱导14 d后油红O染色呈橘红色;⑤透射电镜显示外泌体结构为杯状,直径为(81.225±22.226)nm,有膜结构.蛋白浓度约为1.5 g/L,直径分布集中于70-100 nm,外泌体流式细胞学显示CD9,CD29,CD44,CD63,CD90和CD105为阳性表达,CD34和CD45为阴性表达;⑥结果证实,人脂肪间充质干细胞来源的外泌体能通过超速离心法顺利提取,并通过透射电子显微镜、免疫磁珠法和流式细胞学检测相结合的方法成功鉴定.
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维甲酸和睾酮单独与联合诱导脂肪源干细胞周期的变化
背景：目前关于维甲酸对干细胞增殖作用的研究较少见，对睾酮的研究主要集中于其抑制细胞衰老的作用方面。目的：探索维甲酸和睾酮单独和联合诱导对脂肪源干细胞细胞周期的影响。方法：分离培养2月龄SD雌性大鼠脂肪源干细胞，传至第3代进行成脂、成骨诱导和表面标记鉴定。将其分为6组：①对照组。②10-5 mol/L 维甲酸组。③10-6 mol/L 维甲酸组。④10-5 mol/L维甲酸+睾酮组。⑤10-6 mol/L维甲酸+睾酮组。⑥睾酮组。对照组应用DMEM+体积分数10%胎牛血清培养液，其余各组均在对照组的基础上加相应剂量维甲酸或睾酮或二者联合诱导剂。各组培养36 h后行流式细胞仪检测各细胞分期的变化。结果与结论：与对照组相比，10-5 mol/L 维甲酸组和10-6 mol/L 维甲酸组G 1期细胞数比例明显升高，S期细胞数比例明显降低。与对照组相比，睾酮组G 1期细胞数比例明显下降，S期细胞数比例为明显上升。10-5 mol/L维甲酸+睾酮组与10-5 mol/L 维甲酸组比较，10-6 mol/L维甲酸+睾酮组与10-6 mol/L 维甲酸组比较，G 1期细胞数比例有所下降，S期细胞数比例为明显上升。结果表明，维甲酸可将脂肪源干细胞周期阻滞于G 1期，延缓细胞周期由G1期向S期的进程；睾酮可加速脂肪源干细胞周期由G1期向S期的进程；联合诱导可加速脂肪源干细胞的细胞周期由G1期向S期的进程。
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3种人类间充质干细胞体外增殖能力和成脂能力的比较
目的：从人足月胎儿的脐带组织和胎盘组织中分离、培养间充质干细胞（MSCs），观察人脐带组织MSCs （UC-MSCs）、胎盘组织 MSCs （PL-MSCs）和胚胎组织 MSCs （FT-MSCs）体外增殖能力和成脂分化潜能，为干细胞进一步应用于临床提供实验依据。方法：无菌条件下获取人足月胎儿脐带组织和胎盘组织，通过Ⅰ型胶原酶酶解法分离出 UC-MSCs 和 PL-MSCs， FT-MSCs 由中科生物工程有限公司提供，取第3或4代MSCs进行检测。倒置显微镜观察细胞形态；活细胞计数法检测细胞增殖能力；流式细胞术测定 UC-MSCs、PL-MSCs和 FT-MSCs细胞周期并鉴定细胞表面标志物的表达阳性率。取3种组织来源的第3代 MSCs进行成脂诱导，诱导18 d进行油红 O染色，观察并比较3种不同组织来源 MSCs的成脂能力。结果：从3种不同组织中均可获取梭形贴壁的 MSCs，表面标记物 CD44、CD73、CD90和 CD105均呈阳性表达，CD14、CD34和 CD45均为阴性表达；FT-MSCs 增殖能力明显强于 UC-MSCs 和 PL-MSCs （P＜0.01）， FT-MSCs、UC-MSCs 和PL-MSCs的增殖指数（PI）分别为（36.66±1.30）％、（18.23±1.10）％和（10.03±1.20）％，3种 MSCs的 PI比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。3种 MSCs 经过成脂诱导液诱导后，油红 O 染色结果均为阳性，但是UC-MSCs体外成脂能力（油红 O染色阳性率）明显强于 FT-MSCs和 PL-MSCs （P＜0.01）。结论：3种不同组织来源 MSCs在形态和细胞表面标记物等方面相似， FT-MSCs具有更强的增殖能力和增殖活性， UC-MSCs具有更强的体外成脂潜能。
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补骨脂素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的影响
目的:探讨补骨脂素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的影响及其可能机制.方法:选取3月龄无特定病原体级健康雌性SD大鼠25只,通过切除卵巢建立绝经大鼠模型.6周后,通过全骨髓贴壁法分离BMSCs并进行原代和传代培养,传至3代后进行成骨和成脂诱导,并按补骨脂素浓度梯度0、5、10、15、20 μmol/L进行处理.细胞增殖2周后,通过碱性磷酸酶(ALP)染色实验和油红O染色观察BMSCs成骨和成脂的分化,应用蛋白免疫印迹法测定核心结合蛋白因子RUNX2、骨钙素(OCN)、增强子结合蛋白β(C/EBP-β)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达.