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马兜铃酸Ⅰ肾毒性的实验研究
目的 观察马兜铃酸Ⅰ对SD大鼠的肾毒性反应,并评价其安全性.方法 马兜铃酸Ⅰ以30,15,5 mg/kg,ig,1次/d,连续14 d.结果 给药后高剂量组主要表现为体重减轻、活动减少、少尿或无尿;淋巴细胞计数、单核细胞计数、红细胞计数、红细胞压积、总蛋白质、白蛋白、总胆固醇、K+和Na+等均显著低于对照组,而血小板计数、中性粒细胞计数、葡萄糖、尿素氮、肌酐和乳酸脱氢酶等升高;尿中白蛋白、乳酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶等也显著升高,并有胆红素、白细胞和红细胞排出;肾脏脏器系数增大,肾小球出现红细胞堵塞,近曲小管上皮细胞变性较严重,伴有上皮细胞脱落,间质内可见较大面积的淤血、出血.结论 在该试验条件下,马兜铃酸Ⅰ对SD大鼠的肾脏毒性反应较强,不仅作用于近曲小管,亦能损伤肾小球,其安全剂量小于5 mg/kg.
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马兜铃酸Ⅰ对大鼠体内 PI3K／Akt／NF-κB 通路的影响
目的：探讨马兜铃酸Ⅰ（Aristolochic acid Ⅰ，AAⅠ）诱导的马兜铃酸肾病可能病变机制，分析其对 PI3K／Akt／NF-κB 通路的影响。方法 SD 雄性大鼠按随机数字表法分为空白对照组以及 AAⅠ高、低剂量（9．0、2．25 mg／kg）组，连续腹腔注射给药14 d 后，取血清检测肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、碱性磷酸酶（AKP），并用 HE 法染色观察肾脏病理组织学变化；用蛋白免疫印迹（Western blot）法分析 PI3K、Akt、NF-κB 蛋白的表达，此外用免疫组织化学方法分析 AAⅠ对肾脏组织 IL-6和 TNF-α的表达变化。结果给药 AAⅠ组与对照组比较，Cr、BUN、AKP 水平显著升高（P ＜0．05）；肾脏病理学检查显示肾脏病变和炎症改变，IL-6、TNF-α表达显著增多（P ＜0．01）；PI3K、Akt、NF-κB 及其磷酸化蛋白表达水平增高。结论 AAⅠ能导致肾脏毒性，并且可能通过激活 PI3K／Akt／NF-κB 通路，诱发炎症，从而加重肾脏组织病理学改变。
关键词： 马兜铃酸Ⅰ 肾损伤 PI3K/Akt/NF-κB 通路 炎症 -
HPLC法测定马兜铃酸Ⅰ在大鼠体内的浓度及其毒代动力学
目的:建立大鼠血浆中马兜铃酸Ⅰ的HPLC测定方法,采用单次灌胃给药毒性研究的3种剂量对马兜铃酸Ⅰ进行毒代动力学的初步研究,了解在毒性实验条件下马兜铃酸Ⅰ所达到的全身暴露与毒性之间的内在联系.方法:大鼠分别灌胃给予马兜铃酸Ⅰ 100、30、10 mg/kg,测定不同时间点的血浆药物浓度,应用统计矩的方法对血药浓度-时间数据进行拟合并计算毒代动力学参数.结果:测定方法的低定量浓度为 0.02 mg/L,线性范围为 0.02～40.00 mg/L,回收率在 82.4%～101.2%之间,日内、日间RSD小于 1.0%.100、30、10 mg/kg 3个剂量组的主要毒代动力学参数如下:t1/2α分别为(0.8±0.4)、(0.9±0.7)、(1.0±0.8) h;t1/2β分别为(34±19)、(133±64)、(114±50) h;tmax分别为(0.31±0.12)、(0.25±0.00)、(0.38±0.19) h;Cmax分别为(3.0±1.7)、(1.1±0.7)、(1.0±0.7) mg/L;AUC(0-48)分别为(18±3)、(18±2)、(21±5) mg·L-1·h.结论:该方法重现性好、灵敏度高,适用于大鼠血浆中马兜铃酸Ⅰ的测定.马兜铃酸Ⅰ能迅速吸收入血,随后快速分布、缓慢消除.在毒性剂量下,马兜铃酸Ⅰ在大鼠体内的毒代动力学过程具有非线性动力学性质.
