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特征图谱法测定蟾皮药材中沙蟾毒精等4种活性成分的含量
目的:采用特征图谱法对不同产地的蟾皮药材进行了分析,并建立了同时测定沙蟾毒精等4种蟾毒配基类成分的含量的方法,为其质量控制和药材鉴定提供依据.方法:采用特征图谱法对不同产地的多批蟾皮药材进行了沙蟾毒精等4种蟾毒配基类成分的含量测定.采用菲罗门Phenomenex Gemini色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0～30 min,10％ ～45％ A;30 ～45 min,45％～ 60％A),流速1.0 mL· min-1,柱温35℃,检测波长296 nm.结果:四川产地蟾皮的沙蟾毒精含量较高(大花皮、中黑皮、超大皮、棕褐色皮、小黑皮质量分数分别是0.252 4％,0.158 4％,0.181 1％,0.125 8％,0.108 8％),其次是江苏产地的黑皮(0.227 5％).四川大花皮中华蟾毒它灵含量较高(0.214 3％),其次是江苏黑皮(0.147 8％).四川小黑皮中蟾毒灵(0.051 0％)和山东小花皮中华蟾酥毒基(0.136 1％)含量较其他产地和品种中较高.总体来说,四川产地的蟾皮4种配基类含量较高,尤其是四川大花皮品种.结论:该文采用特征图谱法对不同产地蟾皮中沙蟾毒精进行了测定,并对其他3种蟾毒配基类成分进行了标定,该方法准确可靠,可用于蟾皮的鉴别和质量控制.不同产地和品种蟾皮中4种蟾毒配基类成分含量不尽相同.
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蟾皮活性组分的分离与体外抗肿瘤活性考察
目的:分离蟾皮活性组分并考察大孔树脂不同洗脱部位对肺癌细胞A549生长的抑制作用.方法:采用静态吸附-洗脱试验筛选大孔树脂型号,单因素试验优选蟾皮活性组分的大孔树脂纯化工艺.建立乙醇洗脱液中总生物碱和4种蟾毒二烯内酯类成分的含量测定方法,通过MTT试验测定不同洗脱部位对肺癌细胞A549的抑制率.结果:AB-8型大孔树脂对蟾皮总生物碱和4种二烯内酯类成分均具有较好的吸附分离性能,4个不同乙醇洗脱部位对肺癌细胞A549均表现出抑制作用,30％乙醇和70％乙醇洗脱液的细胞抑制率较高,IC50分别为1.83,2.23 mg·L-1.结论:大孔树脂可用于分离纯化蟾皮中活性组分,不同洗脱部位对肺癌细胞A549的抑制率呈现一定的浓度依赖性,30％乙醇和70％乙醇洗脱部位可作为蟾皮抗肿瘤制剂的重点有效组分.
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不同品种及产地蟾皮中抗肿瘤活性成分含量比较
目的:对不同品种及不同产地蟾皮中所含抗肿瘤脂溶性活性成分酯蟾毒配基、华蟾酥毒基以及水溶性活性成分吲哚类生物碱的含量进行比较.方法:应用HPLC法测定广西、湖南、陕西产黑眶蟾蜍,江苏、安徽、河北、山东产中华大蟾蜍蟾皮中酯蟾毒配基、华蟾酥毒基的含量,并采用分光光度法,以5-羟色胺盐酸盐为对照测定其所含吲哚类生物碱的含量.结果:山东产蟾皮中酯蟾毒配基、华蟾酥毒基未检测到,其余6个产地蟾皮中酯蟾毒配基、华蟾酥毒基的含量分别在0.0612-0.5760、0.1163-0.4950mg/g,其中河北产蟾皮中酯蟾毒配基含量高,江苏产蟾皮中华蟾酥毒基含量高.7个产地蟾皮中吲哚类生物碱含量在0.5150-1.300mg/g,其中江苏产蟾皮中吲哚类生物碱含量高,河北产含量低.结论:不同品种蟾皮差异不大,但不同产地蟾皮中抗肿瘤活性成分的含量存在较大差异,因此在研发以蟾皮为主药的抗肿瘤制剂时,应建立蟾皮药材的质量控制标准,以保证制剂的质量.
