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不同产地野生滇龙胆中主要裂环烯醚萜类成分的含量比较
目的:采用高效液相色谱法测定不同产地野生滇龙胆中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷及獐牙菜苷的含量.方法:岛津Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相甲醇-水(30∶70),流速1.0 mL·min-1,龙胆苦苷检测波长270 nm,獐牙菜苦苷及獐牙菜苷检测波长245 nm,柱温25℃.结果:龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷的线性范围为0.4～2 mg·L-1;相关系数分别为0.999 7,0.999 6,0.998 7;回收率分别为100.04%(RSD 1.49%),98.48%(RSD 1.67%),98.46%(RSD 1.15%)结论:用本法测定不同产地野生滇龙胆中3种成分含量,方法可行,结果可靠,为野生滇龙胆资源的开发与利用提供资料.
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UAE-IC法测定滇龙胆中5种阴离子
目的:建立了超声波辅助提取(UAE)-离子色谱(IC)法测定中药滇龙胆中F-,Cl-,NO2-,NO3-,PO43- 5种阴离子含量的方法.方法:分别研究进样量、淋洗液配比、流速和温度等对5种离子分离效果的影响,同时考察去离子水和NaOH溶液(3.0 mmol·L-1)不同提取时间对5种离子提取率的影响.结果:进样量100μL,淋洗液Na2CO3+NaHCO3(3.50 mmol·L-1+1.0 mmol·L-1),流速1.2 mL·min-1,柱温30℃时,检出限在0.0976～1.098 4 mg·L-1;F-,Cl-,NO2-,NO3-,PO43- 5种离子线性范围分别为2～25 mg·L-1,2～20mg·L-1,2～100mg·L-1,10～55 mg·L-1,40～100mg·L-1;峰高RSD分别为0.98%,1.20%,0.77%,0.87%,2.26%;峰面积RSD分别为0.58%,1.27%,0.73%,0.92%,2.33%.采用NaOH(3.0mmol·L-1)提取30 min,10000 r·min-1离心20 min,0.45μm滤膜过滤处理;F-,Cl-,NO3-,PO43- 等4种离子加标回收率分别为110.38%,106.18%,96.47%,117.23%,NO2-未检出.结论:测定中药滇龙胆不同部位中5种阴离子含量的方法可行,结果可信.
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滇龙胆化学成分和药理作用研究进展
滇龙胆Gentiana rigescens为传统中草药,主产于中国云南、四川等地,具有悠久的药用历史,作为民间重要药物使用并记载.滇龙胆为龙胆科Gentianaceae多年生草本植物,主要化学成分为环烯醚萜苷类、三萜类、木脂素类、黄酮类、生物碱类、苯甲酸酯类和其他类化学成分,其主要药理作用包括保肝、利胆、镇痛、抗炎、抗氧化、促神经活化等.该文对滇龙胆中化学成分及其药理活性进行归纳总结,为滇龙胆的进一步开发和利用提供参考.
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磷对滇龙胆漂浮育苗幼苗生长和生理特性的影响
目的:以滇龙胆成熟种子为试验材料,探讨磷对滇龙胆种子漂浮育苗幼苗生长和生理特性的影响.方法:以珍珠岩、蛭石、草炭等混合成育苗基质,采用漂浮育苗法及植物生理学实验方法研究磷对滇龙胆种子漂浮育苗幼苗生长和生理特性的影响.结果:对滇龙胆漂浮育苗幼苗进行适宜浓度的施磷处理,不仅滇龙胆幼苗株高、根长、茎叶干质量、根干质量(P＜0.01)极显著高于未施磷处理,而且叶片中叶绿素含量、硝酸还原酶(NR)活性和根系活力极显著高于未施磷处理(P＜0.01).结论:探明磷对滇龙胆漂浮育苗幼苗植物学性状和生理特性的影响,滇龙胆漂浮育苗营养液中磷质量浓度以50 ～ 100mg·L-1为佳.
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滇龙胆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因克隆、表达及分析
目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoAreductase,HMGR)基因的cDNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析.方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因cDNA全长.构建pEASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达.利用生物信息学方法分析克隆到的cDNA序列并预测结构和功能.采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况.结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR cDNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR cDNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2.SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白.Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系为相近.结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上.HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量高的是叶.结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础.
