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巴戟天多糖对体外培养成骨细胞核心结合因子α1mRNA表达的影响
目的:观察巴戟天多糖对成骨细胞核心结合因子α1(Cbfα1)表达的影响,并与巴戟天水提物相对照,阐述巴戟天补肾阳,强筋骨作用的实质.方法:取24h内新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,用巴戟天多糖及巴戟天水提物药物血清进行体外培养,72h后提取成骨细胞总BNA进行RT-PCR检测核心结合因子α1mRNA相对表达量.结果:巴戟天水提物组(1.3582±0.0966)与巴戟天多糖组(1.9073±0.1280)Cbfα1mRNA与对照组(0.7347±0.0327)相比具有非常显著差异,且巴戟天多糖组非常显著优于巴戟天水提物组.结论:巴戟天水提物与巴戟天多糖均能显著提高成骨细胞Cbfα1mRNA的表达,且巴戟天多糖的这种作用优于巴戟天水提物.提示巴戟天多糖是巴戟天提高成骨细胞(OB)活性的有效成分之一.
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肾系膜细胞在补肾药物基础上进一步上调成骨细胞collagen Ⅰ和cbfα1基因表达
目的:观察系膜细胞是否影响补肾药物对成骨细胞的作用.方法:空白组大鼠灌服蒸馏水,药物组大鼠以熟地鳖甲1:1配比制成浸膏,3.3g浸膏/kg体质量/d灌服,3d后取血离心,获得无药血清和熟地鳖甲含药血清.无药血清、熟地黄鳖甲含药血清及肾系膜细胞处理的熟地鳖甲含药血清作用于成骨细胞3d,MTT法观察成骨细胞增殖率,实时荧光定量PCR检测成骨细胞Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)和核心结合因子α1 (cbfα1)基因表达.结果:熟地黄、鳖甲含药血清可促进成骨细胞增殖,经肾系膜细胞处理后的含药血清进一步促进细胞增殖(P＜0.05),荧光定量PCR显示含药血清组成骨细胞collagen Ⅰ和cbfα1基因表达量明显上调(P＜0.05),经肾系膜细胞处理后的含药血清2种基因表达量进一步增加(P＜0.05).结论:肾脏固有细胞——肾系膜细胞可在补肾药物基础上进一步促进成骨细胞的增殖和成骨相关基因的表达.
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大鼠股骨骨折合并脑外伤时HIF -1α及 Cbfα1的血清表达及意义
目的：探讨大鼠股骨骨折合并脑外伤时低氧诱导因子-1α（HIF -1α）及核心结合因子α1（Cbfα1）在血清中的表达及意义。方法选用70只3月龄健康 SD 大鼠，随机分为假手术组（A 组），股骨骨折组（ B 组），脑外伤组（C 组）和骨折合并脑外伤组（D 组），分别进行造模。造模术后24 h 取 C、D 组脑组织行苏木素-伊红染色判断脑外伤程度。1 d、3 d、1周、2周、3周、4周、5周通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组 HIF -1α及 Cbfα1的血清表达。结果B、C、D 组内不同时间段 HIF -1α及 Cbfα1表达比较，差异有显著性（ P <0.05）；同一时间段 B、C、D 组表达均明显高于 A 组，D 组高于 B、C 两组，差异均有显著性（ P <0.05）。结论 HIF -1α及 Cbfα1在大鼠骨折和脑外伤后均有较明显的表达，在骨折合并脑外伤后表达更加突出，这可能是造成脑外伤后加速骨折愈合的重要因素之一。
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MC3T3E1细胞分化过程中Cbfα1及相关基因的表达
目的研究在小鼠前成骨细胞MC3T3E1诱导成骨过程中,总Cbfα1、Cbfα1两种亚型Cbfα1/P56、Cbfα1/P57及碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白和骨桥素在前成骨细胞成熟过程中的变化.明确Cbfα1、Cbfα1亚型及相关基因表达与成骨细胞分化的关系,探求与成骨细胞成熟更密切相关的Cbfα1亚型,为进一步的Cbfα1亚型研究提供基础.