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蟾皮和华蟾素注射液中蟾蜍噻咛含量测定
目的:建立蟾皮中蟾蜍噻咛的含量测定方法,比较不同产地及养殖方式对蟾皮中蟾蜍噻咛含量的影响.方法:采用高效液相色谱法测定了不同产地蟾皮中蟾蜍噻咛的含量,色谱柱Lichrosob C18(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈-水(10∶90),检测波长225 nm,流速1.0 mL·min-1.结果:回归方程为Y=7.489×104+2.791×105X,r=0.999 9,平均回收率为99.2%,蟾皮中蟾蜍噻咛的质量分数在36.4～641.8 μg·g-1,华蟾素注射液中的质量分数在22.47～33.16 μg·mL-1.结论:蟾皮中蟾蜍噻咛在野生和养殖品种中的差异较大.该方法快速简便,重复性良好,可用于蟾皮和华蟾素注射液中蟾蜍噻咛的含量测定.
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蟾皮中亲水性成分的化学研究
综合利用硅胶、ODS及正相、半制备高效液相等多种色谱技术,对蟾皮大孔树脂15％乙醇洗脱部位进行化学成分分离,运用现代波谱学方法结合文献对分离得到的化合物进行结构鉴定.该研究从蟾皮中共分离鉴定了15个亲水性化合物,分别为:4,5-dimethyl-1,3,4,5-tetrahydropyrrolo[4,3,2-de] quinolin-6-ol(1),5-羟色胺(2),N-methyl serotonin(3),蟾蜍素(4),1,2,3,4-tetrahydro-6-hydroxy-β-carboline (5),5-甲氧基色胺(6),甜菜碱(7),咖啡因(8),蟾毒色胺(9),shepherdine(10),色氨酸(11),5-羧基吲哚-3-乙酸(12),5-羟基色醇(13),2-methyl-6-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline(14),蟾蜍噻咛(15).其中化合物1为新化合物,化合物5为新天然产物并首次报道其碳谱,化合物4～8,10～14为首次从蟾皮中分离得到.
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蟾蜍类药材中吲哚生物碱和蟾毒配基类成分的含量
目的:建立蟾蜍类药材中吲哚生物碱和蟾毒配基类成分的HPLC含量测定法,并对蟾酥、蟾皮、蟾衣中2类成分进行分析.方法:吲哚生物碱类,Nucleosil C18柱,乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(6∶94,磷酸调pH 3.2)为流动相,流速0.8 mL·min -1,检测波长275 nm,柱温30℃；蟾毒配基类,Alltima C18柱,乙腈(A)-0.3％乙酸溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0～ 15 min,28％～54％A;15 ～35 min,54％A),流速0.6 mL· min-1,检测波长296 nm,柱温30℃.结果:五羟色胺、N-甲基五羟色胺、N,N-二甲基五羟色胺、N,N,N-三甲基五羟色胺、蟾蜍噻咛依次在0.079 6～0.796,0.097 2 ～1.945,0.074 4 ～0.744,0.103～2.05,0.067 2 ～0.672μg线性关系良好；五羟色胺和N-甲基五羟色胺的平均加样回收率依次为98.6％和91.3％；日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基依次在0.00483 ～0.614,0.007 9 ～ 1.006,0.007 95 ～ 1.016,0.009 7 ～ 1.24,0.009 6～1.22 μg线性关系良好；平均加样回收率依次为101.6％,102.5％,101.0％,99.1％,98.9％.结论:蟾酥中吲哚生物碱和蟾毒配基类成分含量均较高,蟾皮中含量次之,蟾衣中含量低甚至检测不到.