关键词： 滇龙胆 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 基因克隆 原核表达 生物信息学分析 -
滇龙胆主要农艺性状的相关及通径分析
目的:研究滇龙胆植株根部产量与各农艺性状间的相关性,为滇龙胆优良种源的筛选及培育提供重要参考依据.方法:以云南26个野生种群的滇龙胆种质资源为研究对象,对其12个性状(根粗、根长、根数、根干重、茎粗、株高、一级分枝数、叶长、叶宽、叶长宽比、花萼长、花萼裂数)进行相关性、多元回归及通径分析.结果:相关性分析表明,地上部分多个 性状均与根长、根粗、根数、根干重有显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)的正相关.多元逐步回归分析表明,根粗、根长、根数、株高、分枝数及花萼裂数是影响根干重的主要因子.通径分析结果表明,根粗、根长、根数对根干重的直接正影响较大.地上性状中,株高、一级分枝数对根干重直接正影响较大.结论:在实际生产及良种选育过程中,应关注植株较高大、主茎粗壮、一级分枝数多,植株呈丛生状的材料.
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基于数据融合和多指标定量对滇龙胆产地鉴别和质量评价
中药次生代谢产物积累和产地密切相关,产地鉴别以及多指标评价对保证药材质量具有重要意义.该实验采用高效液相色谱(HPLC)与傅里叶变换红外光谱(FTIR)数据融合结合偏小二乘判别分析对滇龙胆进行产地鉴别,辅以多指标成分含量分析,以期为滇龙胆药材建立一种全面准确的鉴别和质量评价方法,为滇龙胆佳产区筛选提供参考.采集云南、四川、广西、贵州共169份样品的FTIR和HPLC指纹图谱,并对FTIR进行多元散射校正、标准正态变量(SNV)、Savitzky-Golay(SG)卷积求导等预处理;比较FTIR,HPLC及低级、中级数据融合鉴别效果;利用HPLC分析样品中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、马钱苷酸与当药苷含量.结果发现,不同产地滇龙胆FTIR图谱存在差异,佳预处理为SNV+ SG求导(二阶求导,窗口参数为15,多项式次数为2次).低级、中级数据融合预测集正确率为96.43％,高于FTIR,HPLC预测集正确率94.64％;低级数据融合训练集正确率为100％,优于中级数据融合99.12％.云南滇龙胆4种环烯醚萜苷含量均高于其他省份,其中药典指标性成分龙胆苦苷平均质量分数为47.40 mg·g-1,大值达到79.83 mg·g-1,且龙胆苦苷、马钱苷酸与当药苷含量同其他省份含量差异显著(P＜0.05).云南省不同地区滇龙胆4种环烯醚萜苷总含量比较发现,大理洱源、丽江玉龙较高,分别为68.59,66.68mg·g-1,同楚雄武定、玉溪澄江、昆明寻甸(52.99,52.29,46.71 mg·g-1)差异显著(P＜0.05),可作为滇龙胆栽培和优良种质资源筛选的参考地.FTIR-HPLC数据融合定性分析结合HPLC定量分析方法为不同产地滇龙胆鉴别和质量评价提供一种全面准确的新思路,为滇龙胆资源开发与利用提供科学依据.
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滇龙胆种子萌发特性研究
目的:研究不同温度、不同光照、不同贮藏方式和贮藏时间以及不同赤霉素浓度处理对滇龙胆种子萌发的影响.方法:观测滇龙胆种子在不同处理条件下的发芽率.结果和结论:25℃为种子适宜萌发温度,发芽率可达76.33%.光照对种子萌发影响显著,黑暗条件下种子发芽率极低.在自然条件下,干藏为种子佳贮藏方式,可促进种子后熟作用,保持种子活力,但不能超过6个月.100～1000mg·L-1赤霉素处理可明显缩短滇龙胆种子萌发时间,其中500mg·L-1赤霉素处理可使种子发芽率提高至95.00%.