方法MC3T3E1细胞在含β-甘油磷酸钠,抗坏血酸的培养基中培养22 d,在细胞培养的不同时间(0,4,10,14,18,22 d),用α-磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶(ALP)活性;Van GieSon苦味酸酸性复红染色法染色细胞Ⅰ型胶原;茜素红染色观察矿化结节形成;半定量RT-PCR检测总Cbfα1 mRNA及Cbfα1/P56、Cbfα1/P57 mRNA和Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素mRNA的表达;用Western-blot检测Cbfα1蛋白的表达.结果MC3T3E1细胞在β-甘油磷酸钠存在的情况下,培养第18 d开始出现矿化,第22 d Ⅰ型胶原染色及茜素红染色均观察到明显矿化结节形成.随MC3T3E1细胞的分化,Cbfα1 mRNA的表达量逐渐增高,Cbfα1/P57 mRNA在第18和22 d的表达量明显增高,Cbfα1/P56 mRNA无变化.Cbfα1蛋白随MC3T3E1细胞的分化,表达量逐渐增高.同样,随MC3T3E1细胞分化,Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥素和骨涎蛋白mRNA的表达量逐渐增高.ALP活性0～10d逐渐增高,10 d后逐渐下降.结论在MC3T3E1细胞的分化过程中Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素mRNA随MC3T3E1细胞的分化表达逐渐增高.Cbfα1 mRNA及Cbfα1蛋白的表达随细胞的分化逐渐增高,与其他成骨特异性基因的变化趋势一致,并以Cbfα1/P57 mRNA亚型为主.Cbfα1/P57亚型的表达与成骨分化的关系更密切,在进一步的与成骨细胞分化有关的Cbfα1亚型研究应以Cbfα1/P57亚型为主.
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Cbf与骨代谢
核结合因子(Cbf)是一个与runt基因高度同源的转录因子家族,Cbfα1促进成骨细胞分化并影响分化后成熟成骨细胞的功能,促进软骨细胞成熟和破骨细胞的生成.Cbfβ对维持正常骨骼发育也有作用.Cbfα1调节多种成骨基因的表达,同时本身也受多种因素的调控.对Cbfα1调节的基因及调节Cbfα1的基因的进一步研究,将会为探讨骨代谢疾病的发生机制及相关治疗带来新的方向.
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大鼠骨髓细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核结合因子α1表达增龄性变化与增龄性骨折愈合障碍
背景:有报道随着年龄的增加,骨折愈合的难度加大,可能是由于骨髓间充质干细胞分化为成脂细胞、成骨细胞等时的基因调控不同,但其具体机制尚不清楚.目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ以及核结合因子α1在增龄性骨折愈合过程中的表达情况,以探讨过氧化物酶体增殖物激活受体与核结合因子α1基因的增龄性表达变化与增龄性骨折愈合障碍的联系.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-10/2008-02在中南大学湘雅三医院完成.材料:随机选取雄性3月龄及23月龄SD大鼠各6只.分为高龄组(23月龄)和低龄对照组(3月龄),每组各6只.方法:所有动物左下肢胫骨处安装自制微型外固定延长支架并行中上段横行截骨.术后第2天始每口延长牵综合外固定架2次,0.20 mm/次,牵引期为14 d.术后第15天处死大鼠,无菌条件下分离采集左胫骨标本.主要观察指标:骨折影像学、组织学检查;以反转录一聚合酶链反应检测过氧化物酶体增殖物激活受体与核结合因子α1 mRNA的表达.结果:所有动物均进入结果分析.骨折断端间影像学检查,低龄对照组骨折断端间大量骨痂产生,成骨显著强于实验组;组织学检查,低龄对照组各实验动物均有大量骨痂生长,膜内成骨显著:而老龄组骨痂生长存在明显减弱,断端间仅为纤维连接;反转录一聚合酶链反应检查,低龄组大鼠骨髓中核结合因子α1 mRNA表达明显强于高龄组,而高龄组过氧化物酶体增殖物激活受体mRNA表达则较为显著,且两组间该两种因子的表达差异有显著性意义.结论:不同年龄组大鼠骨折愈合情况存在差异,随着年龄的增加,骨折愈合能力下降:大鼠骨髓中过氧化物酶体增殖物激活受体mRNA与核结合因子α1 mRNA表达水平随年龄增加发生相应变化,提示该两种基因表达水平变化与增龄性骨折愈合障碍存在联系.
