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防治血管再狭窄的新靶点——缝隙连接蛋白43
缝隙连接是介导相邻细胞间离子和小分子信号物质直接交换的跨膜通道,血管平滑肌细胞中主要表达连接蛋白43(connexin43,CX43).研究表明,CX43表达上调与平滑肌细胞的增殖、迁移及细胞外基质生成密切相关,促使血管损伤后新内膜生成,引起血管再狭窄,提示CX43可能成为血管性疾病治疗的新靶点.本文综述CX43与血管再狭窄之间关系及以CX43为靶点的药物和基因治疗的研究进展.
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丙泊酚对胎鼠神经元凋亡和NMDAR1蛋白及连接蛋白43表达的影响
目的 探讨丙泊酚对胎鼠神经元凋亡和NMDAR1蛋白及连接蛋白43(Cx43)表达的影响.方法 孕18 d左右SD大鼠42只,随机分为3组(n=14):对照组、丙泊酚80 mg·kg-1组和120 mg·kg-1组,每日分别腹腔注射生理盐水7.5 mL·kg-1、丙泊酚80 mg·kg-1和120 mg·kg-1,连续3 d.于d 1注射后2 h,测定血糖(各组2只);d 3注射后2 h,剖宫取胎鼠,采用TUNEL法和免疫组织化学法分别测定皮质神,经元凋亡数和caspase-8蛋白表达;Western blot法和免疫组织化学法分别测定海马CAl区Cx43及NMDAR1蛋白的表达.结果 与对照组和丙泊酚80 mg·kg-1组相比,丙泊酚120 mg·kg-1组凋亡细胞数增加(P＜0.01).与对照组相比,丙泊酚80 mg·kg-1和120 mg·kg-1组海马CA1区Cx43以及NMDARl表达均明显增高(P＜0.05或0.01),丙泊酚120 mg·kg-1组较80 mg·kg-1组对Cx43及NMDAR1蛋白表达的作用更为显著(P＜0.05).结论 孕鼠连续注射丙泊酚对胎鼠发育期中枢神经系统神经元有促凋亡作用,这种作用可能与丙泊酚诱导NMDAR1蛋白及Cx43的表达增加有关.
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间隙连接蛋白43在HSV-tk-GCV系统旁观者效应中的作用
目的:研究细胞间间隙连接蛋白(connexin43,Cx43)与基因治疗中旁观者效应的关系.方法:将不同Cx43表达水平的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)转染tk基因,tk+/tk-细胞按不同比例混合,经更昔洛韦(GCV)作用后,用细胞计数和流式细胞仪检测混合细胞体系生长抑制率.将上述混合细胞接种于裸鼠皮下,腹腔给GCV 15 mg/kg,每日2次,3周后处死,观察皮下CHO细胞结节的大小.结果:体外实验证实tk+/tk-混合细胞经GCV作用后生长受抑制的程度与Cx43表达水平有关,Cx43表达水平高的混合细胞在含有5% tk+细胞时就表现出旁观者效应,而Cx43表达水平低的混合细胞在含有20%tk+细胞时才表现出明显的旁观者效应.实验发现Cx43表达水平高的混合细胞动物皮下种植后经过GCV作用,细胞结节的体积明显小于Cx43表达水平低的混合细胞结节体积.结论:在HSV-tk-GCV系统基因治疗过程中旁观者效应的效率和间隙连接蛋白的表达水平有关.
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间隙连接蛋白connexin43基因在真核细胞中的表达
目的:构建携带间隙连接蛋白connexin43 cDNA的真核表达载体,建立connexin43蛋白高表达细胞株.方法:connexin43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pED4,转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,用甲氨蝶呤(MTX)筛选得到connexin43基因高表达细胞.结果:酶切电泳结果显示载体pED4-Cx43按设计构建.经MTX筛选得到不同抗性的CHO细胞,免疫组织化学方法显示有connexin43蛋白的表达,但表达量有限.细胞间染料传递实验证实不同MTX抗性的CHO细胞间传递小相对分子质量物质的能力有差异.结论:利用载体pED4可以使connexin43基因在真核细胞内表达.