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林药复合栽培滇龙胆HPLC指纹图谱计量特征与质量评价
目的 建立不同栽培模式滇龙胆的HPLC指纹图谱,对马钱苷酸,獐牙菜苦苷,龙胆苦苷和当药苷进行定性、定量分析;结合化学计量学对林药复合栽培滇龙胆资源进行评价.方法 色谱柱为岛津Shim-pack VP-ODS液相色谱柱(4.6 mm×150mm,5μm),流动相:0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B),梯度洗脱,流速1.00 mL·min-1,柱温30℃,检测波长241nm,进样量10 μL.化学计量学分析方法包括:系统聚类分析、偏小二乘判别分析和变量投影重要性准则.结果 龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、当药苷和马钱苷酸在10 ～4 000 μg·mL-1内线性良好,相关系数为0.999 2～0.999 9;4种化学成分精密度的RSD分别为0.87％,2.1％,0.90％和2.4％;重复性实验的RSD分别为0.97％,1.9％,2.0％和2.2％;稳定性实验的RSD均小于2.2％;加样回收率在97.12％～103.81％之间,RSD在0.71％ ～2.0％之间.指纹图谱相似性分析显示多数样品相似性系数大于0.970,不同栽培模式的70份样品化学成分种类相似,含量有明显变化;栽培药材龙胆苦苷＞獐牙菜苦苷＞马钱苷酸＞当药苷,龙胆苦苷计量特征与其余3种活性成分差别较大.滇龙胆与尼泊尔桤木复合栽培模式下,药材4种化学成分总合量高;与核桃树复合栽培有利于马钱苷酸的积累,与桉树复合栽培有利于獐牙菜苦苷的积累,与杉木复合栽培有利于当药苷的积累.以上结果表明,针对不同化学成分,应有多种佳栽培模式.偏小二乘判别分析和变量投影重要性准则研究显示,龙胆苦苷(VIP=1.513),獐牙菜苦苷(VIP=1.208)和保留时间在10 min后的化学成分对药材栽培模式的区分具有显著贡献.结论 HPLC指纹图谱结合化学计量学可为滇龙胆林药复合栽培佳模式的选择及质量控制提供方法和理论依据.
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滇龙胆不同居群间品质评价及质量等同性的研究
目的 建立滇龙胆不同居群间品质评价及质量等同性的研究方法.方法 采用高效液相色谱法测定滇龙胆根中活性成分龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷含量,建立其HPLC指纹图谱,并用单因素方差分析、聚类分析和主成分分析对其品质及质量等同性进行评价.结果 大理白族自治州滇龙胆不同居群间整体品质较好,龙胆苦苷含量较低的巍山居群龙胆的龙胆苦苷含量是国家标准的2倍以上,滇龙胆不同居群间根中龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷含量(P＜0.01)具有极显著差异;对不同居群间质量等同性进行分析,确定HPLC指纹图谱中11个共有峰,共有峰HPLC指纹图谱相似度均在0.988以上,指认其中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷3个与活性相关的特征峰,不同居群间质量等同性基本一致;不同居群间龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷总含量聚类分析和HPLC指纹图谱主成分分析结果相似.结论 根据有效成分含量及HPLC指纹图谱得出优质种质资源居群为剑川、鹤庆居群;建立滇龙胆不同居群间品质评价及质量等同性的研究方法,为从滇龙胆野生居群中进一步筛选优质种质资源提供理论依据.
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滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析与原核表达
目的 从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆萜类合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR,进行序列分析和原核表达.方法 根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrDXR开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR,转入大肠杆菌Rosetta (DE3)中,在IPTG诱导下进行表达.结果 GrDXR ORF全长1 425 bp,编码474个氨基酸.序列分析表明,GrDXR基因是DXR家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrDXR与萝芙木RvDXR、橡胶树HbDXR和长春花CrDXR亲缘关系较近.构建pGEX-4T-1-GrDXR重组质粒,获得稳定的原核表达体系.SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致.结论 克隆了GrDXR基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础.