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核结合因子α亚单位在糖尿病肾病大鼠肾实质小动脉中表达的意义
目的 观察核结合因子α亚单位1(Cbfα1)在糖尿病肾病(DN) 大鼠肾实质内小动脉上的表达及其变化规律,探讨其对DN血管病变的影响.方法 设对照组和DN组两组,建立链脲佐菌素(STZ)诱导的DN大鼠模型.茜素红染色观察肾实质内小动脉周围钙盐沉积,并分别采用免疫组化及mRNA 原位杂交法检测Cbfα1在肾实质内小动脉上的蛋白表达及基因定位.结果 (1)茜素红染色DN 组第4 ～12周时偶见肾内小动脉少许点状红色钙盐沉积,第24周时可见肾实质内小动脉及周围组织有较多红色点片状沉积;对照组茜素红染色为阴性.(2)DN组肾实质内小动脉Cbfα1蛋白及mRNA 在4 w时已有表达,随时间延长表达逐渐增强,各时间点均明显高于对照组(P＜0.01);对照组各时间点表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Cbfα1是糖尿病血管钙化的重要转录因子及早期生物学标志;肾内小动脉上Cbfα1的表达变化可能参与DN进展.
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牙周再生后正畸牙移动过程中成骨三种因子的表达
目的 研究以骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)作为种子细胞,改良的双相磷酸钙(biaphasic calcium phosphate,BCP)作为支架材料,应用组织工程学方法再生的牙周组织在施以正畸力后发生骨改建的变化过程中成长因子的表达情况.方法 选用雄性成年比格犬6只,体外培养其BMSCs并接种于改良的BCP,随后拔除其双侧上下颌第一前磨牙,实验组于第二前磨牙近中根颊侧制造牙周组织缺损,将体外共培物植入缺损部位,以自身为对照组,不予任何手术处理.牙周再生20周后施以正畸力,以尖牙为支抗,拉第二前磨牙向近中移动,控制正畸力为150 g,于加力后1、2、4周分别处死2只犬,取材.Real-Time PCR及Western印迹法检测再生的牙周组织中Cbfαl、Osterix及Smad4的表达.结果 实验组与对照组Cbfα1、Osterix及Smad4表达趋势相同,程度相似:加力1周时呈阳性表达,2周时达高峰,第4周时阳性表达均减弱但仍高于l周时的表达量,Cbfαl、Osterix及Smad4的阳性表达情况与正常牙周组织相比,差异无统计学意义.结论 应用改良的BCP再生的牙周组织在被施以正畸力后发生牙周组织改建,其变化过程与趋势与正常牙周组织相似.
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骨碎补提取物对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及Cbfα1表达的影响
目的 探讨中药骨碎补对大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化及核心结合因子α1(Cbfα1)表达的影响.方法 采用中药干预培养细胞的方法,利用骨碎补单味药物与培养基联合培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),分为标准培养基组(无血清培养基)、条件培养基组(地塞米松1×10-8 mol/L、β-甘油磷酸钠10 mol/L、VitC 50 μg/mL)、中药1组(骨碎补提取液20 mg/mL)、中药2组(骨碎补提取液2 mg/mL)、中药3组(骨碎补提取液0.2 mg/mL)共5组,采用Ⅰ型胶原免疫组化染色检测骨碎补促BMSCs成骨分化能力,RT-PCR方法进行半定量分析Cbfα1表达.结果 中药1、2、3组BMSCs成骨分化能力及Cbfα1表达均明显优于空白组及条件培养组(P＜0.01),2 mg/mL药物组优于20 mg/mL及0.2 mg/mL药物组(P＜0.05).结论 体外中药骨碎补可促进大鼠BMSCs增殖及成骨分化,加强Cbfα1表达.