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CMV43CT转基因小鼠心血管发育的形态学研究
目的研究CMV43CT转基因小鼠心血管发育,探讨其用作先天性心脏畸形动物模型的可能性.方法 选用胚胎期(ED)12.5～17. 5 d的CMV43CT胎鼠,经HE染色,观察心脏的形态学变化.对生后不久死亡的CMV43CT纯合转基因小鼠在显微镜下进行大体解剖,观察心脏外形的变化并切片行HE染色.通过FCR方法鉴定基因型,普通C57BL6/SJ小鼠作为对照组.结果所有对照组胎鼠和CMV43CT杂合胎鼠均未见心脏畸形.见62只纯合胎鼠中有14只心脏畸形,占22.6%,主要为圆锥干发育畸形和室间隔缺损.其他畸形包括:心管环化异常及心室肌发育不良.12只生后不久死亡的CMV43CT纯合转基因小鼠大体解剖后发现均有室间隔裂和流出道囊等心脏畸形.切片染色发现左、右室流出道梗阻、房间隔缺损、室间隔缺损、心肌异常肥厚及心肌发育不良等畸形.结论 CMV43CT转基因小鼠存在以圆锥干发育异常为主的心血管畸形,可作为研究先天性心脏病的动物模型.
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Cx43和Pax3蛋白在早期人胎小肠黏膜的表达及意义
缝隙连接(gap junction),又称间隙连接、通讯连接,是由两个相邻细胞之间的连接通道而形成的一种特殊膜结构.Cx43是一种主要的细胞间缝隙连接蛋白,Cx43基因的表达状态与胚胎发育、细胞诱导、分化、生长控制、细胞凋亡等生物过程有着十分密切的关系[1-3].Pax3基因是进化高度保守的Pax基因家族中的一员,其编码的128个氨基酸组成的成对结构域普遍存在于各种生物体内.Pax3作为一种重要的调控基因,其蛋白能够在体外与某些DNA靶序列结合并激活下游报告基因的转录,在胚胎发育过程中对组织和器官的特异化起着重要的调控作用[4].目前关于Cx43和Pax3蛋白在动物和人肠组织中的病理生理机制研究报道较多[5-7],但关于Cx43和Pax3蛋白在早期人胎小肠黏膜层组织细胞发育过程中的表达、分布规律及作用机制的研究,国内外未见文献报道.本文应用免疫组织化学方法,研究早期人胎小肠生长发育过程中,Cx43和Pax3蛋白在小肠黏膜层的分布、变化趋势,探讨两者在小肠黏膜层组织细胞生长发育过程中的作用及意义.
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正加速度重复暴露后大鼠心室肌缝隙连接蛋白43表达及分布的改变
本文旨在探讨不同水平的一周重复多次正加速度(+Gz)暴露后大鼠心室肌缝隙连接蛋白43(connexin 43, Cx43)表达及分布的改变.36只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、+6Gz组和+10Gz组,每组12只.+Gz组大鼠分别暴露于+6Gz和+10Gz各3min,1次/d,共1周,分别于末次暴露后即刻、1d、3d、7d(各3只)取心室肌作免疫组织化学染色和Western blot分析,检测Cx43的表达和分布.免疫组织化学结果显示,+Gz重复暴露可引起大鼠心室肌Cx43分布方式明显紊乱,Cx43在心肌细胞侧-侧连接处的表达明显增加,在心肌细胞端-端连接处的表达减少.Western Blot结果显示,+6Gz组与+10Gz组的Cx43蛋白表达量于末次暴露后即刻、1d、3d、7d与对照组相应时刻相比均明显减少(P<0.001),以暴露后即刻减少为明显,且随着+Gz暴露时间的延长,表达逐渐恢复,但在暴露后7d,两组的Cx43表达量仍未恢复至对照组水平.Cx43蛋白表达的上述改变在+10Gz组比+6Gz组更为显著.以上结果提示+Gz重复暴露可引起大鼠心室肌Cx43表达量的一过性减少,分布方式明显紊乱,这种改变很可能是+Gz致心律失常发生的重要原因之一.
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缝隙连接蛋白Cx43在SD大鼠电点燃癫痫模型中的表达
目的 探讨缝隙连接蛋白(Cx)在癫痫形成中的作用.方法 将32只雄性SD大鼠随机分为4组,分别造模.观察SD大鼠行为,记录脑电图.通过免疫蛋白印迹的方法检测Cx43在大鼠海马区的表达变化.通过药物对癫痫电点燃模型成模过程的干预来观察癫痫形成与缝隙连接蛋白间的关系.结果 模型组大鼠出现癫痫发作.蛋白印迹显示Cx43的表达异常增高.药物干预的2组SD大鼠模型痫性发作滞后,发作频率降低,程度减轻,痫性脑电波波幅降低,蛋白印迹显示Cx43的表达增高受到抑制.结论 缝隙连接蛋白是癫痫形成的物质基础.抑制Cx43的过度表达,减少异常缝隙连接的形成,癫痫形成也受到抑制,从而预防癫痫产生.