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马兜铃酸Ⅰ在大鼠体内的毒代动力学
目的 采用重复多次给药毒性研究的三种剂量对马兜铃酸I进行毒代动力学的初步研究,了解在毒性实验条件下马兜铃酸I所达到的全身暴露与毒性之间的内在联系,为安全性评价和毒性机制的研究提供参考资料.方法 分别灌胃给予大鼠马兜铃酸I30、15、5 mg·kg-1,每天1次,连续14 d,测定不同时间点的血浆药物浓度,用DAS药动学程序对血药浓度一时间数据进行拟合并计算毒代动力学参数.结果 高、中、低三个剂量组的半衰期(t1/2)分别为(14.29±3.98)、(41.67±21.96)、(144.83±50.43)h,达峰时间(Tmax)分别为(0.10±0.6)、(0.08±0.00)、(0.08±0.00)h,峰浓度(Cmax)分别为(3.02±1.72)、(2.39±2.00)、(1.47±0.78)mg·L-1,曲线下面积AUC(0-24)分别为(8.47±3.08)、(9.36±2.31)、(7.49±0.46)nag·L-1·h.AUC及Cmax与剂量均不呈比例,且三种剂量的半衰期相差较远.结论 马兜铃酸I能迅速吸入血,随后浓度逐渐降低,于24 h后仅存微量.在毒性剂量下,马兜铃酸I在大鼠体内的毒代动力学过程出现了一定程度的变化,具有非线性动力学性质.
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SPE-HPLC法测定辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的含量
目的:建立辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的SPE-HPLC限量检查法.方法:采用超声、固相萃取法对制剂中马兜铃酸Ⅰ进行提取纯化,HPLC法对其含量进行检测.色谱柱为Agilent Zorbax SB-C 18柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸(60:39:1),体积流量1.0 mL/ min,检测波长390 nm.结果:马兜铃酸Ⅰ在进样量2.632 9～105.314 ng浓度范围内线性关系良好(r =0.999 9).检测限为2.6 ng,平均回收率100.7％,RSD=2.81％(n=9).结论:该法简捷,结果准确可靠,可用于辛芩胶囊中马兜铃酸Ⅰ的限量检查.
关键词： 辛芩胶囊 马兜铃酸Ⅰ 固相萃取-高效液相色谱法 含量测定 -
寻骨风药材质量标准研究
寻骨风为马兜铃科植物绵毛马兜铃Aristolochia molissima Hance的干燥全草.《中国药典》77版、《中药材》1992年版、《中药大辞典》、《中草药》汇编1982年版皆有收载.分布于我国长江流域至中部各省及山东省等地,其具有祛风、通络,止痛之功效,可用于治疗风湿痹痛,关节酸痛等症.本品含有马兜铃酸Ⅰ,而马兜铃酸Ⅰ为其有效活性成分,具有抗癌、抗感染、抗早孕及增强吞噬细胞活性等药理作用,近年来马兜铃酸引起的肾损害“马兜铃酸肾病”已日益受到临床重视.