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巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程Cbfα1表达的影响
目的:探讨巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程Cbfα1表达的影响.方法:采用经典成骨诱导方法培养BMSCs,分别在3、6、9、12、15、18天通过RT-PCR方法进行半定量分析Cbfα1的表达,然后分A组(巴戟天水提物组)、B组(巴戟天醇提物组)、C组(对照组)、D组(经典成骨诱导)、E组(巴戟天水提物+经典成骨诱导组)、F组(巴戟天醇提物+经典成骨诱导组)培养,在Cbfα1 mRNA的表达强的时间检测上述各组Cbfα1 mRNA的表达.结果:经典成骨诱导方法诱导至第3天的时间点开始观察到Cbfα1 mRNA的表达,并逐渐加强,至第12天达到高峰,15天、18天有所减弱,在Cbfα1 mRNA的表达强的时间点(第12天),A组、B组、D组、E组、F组均较C组的表达强,均有显著性差异,其表达强弱顺序是:F组＞E组＞D组＞B组＞A组＞C组.结论:巴戟天水提物、巴戟天醇提物能使Cbfα1的表达加强,且巴戟天醇提物表达强于巴戟天水提物.
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丹皮酚对蛋白聚糖诱导的小鼠关节炎模型骶髂关节滑膜细胞BMP-2、Cbfα1及Smad1mRNA表达的影响
目的 观察丹皮酚对蛋白聚糖诱导的小鼠关节炎模型骶髂关节滑膜细胞BMP-2、Cbfα1及Smad1mRNA表达的影响,初步从分子水平探讨丹皮酚治疗强直性脊柱炎的机理.方法 将40只BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组和丹皮酚组,每组10只.除正常组外,其余三组采用完全弗氏佐剂+蛋白聚糖腹腔注射建立蛋白聚糖诱导的BALB/c小鼠关节炎模型.实时荧光定量PCR法检测丹皮酚对滑膜细胞BMP-2、Cbfα1及Smad1 mRNA表达变化的影响.结果 与正常组比较,模型组的BMP-2、Cbfα1和Smad1基因表达明显升高(P＜0.01);与模型组比较,柳氮磺吡啶组的BMP-2、Cbfα1和Smad1基因表达差异无统计学意义(P＞0.05),而丹皮酚组的基因mRNA表达具有显著差异(P＜0.05).结论 丹皮酚能显著抑制强直性脊柱炎病理性骨化,且这种抑制作用与下调滑膜细胞BMP-2、Cbfα1和Smad1基因表达,从而阻断BMP/Smad成骨信号通路有关.