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心肌缝隙连接蛋白43侧膜化机制的研究进展
背景 缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)是心肌缝隙连接的主要结构,多种心脏病理过程(如缺血/再灌注等)均可使Cx43重分布至侧膜而发生侧膜化.这种侧膜化使缝隙连接脱耦连,导致折返性心律失常,严重影响心脏的功能.目的 旨在从Cx43转运及定位过程来阐述心肌Cx43侧膜化的分子机制.内容 Cx43侧膜化与闰盘处N钙黏蛋白、桥粒、紧密连接蛋白-1(zonulaoccludens-1,ZO-1)等连接蛋白(connexins,Cxs)的解耦连,以及细胞骨架蛋白介导的Cx43重定向转运密切相关;此外,Cx43的磷酸化、乙酰化也参与了侧膜化的过程.从Cxs、细胞骨架蛋白、磷酸化、乙酰化4个方面就Cx43侧膜化的分子机制展开具体讨论.趋向 为进一步研究Cx43侧膜化机制及临床治疗折返性心律失常提供相关思路及分子基础.
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缝隙连接蛋白43与心肌缺血/再灌注损伤机制的研究进展
背景 研究表明,心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的发病机制与氧自由基过量产生、钙超载、线粒体损伤及心肌细胞凋亡等密切相关,新研究发现缝隙连接(gap junction,GJ)也参与心肌I/R损伤. 目的 现主要针对GJ连接蛋白(connexin,Cx)43与心肌I/R损伤的关系作一综述. 内容 Cx43在心肌I/R损伤中参与心肌保护作用,其机制可能与钙超载、在线粒体中的分布及细胞凋亡等因素相关. 趋向 未来研究需要进一步探究Cx43与心肌细胞凋亡之间的关系,同时为临床实际工作提供依据.
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TGF-β1对大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白43介导缝隙连接通讯功能的影响
目的:观察转化生长因子TGF-β1对成年大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白Cx43表达以及由Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能的影响,旨在探讨TGF-β1对Leydig细胞的影响是否与其改变细胞间GJIC功能相关. 方法:将原代培养纯化的Leydig细胞分为6组:实验组分别以1、2、5、10 ng/ml的TGF-β1处理细胞20h,空白对照组以含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液处理细胞,部分实验中以GJIC抑制剂甘珀酸(Carbenoxolone)处理细胞作为阳性对照组.采用免疫荧光法和Western印迹观察Cx43在细胞中的定位和表达变化,用荧光漂白恢复实验(FRAP)检测细胞间GJIC功能的改变. 结果:Cx43表达呈斑点状散在分布于Leydig细胞的胞质和胞膜中,TGF-β1处理20 h后,Cx43在胞质中的表达强度随着TGF-β1浓度的增加较空白对照组明显增强,而其在胞膜中的表达则无明显改变.Western印迹结果显示磷酸化状态的Cx43随着TGF-β1浓度增加表现出较空白对照明显增强的趋势(P＜0.05),而非磷酸化状态则无显著差异.FRAP结果显示经5 ng/ml TGF-β1作用20 h后细胞内荧光强度较空白对照明显减弱,具有显著性差异(P＜0.01),且其平均荧光恢复率仅为(43.58±1.87)％.结论:TGF-β1可显著下调Leydig细胞间的GJIC功能,这种抑制作用可能通过增加其连接蛋白Cx43在细胞质中的表达,提高其磷酸化水平来实现.
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糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎组织内Cx43和eNOS表达的研究
目的:探讨糖尿病(DM)性勃起功能障碍(DMED)与阴茎组织中连接蛋白(Cx43)和eNOS水平变化的相关性.方法:25只SD大鼠腹腔内注射四氧嘧啶建立DM模型,8周后注射阿朴吗啡观察大鼠阴茎勃起情况,筛选出DMED大鼠,应用RT-PCR和免疫组化法分别检测阴茎组织中Cx43和eNOS mRNA表达水平.结果:DMED大鼠阴茎海绵体组织eNOS mRNA表达(0.155±0.157)与DM组(0.508±0.242)比较,显著降低(P<0.01),而Cx43 mRNA则显著升高(0.993±0.157 vs 0.545±0.138,P<0.01),二者存在负相关性(r=-0.987).免疫组化检测也显示DMED组大鼠阴茎组织平滑肌细胞中eNOS蛋白表达减少,而Cx43蛋白水平增多.结论:阴茎组织内eNOS水平下降可能是DM患者发生ED的主要机制之一;同时,Cx43的表达呈代偿性增加,其功能有待进一步探讨.
