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蟾酥鲜浆中蟾毒配基类成分的动态变化规律探索
目的:研究蟾酥鲜浆在不同温度放置时蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基随放置时间延长的变化规律,以指导蟾酥的加工.方法:采用HPLC测定在常温、冷藏和冷冻条件下贮存不同时间的蟾酥鲜浆中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量.结果:常温和冷藏下贮存,3种成分的含量随放置时间的延长而升高,前24 h内升高的幅度较大,3种成分间的组成比例亦发生较大的变化.结论:蟾酥鲜浆加工成蟾酥前应先在常温下放置＞24 h,再进行干燥加工.
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蟾酥中3种蟾毒配基组合物的表观溶解度和表观油水分配系数的测定
目的:测定蟾酥中3种蟾毒配基组合物的表观溶解度和表观油水分配系数.方法:采用高效液相色谱法测定了蟾酥中3种蟾毒配基组合物中RBG,CBG,BL的表观溶解度,采用摇瓶法测定了RBG,CBG,BL的表观油水分配系数.结果:37℃,pH 7.0时,蟾酥中3种蟾毒配基组合物中RBG,CBG,BL的表观溶解度均为大值,分别是76.29,51.85,32.76μg·mL-1,总溶解度为160.9μg·mL-1.在偏酸和偏碱性条件下,三者均有不同程度的降解.RBG,CBG,BL在不同pH条件下各自log P值差别不大,pH对RBG,CBG,BL的油水分配系数影响不显著,三者的油水分配系数均较大,为典型的疏水性产物,三者的疏水性大小顺序为RBGBLCBG.结论:蟾酥中3种蟾毒配基组合物中RBG,CBG,BL的水溶性差,疏水性极强,应考虑加入表面活性剂增溶,以利于注射制剂的成型.
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蟾蜍类药材中吲哚生物碱和蟾毒配基类成分的含量
目的:建立蟾蜍类药材中吲哚生物碱和蟾毒配基类成分的HPLC含量测定法,并对蟾酥、蟾皮、蟾衣中2类成分进行分析.方法:吲哚生物碱类,Nucleosil C18柱,乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(6∶94,磷酸调pH 3.2)为流动相,流速0.8 mL·min -1,检测波长275 nm,柱温30℃；蟾毒配基类,Alltima C18柱,乙腈(A)-0.3％乙酸溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0～ 15 min,28％～54％A;15 ～35 min,54％A),流速0.6 mL· min-1,检测波长296 nm,柱温30℃.结果:五羟色胺、N-甲基五羟色胺、N,N-二甲基五羟色胺、N,N,N-三甲基五羟色胺、蟾蜍噻咛依次在0.079 6～0.796,0.097 2 ～1.945,0.074 4 ～0.744,0.103～2.05,0.067 2 ～0.672μg线性关系良好；五羟色胺和N-甲基五羟色胺的平均加样回收率依次为98.6％和91.3％；日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基依次在0.00483 ～0.614,0.007 9 ～ 1.006,0.007 95 ～ 1.016,0.009 7 ～ 1.24,0.009 6～1.22 μg线性关系良好；平均加样回收率依次为101.6％,102.5％,101.0％,99.1％,98.9％.结论:蟾酥中吲哚生物碱和蟾毒配基类成分含量均较高,蟾皮中含量次之,蟾衣中含量低甚至检测不到.
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利用UPLC-TQ-MS比较蟾酥鲜品和蟾酥商品化学成分
蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans或黑框蟾蜍B.melanostictus等近缘种的耳后腺分泌的白色浆汁加工而成,近年来多用于治疗各种癌症,有一定的攻毒抗癌、消肿止痛作用.研究表明其主要抗肿瘤成分为蟾蜍二烯内酯类.蟾蜍二烯内酯有游离型和结合型2种结构.该文通过超高效液相色谱质谱联用技术(UPLC-TQ-MS)对中华大蟾蜍的蟾酥鲜品中蟾蜍二烯酸内酯类成分进行研究.采用UPLC-TQ-MS的正离子多反应监测(MRM)模式.色谱条件:ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱(2.1 mm× 100 mm,1.7 μm),柱温35.0℃,流速0.4 mL·min-1,流动相0.1％甲酸超纯水溶液-乙腈溶液.终结合相关文献推导出蟾酥鲜品的37种蟾蜍二烯内酯成分,其中26种为游离型结构,11种为结合型结构.与蟾酥商品比较,二者之间有18种化合物存在显著差异,研究发现蟾酥的部分化学成分经加工处理后有很大的变化,7种结合型蟾蜍二烯内酯大量减少,11种游离型蟾蜍二烯酸内酯含量也随之明显改变,可能是在加工处理过程中蟾蜍二烯酸内酯部分结合型转化成了游离型.