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脾虚湿困大鼠有机阴离子转运肽2a1、2b1和4a1动态表达的探讨:中医湿浊转运机理研究
目的 探讨脾虚湿困大鼠各脏腑组织有机阴离子转运肽(organic anion transporter polypeptide,oatp) 2a1、2b1和4a1表达的动态变化在湿浊转运中的机制.方法 48只大鼠被随机分成正常组、正常+马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ,AA-Ⅰ)5min组、正常+AA-Ⅰ 60min组、脾虚湿困组、脾虚湿困+AA-Ⅰ 5min组和脾虚湿困+AA-Ⅰ 60min组.经处理后取各组大鼠肺、胃、肝、脾、肾、大肠和小肠组织,检测各组织oatp2a1、2b1和4a1基因和蛋白表达.结果 与正常组比较,正常+AA-Ⅰ 60min组脾、肾、大肠、小肠oatp2a1 mRNA表达下调(P＜0.05),脾虚湿困组脾、肾、小肠oatp2b1和脾、胃oatp4a1 mRNA表达下调(P＜0.05),脾虚湿困+AA-Ⅰ 5min组小肠oatp2a1、大肠oatp2b1和脾oatp4a1 mRNA表达下调(P＜0.05),脾虚湿困+ AA-Ⅰ 60min组大肠oatp2a1和肺、肾、胃、小肠oatp2b1及肾、胃oatp4a1 mRNA表达下调(P＜0.05).各组各脏腑组织oatp2a1、2b1和4a1的蛋白表达与基因表达结果一致.结论 机体各脏腑组织可能通过调控oatp2a1、2b1和4a1的表达水平来实现体内的湿浊转运.
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反相高效液相色谱法测定甘露消毒丸中马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ的含量
目的建立反相高效液相色谱法测定甘露消毒丸中马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ的含量.方法采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-水-冰醋酸(68:32:1)为流动相,检测波长为250 nm,流速为1.0 mL·min-1.用超声提取法提取甘露消毒丸中的马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ.结果马兜铃酸Ⅰ在 0.135～27.000 μg·mL-1( r＝0.999 8,n＝5),马兜铃酸Ⅱ在 0.325～ 65.000 μg·mL-1( r＝0.999 9,n＝5)线性关系良好.马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ的低检测浓度分别为0.081,0.065 μg·mL-1,平均回收率分别为98.50%,99.12%,RSD分别为2.30%,3.50%.结论该方法简便、快速、灵敏.
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三七总皂苷对马兜铃酸Ⅰ诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响
目的:探讨三七总皂苷(total saponins of panax notoginseng,PNS)对马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ,AAI)诱导的人肾小管上皮细胞株HK-2转分化的影响.方法:应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化;免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,a-SMA)的表达;ELISA法测定培养细胞上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的含量.结果:AA I诱导组HK-2细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态;胞浆内大量表达α-SMA,其积分光密度值增加(P<0.05);细胞培养上清液中TGF-β1含量均增加,且呈时间依赖性(P<0.05).不同剂量PNS治疗可减轻从Ⅰ诱导的细胞形态学改变,不同程度的抑制α-SMA的表达和TGF-β1的分泌,且呈剂量依赖性(P<0.05).PNS对照组HK-2细胞形态学、α-SMA表达和TGF-β1分泌与空白对照组比较均无明显变化.结论:AA I可通过促进TGF-β1的分泌诱导肾小管上皮细胞转分化,促进细胞外基质α-SMA的合成;PNS可抑制AA I诱导的肾小管上皮细胞转分化作用,减少α-SMA的表达,该作用可能是通过抑制TGF-β1表达实现的.