关键词： 糖尿病 勃起功能障碍 内皮性一氧化氮合成酶 连接蛋白43 -
连接蛋白43与睾丸肿瘤相关性的研究进展
由连接蛋白(Cx)构成,缝隙连接(GJ)是相邻细胞间的一种特殊膜结构,它调控着细胞的增殖和分化.研究表明,在多数肿瘤细胞中缝隙连接功能出现减弱或丧失,这种异常常伴随着连接蛋白表达的改变.连接蛋白43是睾丸组织中主要的连接蛋白,现就连接蛋白Cx43在睾丸肿瘤方面的研究进展作一综述.
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星形胶质细胞缝隙连接蛋白与脑缺血
研究表明,星形胶质细胞缝隙连接(gap junction,GJ)在缺血性脑损伤中起着重要作用,因此GJ可能会有望成为治疗缺血性脑损伤的新靶点.近年来,虽然对星形胶质细胞GJ与缺血性脑损伤的关系进行了广泛研究,但结论并不一致.文章对GJ的结构、分布、功能及其与缺血性脑损伤相关的研究进展进行了综述.
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甲状腺功能亢进性心脏病猝死者左心室心肌连接蛋白43的分布改变
目的:探讨甲亢性心脏病猝死者心肌连接蛋白43 (myocardial connexin 43,Cx43)表达及其与猝死的关系.方法:挑选长江大学医学院病理学教研室2010～2012年尸体解剖案例26例,分为2组,每组各13例.①实验组:男9例,女4例,年龄20～52岁,平均年龄34.7岁,均为甲亢性心脏病猝死.②非心源性死亡对照组:男7例,女6例,年龄22～60岁,平均年龄38.8岁.每例心脏进行常规病理学检查并取材后,运用免疫组织化学和图像分析技术,检测左心室肌的Cx43染色情况.结果:实验组心肌Cx43阳性颗粒数分布于心室肌细胞内或细胞侧-侧连接处；对照组心肌Cx43阳性颗粒数分布于闰盘.定量检测并经统计分析发现,实验组Cx43蛋白染色阳性的面积和与对照组均有非常显著的差异(P＜0.01),而平均光密度比较,两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论:甲亢性心脏病猝死者心室肌Cx43蛋白的分布发生明显改变,甲亢性心脏病的猝死可能与Cx43的分布变化有一定的关系.
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间隙连接蛋白Cx43在卵巢癌中的表达及意义
目的:探讨间隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)在上皮性卵巢癌中的表达及意义.方法:对10例正常卵巢上皮、38例不同分化程度的卵巢浆液性囊腺癌的石蜡包埋切片,用免疫组织化学SP法和计算机图像分析系统检测Cx43蛋白的表达.结果:正常卵巢上皮及卵巢癌组织中Cx43蛋白定位于细胞膜和细胞质中;不同分化程度卵巢癌组织中Cx43阳性表达的相对面积和平均吸光度值均显著低于正常卵巢表面上皮细胞(P＜0.01),而且随着卵巢癌细胞分化程度的下降而显著降低(P＜0.01).结论:Cx43蛋白表达下降与上皮性卵巢癌的发生发展密切相关.
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全反式维甲酸对前列腺癌细胞生长及其连接蛋白43表达的影响
目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对前列腺癌细胞生长增殖的抑制作用及其与连接蛋白(Cx)43之间的关系.方法 不同浓度的ATRA处理体外培养的雄激素非依赖性人前列腺癌细胞株PC3后,分别应用光镜、甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成试验分析细胞生长和增殖的抑制情况;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测PC3细胞ATRA作用前后Cx43的表达.结果 ATRA浓度为(10-6～10-4) mol/L时均可有效抑制PC3细胞的增殖(P＜0.05),光镜下可见细胞凋亡的特征性改变,抑制呈时间-剂量依赖性.ATRA处理前后PC3的Cx43表达量从无到阳性光带出现,且显色带随ATRA浓度增高而增强.结论 ATRA能够抑制前列腺癌细胞的生长和增殖,其机制可能通过上调Cx43的表达来实现的.