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蟾衣的采集和药用价值
蟾蜍是一种极有价值的药用动物，它的耳后腺和皮肤分泌的乳白色浆液可加工成名贵中药材蟾酥。蟾干、蟾头、蟾皮、蟾舌、蟾肝、蟾心、蟾胆、后足、粪便等均可药用。蟾皮是把蟾蜍杀死后剥下的皮，风干后每张重1～2g，而蟾衣是在生长过程中，生理上的需要而脱下的壳，即活蟾皮肤上脱下的一层很薄的表皮，风干后仅重0.2～0.4g。这就是蟾皮和蟾衣的区别。蟾衣可以治疗各种肿瘤、急慢性肝炎、乳腺小叶增生、子宫肌瘤、带状疱疹、乙肝、肝腹水等疑难杂症。
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正交设计优选蟾皮提取方法
目的 考察水提醇沉法和乙醇煎煮回流法对蟾皮有效成分的影响,优选蟾皮提取工艺.方法 通过正交试验法,以华蟾酥毒基为指标,采用高效液相色谱法对不同方法提取的蟾皮样品进行含量测定.结果 水提醇沉法各因素影响大小为提取次数＞加水倍数＞提取时间,佳工艺为B3A3C2,即加10倍量的水,煎煮3次,每次煎煮时间为45 min.乙醇煎煮回流法各因素影响大小为乙醇浓度＞提取时间＞加醇倍数,佳工艺为A1B3C3,即加30倍量的50%乙醇,煎煮3次,每次煎煮时间为1h.结论 综合评分结果显示乙醇煎煮回流法优于水提醇沉法,但是水提醇沉法提取的华蟾素毒基含量更高.
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离心法和透析法测定蟾皮提取物固体脂质纳米粒包封率的比较
目的：确定测定蟾皮提取物固体脂质纳米粒包封率的优方法。方法分别采用低速离心法、超速离心法和透析法测定蟾皮提取物固体脂质纳米粒包封率，考察采用3种不同透析介质测定的蟾皮提取物固体脂质纳米粒包封率，比较其测得包封率结果的准确性。结果不同测定方法测得的包封率结果不同，低速、超速离心法和透析法测定华蟾酥毒基（CBG）和酯蟾毒配基（RBG）包封率分别为（74.00±1.69）%和（75.01±2.05）%，（83.60±0.99）%和（82.51±1.56）%，（91.01±0.75）%和（89.22±0.88）%；透析法中透析介质不同测得的CBG和RBG包封率也不同，但结果无显著性差异。结论不同的包封率测定方法对包封率测定结果有显著性影响，透析法更适合蟾皮提取物脂质纳米粒包封率的测定。
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多指标综合评价优选蟾皮脂溶性成分提取工艺
目的 考察蟾皮中的脂溶性有效成分华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的乙醇回流提取工艺.方法 建立HPLC法测定蟾皮提取物中两种有效成分的含量,采用正交试验设计,以乙醇浓度、提取时间及加醇倍数为因素,以浸膏得率、两种有效成分含量为评价指标,考察蟾皮乙醇煎煮回流提取方法,结合方差分析确定佳提取工艺.结果 在0.35～5.6μg ·ml-1范围内,华蟾酥毒基线性方程:A =36793C +743.9(r =0.9990,n=6),平均加样回收率为97.77％;在0.30 ～4.8 μg ·ml-1范围内,酯蟾毒配基回归方程:A =28 149C +2084.5(r=0.9990,n=6),平均加样回收率98.31％.乙醇煎煮回流法各因素影响顺序为:乙醇浓度＞提取时间＞加醇倍数,确定优提取工艺为A3B1C1.结论 乙醇浓度是影响蟾皮中脂溶性成分提取工艺的主要因素,采用多指标综合评价法优化蟾皮脂溶性成分提取工艺合理、可行.
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蟾皮化学成分的分离与结构鉴定
蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮,在我国民间多用来治疗原发性肝癌、肺癌、肠癌等,其水溶性成分制剂华蟾素注射液临床上用于消化道中晚期癌症,疗效确切,体外抗肿瘤活性筛选也表明蟾皮水提取物对结肠癌细胞HCT-8、肺癌细胞A-549生长均有明显的抑制作用.为了阐明其活性成分,对其水溶性成分进行了系统研究,采用Sephadex LH-20、硅胶柱色谱结合结晶法,从其水提物中分离得到6个化合物,分别鉴定为4-氨基-3-羟甲基-环辛酰胺骈四氢-α-呋喃酮(蟾蜍环酰胺B,I)、蟾蜍环酰胺C(II)、蟾蜍噻咛(III)、去氢蟾蜍色氨氢溴酸盐(IV)、辛二酸(V)和丁二酸(VI),其中化合物I和II为新化合物.