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基于特征图谱和一测多评法的蟾酥药材质量控制研究
蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans或黑眶蟾蜍B.melanostictus耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物.目前商品蟾酥质量问题突出,混伪、掺假现象普遍存在.亟需构建科学完善的质量控制方法,以提升蟾酥药材、饮片及其中成药制剂的质量控制水平,保障临床用药安全有效.该研究采用高效液相色谱法建立蟾酥药材的特征图谱,采用一测多评法(QAMS)测定5种主要蟾毒配基的含量.通过不同批次市售蟾酥样品的分析,建立了以五羟色胺、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为特征峰的对照特征图谱;建立了以华蟾酥毒基为内参物,同步测定蟾酥药材中5种蟾毒配基含量的一测多评法,并对相对校正因子(RCF)的耐用性和系统适用性进行了系统研究.华蟾酥毒基对日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基的RCF分别为1.05,0.895,1.09,0.913.建立的特征图谱和QAMS法,可以有效控制蟾酥药材的质量,为2020年版《中国药典》蟾酥药材质量标准的完善与提高提供参考.
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HPLC-DAD-FT-ICR-MS法分析华蟾素中蟾毒配基类成分
华蟾素为中华大蟾蜍皮水煮醇沉制剂,临床具显著抗肿瘤活性.本文首次采用高效液相色谱串联高分辨傅立叶变换离子回旋共振质谱(HPLC-DAD-FT-ICR-MS)方法,针对华蟾素中主要抗肿瘤活性成分蟾毒配基类化合物进行了分析,旨在阐明华蟾素抗肿瘤活性效应物质基础.该研究首先采用二氯甲烷-硅胶固相萃取法对华蟾素中蟾毒配基类成分进行富集,根据化合物的UV及FT-ICR-MS高分辨质谱的一级、二级质谱数据,结合文献,比较分析了华蟾素中的主要蟾毒配基类成分的化学组成,共推导出33个蟾毒配基类成分,其中8个成分通过与对照品比对,准确鉴定了结构.该研究基本阐明了华蟾素中主要蟾毒配基类成分,为华蟾素的进一步药效学研究奠定了物质基础.
关键词： 华蟾素 蟾毒配基 HPLC-DAD-FT-ICR-MS -
雷公藤内酯及蟾毒配基类化合物的生物转化研究进展
生物转化(biotransformation)是利用生物体系或其产生的酶对外源性化合物进行结构修饰的生物化学过程,其本质为酶催化反应[1,2].生物转化反应具有选择性强,催化效率高,反应条件温和,反应类型多,以及环境污染小等特点,且往往可用于催化有机合成方法难以完成的化学反应,易于得到结构新颖的化合物.因此,生物转化技术作为合成方法的有力补充,已成为有机化学家的重要研究工具之一.目前采用生物转化技术已获得了大量新颖的化学结构,包括很多天然产物衍生物,为新药的研制与开发提供了极有价值的先导化合物.有的生物转化反应还达到了工业化生产的规模,创造了巨大的经济效益[3].
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蟾酥的研究进展
蟾酥由蟾蜍表皮腺体的分泌物经干燥而成.作为一种传统中药,其所含化学成分复杂,能清热解毒、醒脑开窍、化结溃坚;具有降压、增强心肌收缩力、增加冠状动脉流量、抗肿瘤、麻醉等药理作用.临床中广泛用于心血管系统、呼吸系统、五官、外科等疾病的治疗;作为有毒中药,其量效关系、毒性成分、中毒剂量和毒理机制等问题亦不容忽视.试从蟾酥的化学成分、药理作用及其机制、毒理作用、不良反应、炮制工艺、药动学等方面对其进行初步总结,为深入研究蟾酥的药理作用及复方制剂提供参考.