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2型糖尿病大鼠骨髓腔内PPARγ和Cbfα1 mRNA的表达与骨折愈合障碍的关系
目的:探讨2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)和核心结合因子α1(core binding factor alpha 1,Cbfα1)表达的变化与2型糖尿病骨折愈合障碍之间的关系.方法:雄性SD大鼠随机分为对照组(n=15)和实验组(n=15)分别给予普通饲料、高糖高脂饲料喂养.8周后摘眼球取血,两组分别腹腔注射枸橼酸盐缓冲液和链脲佐菌素(STZ,35 mg/kg).2周后再次摘眼球取血,并建立大鼠左胫骨牵引成骨模型,牵引14 d后处死动物,收集血液及左胫骨,无菌分离双侧股骨.X线摄片比较两组胫骨牵引间隙内骨痂的形成情况.组织学观察牵引骨痂内微骨柱(MCF)与初始基质前沿(PMF)及骨折两端髓腔内脂肪细胞的形成情况,并计算骨折两端髓腔内脂肪细胞与骨髓腔面积百分比.RT-PCR法检测两组动物股骨骨髓腔内PPARγ和Cbfα1 mRNA的表达.结果:8周后实验组大鼠血清甘油三酯较对照组明显升高(P＜0.01),血清总胆固醇较正常组升高(P＜0.05),空腹血糖、血胰岛素水平无明显差异(P＞0.05).10周后实验组大鼠空腹血糖、血清甘油三酯较对照组明显升高(P＜0.01),血清总胆固醇较正常组升高(P＜0.05),血胰岛素水平无明显差异(P＞0.05),2型糖尿病大鼠模型建立.与对照组比较,2型糖尿病组大鼠X线摄片显示骨折断端之间牵引骨痂形成明显减少,骨痂组织学检查表现为MCF排列紊乱,PMF浅染;骨折两端髓腔内脂肪细胞及脂肪细胞占骨髓腔面积百分比明显增加(P＜0.01);RT-PCR法检测显示双侧股骨骨髓腔内PPARγ mRNA表达上调(P＜0.05), 而Cbfα1 mRNA的表达下调(P＜0.05),而对照组则相反.2型糖尿病对早期骨折愈合表现为明显的抑制作用.结论:2型糖尿病大鼠骨折愈合障碍可能与2型糖尿病条件下骨髓腔内PPARγ mRNA表达增加而Cbfα1 mRNA的表达受抑制有关.
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rhBMP-2对SD大鼠MSCs骨向分化的影响及机制研究
目的：通过观察重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）对骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖、骨向分化能力的影响，以及对内源性因子TGF-β1、Smad4和下游细胞因子Cbfα1的作用，阐释其对MSCs骨向分化影响可能的作用机制．方法：运用全骨髓贴壁法分离、纯化大鼠MSCs；运用MTT法检测质量浓度分别为0、5、10、20、40、80、100 ng/mL rhBMP-2对SD大鼠MSCs增殖活性的影响；以碱性磷酸酶（ALP）活性及ALP染色阳性率确定rhBMP-2的佳促MSCs骨向分化浓度，并以该浓度对MSCs骨向分化进行干预．按是否添加经典成骨诱导液将实验分为：空白组，经典组，rhBMP-2组，rhBMP-2＋经典组．通过检测ALP、I型胶原（Col I）、骨钙素（BGP）和钙化结节的表达，以评价各组骨向分化能力；通过检测TGF-β1、Smad4、Cbfα1 mRNA的表达，以评价各组促MSCs骨向分化的作用机制．结果：rhBMP-2的佳促MSCs增殖质量浓度为80 ng/mL，佳促MSCs骨向分化质量浓度为40 ng/mL．经典组和rhBMP-2诱导各组均能促进MSCs骨向分化，刺激TGF-β1分泌，并上调Smad4、Cbfα1 mRNA的基因表达，而TGF-β1在早期分泌量高，提示其可能在MSCs早期骨向分化过程起重要作用．结论：rhBMP-2诱导各组均有促MSCs骨向分化的作用，可能是通过促进TGF-β1的分泌，启动TGF-β超家族/Smads信号通路调控MSCs的骨向分化．
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rhBMP2作用下人牙周膜成纤维细胞中cbfα1的表达研究
目的:本实验通过反转录聚合酶链反应,测定不同浓度的重组人骨形成蛋白2(rhBMP2)对人牙周膜成纤维细胞中cbfαlmRNA在不同作用时间点表达,了解rhBMP2对骨改建过程的调控.方法:原代培养人牙周膜成纤维细胞,取生长良好的第6代细胞,分别用25ng/ml、50ng/ml及100ng/ml的rhBMP2作用于细胞,于作用1、3、5、7天后收集细胞.反转录聚合酶链反应检测各组细胞4个时间作用点cbfα1 mRNA含量,PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳后,采用Image Pr0 Plus5.0图像分析软件对电泳胶带亮度进行分析.结果:不同浓度rhBMP2对cbfα1mRNA的表达均表现为初期降低,而后明显增高,至峰值后回落.不同浓度对cbfα1 mRNA表达上调的峰值没有明显差异.100ng/ml和50ng/ml的rhBMP2浓度组能够较快地上调cbfα1mRNA表达至峰值,然后100ng/ml组表现为缓慢下降,50ng/ml组迅速回落;25ng/ml组较慢上调cbfα1mRNA的表达至峰值后,迅速回落.结论:①根据实验各组中cbfα1的表达变化,提示笔者BMP2可以上调HPDLfs中cbfα1的转录水平,并且对cbfα1的表达调控主要为启动作用,cbfα1的表达增高幅度似乎与rhBMP2浓度并不相关.②高浓度组对cbfα1的上调作用迅速而持久,低浓度组的作用则相对迟缓而短暂.提示笔者BMP2可能通过上调cbfα1的表达而促进HPDLfs向成骨细胞转化.