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蟾皮提取液浓缩过程中吲哚类生物碱等多指标近红外快速检测研究
目的 采用近红外透射光谱法,进行蟾皮提取液浓缩过程中密度、含水率和吲哚类生物碱的快速检测,实现浓缩过程的状态监测和质量控制.方法 采用偏小二乘回归(PLSR)建立不同光程近红外光谱与各指标实际测定值之间的定量校正模型,并对浓缩过程中的未知样品进行预测来考察模型的适用性.结果 所建立的不同光程下密度、含水率和吲哚类生物碱模型的相关系数(r)均达到0.988 9,预测相对偏差(RSEP)小于10％,相对分析误差(RPD)大于3,说明模型具有较好的稳定性和预测精度.此外,2 mm光程下的密度和含水率模型优于5 mm,而对于吲哚类生物碱模型则是5 mm光程略优,可见光程对近红外光谱的影响并不是光程越长或越短越好,需要通过测试及对比分析确定.结论 研究结果表明,利用近红外透射光谱分析技术可以实现蟾皮提取液浓缩过程中密度、含水率和吲哚类生物碱浓度这3个关键质控指标的同时快速检测.
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中药材蟾皮及其混伪品的DNA条形码鉴定研究
目的 利用COI序列对中药材蟾皮及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究,为蟾皮药材的快速准确鉴定提供新的技术手段.方法 收集16个不同地区的蟾皮药材、基原动物及其混伪品总计6个种54份样本,提取总DNA,进行PCR扩增及双向测序,测序结果采用CodonCode Aligner V 4.2进行拼接校对,运用MEGA5.0进行比对分析,计算种内及种间Kimura-2-Parame-ter(K2P)遗传距离并构建系统发育树.结果 蟾皮两个基原物种的种内大K2P遗传距离均远远小于其与混伪品的种间小K2P遗传距离.NJ树图显示,蟾皮药材的两个基原物种及其混伪品分别聚为独立一支,得到了很好区分,并显示出良好的单系性.结论 应用COI序列作为DNA条形码能够准确有效地鉴别中药材蟾皮及其混伪品.
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中华大蟾蜍蟾酥与蟾皮化学成分的比较分析
目的:比较蟾酥与蟾皮的化学成分.方法:采用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC).结果:蟾酥及蟾皮中的二烯内酯成分大多数相同,但蟾酥中的种类少而含量更集中;吲哚生物碱类有4个主要成分相同,另一吲哚生物碱脱氢蟾蜍色胺,在蟾皮中的相对含量较高,而蟾酥中很低;且初步判断蟾酥中甾醇类主要为β-谷甾醇,而蟾皮中主要为胆甾醇和胆甾醇棕榈酸酯.结论:蟾酥与蟾皮化学成分存在差异.
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蟾皮华蟾毒配基组分体外对肿瘤及正常细胞株的抑制作用
[目的]测定蟾皮第18组分(F18)的化学成分并考察其体外对不同细胞株的抑制作用.[方法]通过质谱法对已分离的F18进行测定,采用噻唑蓝法(MTT法)检测F18对人SW480、SW620、BGC823肿瘤细胞株、人L02、CIK正常细胞株及鼠C26、CT26、4T1肿瘤细胞株的抑制作用,CCK-8法检测F18对SW620、L02、CIK在不同时间点的细胞存活率,后流式细胞术检测F18对SW620细胞周期的影响.[结果]经鉴定蟾皮F18的主要成分为华蟾毒配基,故将蟾皮F18命名蟾皮华蟾毒配基组分(CFSB).CFSB对SW480、SW620、BGC823、L02、CIK、C26、CT26、4T1细胞的IC50值分别为1.10、1.15、1.55、4.85、2.63、21.22、31.39、20.75 mg/L,对SW620、L02、CIK细胞存活率呈时间依赖性.流式细胞术测定浓度在2 mg/L的CFSB干预SW620细胞24 h后其S期、G2/M期细胞比例分别由36.41%增至55.73%、10.89%增至16.95%.[结论]CFSB对肿瘤细胞和正常细胞的增殖均有抑制作用,可使SW620细胞周期阻滞在S期和G2/M期.