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滇龙胆不同部位提取物保肝抗炎作用的研究
目的 比较滇龙胆根、茎、叶、花4个部位提取物的保肝抗炎作用.方法 用刀豆蛋白A致小鼠免疫性肝损伤模型比较滇龙胆4个部位提取物的保肝作用;用二甲苯致小鼠耳肿胀模型比较它们的抗炎作用.结果 滇龙胆各部位提取物能剂量依赖性地降低刀豆蛋白A致肝损伤小鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性,减少其肝指数,减轻肝组织损伤,且叶和根的药效要优于茎和花;滇龙胆各部位提取物能剂量依赖性地减轻二甲苯致炎小鼠的耳肿胀程度,且叶和茎的抑制作用要优于花和根.结论 滇龙胆根和叶提取物有较好的保肝作用,叶和茎提取物有较好的抗炎作用.
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LC-MS/MS法同时测定滇龙胆中4种苯甲酸酯类成分
目的 建立LC-MS/MS法同时测定滇龙胆中抗老年痴呆的4种主要成分gentiside A,gentiside J,gentiside B,gentiside K的量.方法 使用岛津LC-MS/MS 8030液质联用仪,色谱柱为Shim-pack XR-ODS Ⅲ(75 mm×2.0 mm,1.6 μm);流动相为甲醇-0.1％甲酸,等度洗脱;离子源为电喷雾电离源(ESI),采用负离子多反应监测模式.结果 Gentiside A,gentiside J,gentiside B,gentiside K分别在39.0～444.4μg/mL、39.0 ～ 444.4μg/mL、59.0 ～444.4μg/mL、26.0 ～444.4 μg/mL范围内线性关系良好,相关系数为0.998 9～0.999 6;所测的滇龙胆根部中,4种苯甲酸酯类成分的含有量分别为0.284、0.358、0.654、0.267 mg/g;加样回收率为98.1％～102.6％,RSD为0.7％ ～1.7％.结论 该方法专属性好、精密度高,可用于滇龙胆中苯甲酸酯类成分的检测.
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滇龙胆资源家种后灰霉病发生与病原鉴定
目的 探讨引起滇龙胆灰霉病的病原种类及滇龙胆资源家种后感染该病的病原鉴定.方法 资源圃内以不同来源地居群资源为单位调查自然条件下的发病程度;病害标本进行常规组织分离、鉴定并验证.结果 资源圃内所有居群资源均可感染该病,发病株率为47.4%～100%,居群受害严重度有差别.病害标本分离出两种葡萄孢属菌且通过柯赫氏验证.结论 滇龙胆灰霉病由葡萄孢属的两种致病菌灰葡萄孢菌及另一短梗葡萄孢菌引起,滇龙胆是葡萄孢属的新记录寄主.
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滇龙胆裂环烯醚萜类活性成分积累规律的研究
目的 探讨同一居群滇龙胆根及根茎、茎、叶、花中裂环烯醚萜类主要活性成分的积累规律.方法 采用高效液相色谱法(HPLC)测定同一居群滇龙胆根及根茎、茎、叶、花中龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷等主要活性成分的含量,并建立其HPLC图谱,对滇龙胆不同部位中主要活性成分积累规律进行研究.结果 同一居群滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量极显著高于叶、花和茎(P＜0.01),滇龙胆叶中獐芽菜苦苷含量极显著高于根及根茎、花、茎(P＜0.01),滇龙胆花中獐芽菜苷含量显著高于根及根茎(P＜0.05);同一居群滇龙胆根及根茎、茎、叶、花HPLC图谱相似度在0.986以上,确定HPLC图谱中26个共有峰.结论 同一居群滇龙胆根及根茎、茎、叶、花中龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷含量存在极显著(P＜0.01)或显著(P＜0.05)差异;滇龙胆根及根茎、叶、花HPLC图谱相似度较高,主要活性成分种类差异较小.