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蟾酥中蟾毒配基类化合物的抗肿瘤研究进展
蟾酥为我国名贵中药,研究发现,其所含的蟾毒配基类化合物对白血病、结肠癌、肝癌、胰腺癌等恶性肿瘤,有明显抗肿瘤作用,且毒副作用较小.目前,蟾毒配基类化合物在肿瘤治疗中有较好的发展前景.笔者对其治疗肿瘤的机理进行综述.
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蟾酥不同干燥方法比较研究
目的:研究不同干燥方法对蟾酥药材质量的影响.方法:以水分含量和三种蟾毒配基类成分脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵的含量为指标,检测室内避光阴干、室内晾晒、室外晒干、45℃烘干、80℃烘干五种不同干燥方法对蟾酥质量的影响.结果:室内阴干、室内晾晒、室外晒干5d后,水分达到《中国药典》要求,45℃烘干、80℃烘干干燥的样品分别于48 h、12 h达到要求;不同干燥方法的蟾酥中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基总量都大干6.0％,且室内阴干＞室内晾晒＞阳光晾晒＞恒温45℃＞恒温80℃.结论:综合考虑蟾毒配基类成分含量、成本及操作难易度等因素,蟾酥的干燥宜采用室内避光阴干的方法.
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华蟾素蟾毒配基对小鼠脾淋巴细胞免疫功能的影响
目的:通过体内外观察华蟾素蟾毒配基对免疫相关细胞因子的影响,分析药物对免疫系统的调节作用,为阐明免疫机制提供药效学依据.方法:无菌分离小鼠脾淋巴细胞制备淋巴细胞悬液,设置多个华蟾素蟾毒配基浓度组进行给药,MTT法检测LPS和ConA刺激小鼠脾淋巴细胞增殖;用预孵育淋巴细胞6h后加入Con A或LPS诱导细胞活化,通过基于流式细胞术的高通量多因子检测技术对细胞上清液进行GM-CSF、TNF-α,IFN-γ,IL-1α,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10多细胞因子检测以评价药物体外免疫效果.建立AsPC-1胰腺癌荷瘤裸鼠动物模型,待给药一定时间后取小鼠血清,利用流式细胞仪通过相同方法对血清进行相同细胞因子检测,评价其体内免疫效果.结果:华蟾素蟾毒配基单独作用和与刺激剂协同刺激淋巴细胞结果发现,与ConA协同作用时能刺激淋巴细胞分泌INF-γ、GM-CSF、IL-1α、IL-4、IL-5和IL-6,单独作用能刺激分泌TNF-α、IL-2、IL-4和IL-5,而与LPS协同作用除了刺激TNF-α和IL-6分泌外,则抑制INF-γ、GM-CSF、IL-4和IL-5的分泌.0.05和10μg/ml为易引起药物刺激或抑制作用变化的浓度组.药物体内作用胰腺癌荷瘤裸鼠免疫效果观察发现,与吉西他滨和华蟾素注射液相比,蟾毒配基能更多的增强细胞因子的表达,1mg/kg浓度组对脾脏有一定的保护作用,而2mg/kg浓度组对脾脏的作用与华蟾素注射液和吉西他滨相当.结论:华蟾素蟾毒配基在体外可一定程度促进B淋巴细胞增殖,体内能引起多种细胞因子的分泌,增强机体的免疫功能,但作用机制以及体内免疫作用还有待进一步研究.
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脂溶性蟾毒配基的纯化工艺研究
目的：研究从蟾酥中提取分离高纯度蟾毒灵（B）、华蟾酥毒基（C）和脂蟾毒配基（R）的纯化工艺条件。方法：以三种蟾毒配基的总含量和转移率为考察指标，采用单因素考察法，结合蟾酥药材的特点、化学成分及工艺成本等多方面的综合因素，考察蟾酥药材的提取、萃取及硅胶柱层析分离的具体工艺条件及参数。结果：蟾酥药材经10倍量（v／m）80％乙醇加热回流1h，再用10倍量（v／m）乙酸乙酯萃取3次，后用硅胶柱层析进行分离后，三种蟾毒配基的总含量可达92.26％，总转移率为80.54％。结论：此法能很好地从蟾酥中分离纯化蟾毒配基，大大提高了三个蟾毒配基的纯度。