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补体C3a及其受体在马兜铃酸Ⅰ肾损伤大鼠体内表达分析
目的 分析补体C3a(complement 3a)及其受体C3aR(complement 3a receptor)在马兜铃酸 Ⅰ(Aristolochic acidⅠ,AAⅠ)肾损伤大鼠体内的表达情况,初步探究其在马兜铃酸肾病中的作用.方法 SD大鼠按体质量完全随机分为溶媒对照组,AAⅠ 低、 高剂量(2.25,9.00 mg·kg-1)组,连续腹腔注射给药14 d,取血清,检测肌酐(serum creatinine,Scr)、 尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、 补体C3、C3a;用HE法染色观察肾脏病理组织学变化;用蛋白免疫印迹(Western Blot)法分析肾脏组织C3aR蛋白的表达;用免疫组织化学方法分析肾脏组织C3aR的表达变化.结果 与溶媒对照组比较,AAⅠ 低、 高剂量组Cr、BUN水平显著升高(P<0.05,P<0.01);补体C3水平显著降低(P<0.01),而C3a水平显著升高(P<0.05,P<0.01);肾脏病理学检查显示AAⅠ 低、 高剂量组肾脏有明显病变;Western Blot结果显示,与溶媒对照组比较,AAⅠ 低、 高剂量组大鼠肾脏中C3aR蛋白表达水平明显升高,且呈剂量依赖关系,差异有统计学意义(P<0.01);免疫组化分析显示,溶媒对照组肾组织中可在肾小管上皮细胞见C3aR少量表达,AAⅠ 低、 高剂量组的大鼠肾组织中C3aR主要表达在肾小管上皮细胞和间质细胞等,且C3aR表达显著高于溶媒对照组(P<0.01),随病理损伤程度增加而增多.结论C3aR在AAⅠ 致肾损伤大鼠肾脏组织中有表达,通过与其配体结合可能引起肾组织的损伤.补体C3a及其受体在马兜铃酸肾病中发挥一定的作用.
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马兜铃酸Ⅰ激活大鼠肾脏p38 MAPK通路并导致肾细胞凋亡的研究
目的 探讨马兜铃酸Ⅰ (aristolochic acid Ⅰ,AAI)诱导马兜铃酸肾病可能的病变机制,分析AAI对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路及其下游相关凋亡通路的影响.方法 SD雄性大鼠按体质量随机分为溶媒对照组,AAI高、低剂量(9.0,2.25 mg·kg-1)组,连续给药14 d.用生化试剂盒测定肾组织中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);用蛋白免疫印迹(Western blot)法分析p38、c-jun氨基末端激酶(JNK)及其磷酸化水平和凋亡相关蛋白水平;用TUNEL染色法观察AAI对肾脏组织细胞凋亡的影响.结果 与溶媒对照组比较,AAI组肾组织中MDA明显含量升高(P＜ 0.05,P＜ 0.001),SOD及CAT活力明显降低(P＜0.01,P＜ 0.001);总p38(t-p38)、磷酸化p38(p-p38)蛋白表达水平升高(P＜0.01,P＜ 0.001);总JNK(t-JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表达水平无明显变化;Caspase-3、Caspase-9、Bax等凋亡相关蛋白表达水平升高(P＜0.05),Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.05);肾组织中凋亡小体个数明显增多(P＜ 0.01,P＜ 0.001).结论 AAI可能通过激活p38 MAKP通路导致肾脏组织细胞凋亡而产生肾毒性效应.
关键词： 马兜铃酸Ⅰ 肾毒性 p38 MAKP通路 凋亡 -
马兜铃酸Ⅰ致癌作用及其与代谢酶关系的研究进展
马兜铃酸（aristolochic acid，AA）广泛存在于马兜铃科马兜铃属中草药中，是马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy，AAN）的致病因素，此类肾病患者可伴发泌尿系统肿瘤，阐明马兜铃酸的致癌机制成为其毒性研究的一大焦点。马兜铃酸Ⅰ（AAⅠ）是马兜铃酸的主要毒性成分，其在体内经氧化还原后活化，与 DNA 共价结合形成加合物而诱发癌变。本文综述参与 AAⅠ氧化还原的代谢酶及其代谢过程在 AAⅠ致癌中的作用。
关键词： 马兜铃酸 马兜铃酸Ⅰ 马兜铃酸Ⅰ-DNA 加合物 代谢酶 致癌 -
固本祛风颗粒中马兜铃酸Ⅰ的限量检查
目的:建立固本祛风颗粒中马兜铃酸Ⅰ的限量检查方法,保证临床用药安全.方法:采用高效液相色谱法.色谱柱为GL Inertsil ODS-SP( 150 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.05％磷酸(40:60),流速为1 mL·min-1,柱温为28℃,检测波长为320nm.结果:马兜铃酸Ⅰ的进样量在19.44～194.40 ng范围内与峰面积积分值呈良好线性关系(r=0.999 7)；平均回收率为98.84％,RSD=0.90％ (n=6)；低检测限为1.944 ng.3批固本祛风颗粒中均未检出马兜铃酸Ⅰ.结论:该方法简便、专属性强、灵敏度高,可用于固本祛风颗粒中马兜铃酸Ⅰ的限量检查.