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红外光谱在滇龙胆干燥方法选择上的应用
目的 筛选滇龙胆的佳干燥方法.方法 采用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)结合多元统计分析对晒干(GZCK)、发汗干燥(FZ)、45℃烘箱干燥(HZ45)、微波干燥(WZ)及室内阴干(YG)5种干燥方法处理的45份滇龙胆样品进行分析.结果 精密度、稳定性及重现性试验的匹配值在99.33～99.90之间,RSD≤0.01％,表明该法稳定可靠.谱峰比较发现,晒干处理样品在龙胆苦苷的两个主要特征吸收峰1 611和1 075 cm-1附近吸光度值比其它干燥处理的高,表明晒干有利于滇龙胆中龙胆苦苷的保留.原始光谱经自动平滑+自动基线校正+ Norris平滑(5:5)+二阶求导预处理并进行偏小二乘判别分析(Partial least square discriminant analysis,PLS-DA),结果显示同一干燥处理的样品相对聚集,判别效果较好.谱图检索显示相同干燥方法处理的样品匹配正确率为93.3％,表明该法用于分析不同干燥方法的滇龙胆样品效果较理想.结论 晒干是滇龙胆的佳干燥方法.该法可直观有效地评价中药干燥方法的优劣.
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滇西北野生滇龙胆根部HPLC指纹图谱研究
目的 建立滇西北少数民族聚居地区野生滇龙胆根部的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,为其质量评价提供依据.方法 采用HPLC法,色谱柱为Agilent Intersil-C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B),梯度洗脱,柱温30℃,流速1 ml·min-1,检测波长241 nm,进样量5μl.建立10批滇龙胆根部指纹图谱,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”确定共有峰,计算共有峰相对保留时间和相对峰面积,进行相似度分析,并采用SPSS22.0软件进行聚类分析.结果 滇龙胆根部指纹图谱共确定17个共有峰,图谱相似度大于0.9,10批样品聚为两类,发现各批次样品成分类型基本一致,成分含量存在差异.检测出5种主要成分马钱苷酸、獐芽菜苷、龙胆苦苷、当药苷和异牡荆苷的含量,各批次样品龙胆苦苷含量均大于3.0％.结论 该方法稳定、可靠,可为滇西北滇龙胆药材质量评价及少数民族聚居地区药用植物资源开发提供依据.
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滇龙胆不同居群rDNA-ITS序列分析
目的 研究云南代表性产地8个滇龙胆居群的rDNA ITS遗传差异,评价ITS用于滇龙胆产地鉴别的可行性.方法 运用常规PCR法扩增rDNA ITS后直接测序.结果 得到8个居群107个样品rDNA中的ITS和5.8SrDNA全长序列.其中,ITS2在滇龙胆种内居群间和居群内变异为丰富,但未找到能反映特定居群的稀有单倍型.结论 不同产地滇龙胆rDNA-ITS变异较大,但ITS在鉴别滇龙胆的产地上应用价值有限.
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生态环境因子和土壤条件对滇龙胆品质的影响
目的 研究生态环境因子和土壤条件与滇龙胆品质的相关性,揭示环境因素和土壤条件对滇龙胆品质影响形成的作用效应.方法 运用SPSS软件相关分析药材品质组分别与气候组、土壤条件组的相关关系.结果 对滇龙胆品质起主要影响效应的生态环境因子有和土壤条件:年均温度、5～7月平均温度、5～10月降雨量、年均降雨量、土壤有机质含量、土壤有效磷含量、土壤速效钾等因子对滇龙胆品质的形成具有重要作用.结论 初步筛选出影响滇龙胆药材品质的生态环境因子和土壤条件,为揭示滇龙胆品质提供了一定的基础依据.
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不同引发回干处理对滇龙胆种子萌发的影响
目的 研究不同化学溶液引发回干处理对滇龙胆种子萌发的影响.方法 采用人工气候箱模拟滇龙胆种子自然萌发条件,计算引发回干处理后种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数等数值,测定种子的可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量、过氧化物酶(POD)活性等生理指标,并对种子的发芽率与各生理指标做相关分析.结果 1.0％ KNO3引发回干处理的滇龙胆种子萌发效果明显;引发回干处理的滇龙胆种子细胞内清除丙二醛(MDA)的程度和高活性的抗氧化物酶是总体提升发芽率的主导因素,而可溶性糖和游离脯氨酸的积累程度则是辅助因素.结论 筛选出滇龙胆种子引发回干处理适宜的引发溶液,为滇龙胆的种苗培育、人工栽培和GAP生产基地的建设提供科学参考.