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蟾皮提取物固体脂质纳米粒的制备工艺研究
[目的]优选蟾皮提取物固体脂质纳米粒的制备工艺.[方法]采用探头超声法制备蟾皮提取物固体脂质纳米粒,以单因素考察和均匀设计筛选处方及工艺,并考察其包封率和载药量.[结果]佳工艺:ATO 1 00 mg、大豆卵磷脂300 mg、药物300mg加入到5％P188 42 rnl,0.5％TWeen-80 8 ml乳化150 min.[结论]该工艺适合蟾皮提取物固体脂质纳米粒的制备.
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蟾皮提取分离方法及有效成分的研究进展
蟾皮又称干蟾皮,通常为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥表皮[1].现代医药学研究表明蟾皮中存在多种有效的化学成分,可用于治疗小儿疳积、慢性气管炎、咽喉肿痛、痈肿疔毒等病症[2].近年来在我国多用于治疗原发性肝癌、肺癌、肠癌等,其水溶性成分制剂华蟾素注射液临床上用于消化道中晚期癌症和乙型肝炎,疗效确切,体外抗肿瘤活性筛选也表明蟾皮水提取物对结肠癌细胞HCT-8、肺癌细胞A-549生长均有明显的抑制作用[3].近年来有关蟾皮有效成分的提取、分离及鉴定研究活跃,现将有关研究进展做一综述,以供参考.
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皮的药用(十四)
蛤蟆皮蛤蟆皮又称蟾皮、癞蟆皮,为蟾蜍科动物中华大蟾蜍、黑眶蟾蜍的外皮.原动物蟾蜍,俗称癞蛤蟆,为两栖动物.癞蛤蟆体表有许多疙瘩,内有毒腺.干蟾具有破症结、行水湿、解毒、止痛、开窍、散肿之功,用于治疗疗疮、发背、阴疽瘰疬、恶疮、症瘕癖积、臌胀、水肿、小儿疳积和慢性支气管炎等症.蛤蟆皮是蟾酥浆液的表皮包衣,几千年来,人们只知道蟾蜍能蜕衣,但始终拾不到蟾衣.
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HPLC法测定蟾皮中蟾毒配基类成分的含量
目的 用HPLC法测定蟾皮中蟾蜍灵、脂蟾毒配基、华蟾蜍精等成分的含量.方法 样品经乙醇室温浸渍提取,采用HPLC法测定.色谱柱为DiamonsilTM C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-乙腈-水(体积比为4∶ 1∶ 5),流速为1.0 mL · min-1,检测波长为296 nm,柱温为40 ℃.结果 蟾蜍灵、脂蟾毒配基和华蟾蜍精分别在0.084 8～0.508 8、0.088 4～0.530 4和0.200 0～1.200 0 μg内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数r分别为0.999 9、0.999 2和1.000 0.蟾蜍灵、脂蟾毒配基和华蟾蜍精的平均回收率分别为99.3%、99.6%和99.0%,RSD分别为0.5%、0.2%和0.6%(n=9).结论 HPLC法可用于蟾皮中蟾蜍灵、脂蟾毒配基和华蟾蜍精的含量测定.
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中华大蟾蜍皮无机元素初步分析
目的:对中华大蟾蜍皮中的无机元素进行分析研究并对其中6种元素进行含量测量.方法:采用原子发射光谱法进行定性,并用等离子体发射光谱法对其中6种金属元素进行定量.结果:钙是中华大蟾蜍皮中含量高的无机元素.