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高效液相色谱法测定人血清中马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ的含量
目的:建立以高效液相色谱法测定人血清中马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ含量的方法.方法:色谱柱为C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸(72∶27∶1),检测波长为250nm,流速为1.0ml/min.结果:马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ检测浓度线性范围分别为0.84～13.50μg/ml(r=0.9 997,n=5)、2.03～32.50μg/ml(r=0.9 994,n=5),低检测浓度分别为0.3、0.1μg/ml.结论:本方法简便、易行,可为临床诊治马兜铃酸肾病提供依据.
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马兜铃属植物肾毒性研究进展
目的:综述马兜铃属植物肾毒性研究进展.方法:查阅国内外有关文献.结果:内容涉及马兜铃属植物肾毒性的主要症状、病理改变特点、作用机制及其防治.结论:马兜铃属植物作为常用中药,其潜在毒性和对肾脏的损害应引起重视.
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三种外源物诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性模型的研究
目的:采用庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性细胞模型.方法:分离培养兔原代肾小管上皮细胞(RTECs),酶化学染色和免疫组化鉴定;采用MTr法绘制兔RTECs传代培养生长曲线并确定佳接种细胞量及加药时间;测定不同浓度庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ对细胞增殖作用及乳酸脱氢酶(LDH)释放量的影响.结果:碱性磷酸酶染色及免疫组化染色均呈阳性结果证明获得兔RTECs,细胞传代培养的佳接种量为1×104个/孔,佳给药时间为接种48h.不同浓度庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ均使细胞形态有一定的改变,对细胞增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性.三者均使细胞LDH的释放量增高,呈浓度依赖性,其中顺铂和马兜铃酸Ⅰ的作用显著.结论:采用庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ可诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性细胞模型.
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马兜铃酸Ⅰ诱导人肾小管上皮细胞转分化机制的初步探讨
目的:探讨马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ,AAI)诱导体外培养的人肾小管上皮细胞株(HK-2)转分化的可能机制.方法:将HK-2细胞分为对照组和AAI组,两组细胞分别培养24h、48h、72h.应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化;免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle acfin,α-SMA)的表达;ELISA法定量检测上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达;逆转录-聚合酶反应(RT-PCR)检测结缔组织生长因子(connection tissue growth factor,CTGF)mRNA的水平变化.结果:20μg/ml的AAI可诱导HK-2细胞肥大、拉长呈梭形,TGF-β1分泌增加,CTGFmRNA合成增加,α-SMA表达增强.这些作用呈一定的时间依赖性.结论:AAⅠ可诱导肾小管上皮细胞转分化,可能与TGF-β1分泌增多有关,而TGF-β1可能通过下游CTGF发挥生物学效应.
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RP-HPLC法测定大鼠血浆中马兜铃酸Ⅰ的浓度
目的:建立大鼠血浆中马兜铃酸Ⅰ的HPLC测定方法.方法:色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸(69:30:1),流速为1.0 mL·min-1,检测波长为250 nm,柱温为35℃.结果:线性范围为0.02～40.0 mg·L-1,低定量浓度为0.02 mg·L-1,日内、日间RSD小于1.0%,方法平均回收率为82.4%～101.2%.结论:该法重现性好、灵敏度高,适用于大鼠血浆中马兜铃酸Ⅰ的测定.