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不同表面特性种植体对成骨细胞增殖及IL-6、Cbfα1 mRNA表达的影响
目的：探讨不同表面特性种植体对成骨细胞增殖及IL-6、Cbfα1 mRNA表达的影响。方法：用机械磨光（PT）、喷砂酸蚀（SLA）、阳极氧化（AD）法制备3种不同表面的纯钛标准试件，SEM观察表面形貌并分析表面元素构成；接触角测量仪检测各组表面静态水接触角；将成骨细胞（MC3T3-E1 Sub-clone 14）培养于试件表面，细胞培养板为对照，MTT法检测接种1、3、5、7 d细胞增殖率，RT-qPCR法检测接种6、12、24 h白细胞介素6（IL-6）和核心结合因子（Cbfα1）mRNA表达。结果：PT组表面呈机械划痕，SLA组呈大小、深浅不一的窝洞，AD组呈较均匀的圆孔状，3组表面主要元素分别为Ti、Ti／Al、Ti／O。3组表面静态水接触角分别为54．47°±3．33°、75．42°±8．32°、38．91°±4．00°（P＜0．05）；MTT显示各实验组细胞增殖率均低于对照组（P＜0．05），且AD＞PT＞SLA（P＜0．05）；RT-qPCR显示在同一时间点各实验组IL-6 mRNA表达下调、Cbfα1 mRNA的表达上调（P＜0．05），且AD＞SLA＞PT（P＜0．05）。结论：AD相对PT及SLA表面能促进成骨细胞增殖、下调IL-6 mRNA表达及上调Cbfα1 mRNA表达，提示AD种植体表面在种植早期可获得更好更快的骨结合。
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Satb2和Cbfα1基因在人牙龈成纤维细胞中的表达
目的:观察Satb2和Cbfα1在人牙龈成纤维细胞(HGFs)中的表达,为进一步研究二者在牙周组织再生中的作用奠定基础.方法:体外组织块法培养HGFs,并观察其形态和生长方式；同时采用RT-PCR和Western blot方法检测HGFs中Satb2和Cbfα1的表达.结果:体外培养的HGFs中hSatb2和hCbfα1 mRNA均呈阳性表达,但在蛋白质水平只检测到hSatb2蛋白的表达.结论:Satb2和Cbfα1在HGFs中有不同程度的表达,但能否作为刺激HGFs骨向分化的有效生长因子尚需进一步研究.
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成骨特异性转录因子Cbfα1
0引言随着老龄社会的到来,骨质疏松患者数成逐年增长趋势.人们在初对破骨细胞分化和功能的分子机制研究较多,并以此为基础开发出以抑制骨吸收为目的的治疗骨质疏松的药物.到90年代,发现Cbfα1(core-bindingfactor α1)是促进骨发育和骨形成的关键因子[1].这一发现为治疗骨质疏松提供了新的思路.现将从Cbfα1的结构、功能和表达调节三方面对其作一综述.