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Cx43基因条件敲除小鼠的繁殖、基因型鉴定和骨髓检测
目的 探讨连接蛋白43(Cx43)基因条件敲除小鼠(Cx43KO小鼠)的繁殖、基因型鉴定及其导致的骨髓增生异常机制.方法 将引进的2对转基因小鼠Cx43loxP/loxP和Lyz-Cre/+进行交配饲养和繁殖,选取子一代雌性Cx43loxP/-_Lyz-Cre/+与雄性Cx43loxP/loxP合笼交配,获得Cx43loxP/loxP_Lyz-Cre/+小鼠(即Cx43KO小鼠).提取鼠尾组织基因组DNA,采用PCR方法鉴定小鼠基因型,RT-PCR方法进一步验证Cx43KO小鼠的正确性.结果 Cx43KO小鼠繁殖成功,成功获得Cx43loxP/loxP_Lyz-Cre/+、Cx43loxP/-_Lyz-Cre/+、Cx43loxP/loxP、Cx43loxP/-四种基因型小鼠;其繁殖结果符合孟德尔遗传定律.Cx43KO小鼠骨髓、肝、脾Cx43 mRNA的表达均较杂合型小鼠下降(P<0.05).结论 PCR方法可准确鉴定子鼠的基因型.雌性Cx43loxP/-_Lyz-Cre/+小鼠与雄性Cx43loxP/loxP小鼠交配是获得Cx43KO小鼠的有效途径.
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实验性病毒性心肌炎时穿孔素和连接蛋白43表达的相关性
目的:探讨病毒性心肌炎时穿孔素和心肌细胞缝隙连接蛋白43表达的关系.方法:应用免疫组织化学EnVision法对实验性病毒性心肌炎小鼠心肌组织中穿孔素、连接蛋白43的表达进行观察.结果:正常小鼠心肌中未见穿孔素阳性表达,连接蛋白43在心肌闰盘中呈阳性表达.心肌炎组织中部分浸润的炎细胞穿孔素呈阳性表达.在穿孔素阳性表达处,连接蛋白43表达明显减弱甚至阴性.结论:在病毒性心肌炎时穿孔素直接影响到连接蛋白43的正常表达,是引起连接蛋白43阴性表达及异常表达的主要因素之一.
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肺腺癌组织中Connexin 43、TTF-1的表达与CT肺灌注成像的相关性研究
目的 研究肺腺癌组织中连接蛋白43(Connexin 43)与甲状腺转录因子-1(TTF-1)的表达,并探讨其与CT肺灌注成像的相关性.方法 选择2015年1月-2017年12月我院收治的肺腺癌患者148例为研究对象,对患者的肺内单发结节行CT灌注成像,观察血流量(BF)、血容量(BV)与高增强值(PEI)等灌注参数的变化.运用免疫组化SP法测定Connexin 43、TTF-1在肺腺癌组织及对应的癌旁正常组织中的表达.采用Spearman相关分析探讨Connexin 43、TTF-1表达和患者临床病理特征及灌注参数的关系.结果 肺腺癌组织中的Connexin 43表达阳性率为55.4％,明显低于癌旁正常组织中的Connexin 43表达阳性率100％(P<0.05).肺腺癌组织中的TTF-1表达阳性率为81.8％,明显高于癌旁正常组织中的TTF-1表达阳性率6.1％(P<0.05).Connexin 43表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、pTNM分期均相关(P<0.05);TTF-1表达与淋巴结转移、pTNM分期均相关(P<0.05).148例肺腺癌患者BF为(46.5±9.7)mL·100mg-1·min-1,BV为(10.1±1.8)mL/100g,PEI为(22.4±7.2)HU.相关分析显示,Connexin 43的表达强度与BF、BV均呈负相关(r=-0.503,P<0.05;r=-0.496,P<0.05),与PEI不相关(r=0.135,P>0.05).TTF-1的表达强度与BF、BV均呈正相关(r=0.527,P<0.05;r=0.481,P<0.05),与PEI不相关(r=0.102,P>0.05).Connex-in 43表达强阳性组与弱阳性组的BF与BV值均显著低于Connexin 43表达阴性组(P<0.01).TTF-1表达强阳性组与弱阳性组的BF与BV值均显著高于TTF-1表达阴性组(P<0.01).结论 Connexin 43在肺腺癌组织中阳性表达率较低,而TTF-1蛋白在肺腺癌组织中阳性表达率较高,下调Connexin 43及上调TTF-1蛋白表达与肺腺癌的发生发展密切相关.CT肺灌注成像相关参数值与Connexin 43、TTF-1等肿瘤恶性分子表达水平存在直接相关关系,可将CT灌注成像用于肺腺癌肿瘤分期及治疗效果等方面的评价.