结果:成骨诱导BMSCs在补骨脂素的作用下ALP染色呈阳性反应,且补骨脂素的浓度为15 μmol/L时阳性反应强.RUNX2、OCN蛋白的表达随着补骨脂素浓度的升高而升高,差异具有统计学意义(P＜0.05).与空白组比较,成脂诱导BMSCs在补骨脂素的作用下油红O染色阳性反应程度出现下降,补骨脂素浓度为20 μmol/L时,油红O染色阳性率低.C/EBP-β、PPAR-y蛋白的表达均随着补骨脂素浓度的升高而降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:补骨脂素体外可增强BMSCs成骨分化作及抑制BMSCs成脂分化,可能与其调节RUNX2、OCN、C/EBP-β和PPAR-γ蛋白的表达有关.
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大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究
目的:建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,并探讨获得的脂肪干细胞的部分生物学特性.方法:取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪,I型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞,接种至含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养并适时传代,每日在倒置显微镜下观察记录细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验.第3代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化,进行Von Kossa染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化,进行油红O染色.结果:从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞,其在体外生长增殖迅速,呈成纤维样细胞生长.生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力强,可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下,表现出成骨细胞特性,Von Kossa染色出现矿化结节;在.IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、吲哚美辛、胰岛素的诱导下,表现出脂肪细胞特性,油红O染色后发现胞浆内有脂肪滴.脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后,其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低.结论:成功建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛,具有多向分化能力,可以方便地保存,有望作为细胞治疗和组织工程的种子细胞.在分离大鼠的脂肪干细胞时,NH4Cl裂解红细胞这一步可以省略,地塞米松在成脂诱导过程中不是必需的.
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人牙周膜干细胞的成脂诱导实验研究
目的 体外分离培养成人的牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSC),并进行成脂诱导实验.方法 取新鲜拔除正畸牙的牙周膜为材料制成组织块,加入培养液分离培养,免疫磁珠法筛选人牙周膜干细胞,加入成脂诱导液诱导牙周膜干细胞向脂肪细胞转化.结果 成功筛选人牙周膜干细胞,成脂诱导成功.结论 免疫磁珠法是筛选人牙周膜干细胞的有效方法,人牙周膜干细胞可以向脂肪细胞分化.
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大鼠毛囊干细胞的成骨及成脂诱导
目的：毛囊干细胞在体外培养下可向软骨、骨骼、脂肪等细胞分化。文中研究毛囊干细胞的培养方法及其成脂和成骨分化的能力。方法采用显微分离技术联合两步酶消化法获得毛囊干细胞，差速贴壁法对毛囊干细胞进行提纯，利用体积分数10％胎牛血清的角质细胞无血清培养基进行培养，应用流式技术对干细胞进行CD34、β1整合素、CK15检测。第3代毛囊干细胞分别使用成骨及成脂诱导液进行培养。结果培养后的毛囊干细胞形态均匀一致，折光性强，呈典型的“铺路石”状，流式细胞仪检测CD34、β1整合素、CK15分别表达为59．6％、97．2％、61．1％，第3代细胞生长曲线显示细胞生长情况良好。经成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节形成，成脂诱导14 d后油红O染色后可见脂滴形成。结论培养的毛囊干细胞具有很强的生长活性，并具有多向分化的潜能。
