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导入MDR1建立肝癌耐药细胞系及其动物实验研究
目的 探讨利用转染多药耐药基因(MDR1)方法建立表肝癌耐药细胞系,为深入研究肝癌多药耐药现象提供理想的细胞模型.方法 将前期构建表达mdr1cDNA转染质粒PCI/mdr1转染人肝癌细胞株HepG2细胞,采用G418和阿霉素短暂诱导,筛选出稳定的耐药细胞株HepG2/mdr1；利用RT-PCR、FCM及体内外的耐药性试验对其进行功能检测.结果 与其亲代细胞株HepG2比较,HepG2/mdr1细胞中mdr1mRNA及P-gp表达明显增加,分别为(58.80％±11.80％ vs 24.00％±5.80％)和(10.28±2.09 vs 3.70±1.06),对阿霉素和丝裂霉素的耐药性分别增加了35倍和125倍,体内耐药性也明显增加.结论 利用转基因方法能够成功建立肝癌多药耐药细胞系.
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多药耐药基因在胃癌组织表达的特点及其与P53基因表达相关性分析
目的:分析多药耐药蛋白P-gp、MRP、GST-π、Topo-Ⅱ在胃癌组织表达的特点,探讨P53基因突变和MDR基因激活之间相互诱导、调控和协同作用关系及其可能机制.方法:应用免疫组化检测我院50例胃癌组织中多药耐药蛋白P-gP、MRP、GST-π、Topo-Ⅱ和突变型P53蛋白的表达,SPSS16.0统计软件分析胃癌中P-gp、MRP、GST-π、Topo-Ⅱ阳性表达情况及其与突变型P53蛋白阳性表达的关系.结果:胃癌组织中P-gp、MRP、GST-π、Topo-Ⅱ和P53蛋白的表达率分别为58％(29/50)、40％(20/50)、86％(43/50)、68％(34/50)、44％(22/50).P-gp与胃癌组织TNM分期(P＜0.01)和淋巴结转移(P＜0.02)相关,而与分化程度无相关性(P＞0.05);MRP与胃癌分化程度、TNM分期和淋巴结转移均无相关性(P＞0.05);GST-π与胃癌分化程度和淋巴结转移均相关(P＜0.01),与TNM分期无关(P＞0.05);Topo-Ⅱ与胃癌淋巴结转移有相关性(P＜0.05),与分化程度和删分期无关(P＞0.05);P53与胃癌分化程度、TNM分期和淋巴结转移均无相关性(P＞0.05);P-gp、Topo-Ⅱ与P53表达存在显著相关性(P＜0.01).结论:(1)P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ均与胃癌淋巴结转移有相关性,淋巴结转移的胃癌中P-gp、GST-π表达率较高,而Topo-Ⅱ表达降低,提示伴有淋巴结转移的胃癌化疗容易耐药,预后较差;(2)P-gp与胃癌TNM分期和淋巴结转移有关,伴有淋巴结转移的晚期胃癌P-gp表达增高,提示淋巴结转移和较晚分期是影响胃癌化疗效果和预后的重要因素;(3)胃癌中P-gp、Topo-Ⅱ与P53蛋白表达具有正相关性,提示胃癌中P53基因突变与多个MDR基因激活有协同作用.
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解毒祛瘀方对乳腺癌细胞MCF-7/ADM的耐药逆转作用
目的:研究解毒祛瘀方对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM耐药逆转的作用及机制.方法:以MCF-7/ADM细胞为研究对象,利用噻唑蓝(MTT)比色法检测解毒祛瘀方对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM生长的影响;应用流式细胞术检测肿瘤细胞内罗丹明123(Rh-123)的含量;分别利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测肿瘤细胞内多药耐药蛋白1(MDR1),乳腺癌耐药相关蛋白(BCRP) mRNA及蛋白表达变化.结果:与空白组比较,经1.25,2.5 g·L-1解毒祛瘀方作用后,阿霉素对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM的逆转倍数(RF)分别提升1.7倍和3.0倍(P＜0.05);人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM中Rh-123含量分别提高了1.8倍和2.5倍(P＜0.05),MDRI和BCRP蛋白和mRNA表达水平明显下降(P＜0.05),1.25,2.5 g·L-1解毒祛瘀方MDR1 mRNA表达分别降低35.5％和56.0％(P ＜0.05),BCRP mRNA表达分别降低41.6％和49.5％ (P ＜0.05).结论:解毒祛瘀方可提高人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM对阿霉素的敏感性,逆转该细胞对阿霉素的耐药性,其机制可能与降低MDR1和BCRP蛋白和mRNA的表达,抑制细胞药物外排作用相关.
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龙胆泻肝丸对胆汁淤积大鼠肝脏多药耐药蛋白及中性粒细胞CD18表达影响的研究
目的:从与胆汁分泌有关的转运蛋白及中性粒细胞CD18分子的角度探讨龙胆泻肝丸(LD)清肝胆,利湿热的可能作用机制.方法:将20只大鼠分为4组:对照组,模型组,LD 5.0,2.5 g·kg-1(按生药计算)组.给药组每日ig给药1次,连续8d,对照组和模型组ig等体积的蒸馏水.其中第5天给药1h后,除对照组ig花生油外,其他各组大鼠按100 mg·kg-1 1次性ig α-萘异硫氰酸酯(ANIT)花生油.第8天摘取大鼠肝脏,提取肝脏总RNA,RT-PCR检测多药耐药蛋白MDR1a,MDR1b,MDR2和多药耐药相关蛋白MRP1 mRNA,MRP2 mRNA的表达；眼眶静脉取抗凝血,流式细胞仪测定中性粒细胞CD18表达,血细胞计数仪测定白细胞及粒细胞总数.结果:模型组大鼠肝组织MDR1a,MDR1b mRNA表达显著增加(P ＜0.05,P＜0.01),MDR2 mRNA,MRP2 mRNA分别有表达增加或降低的趋势,MRP1 mRNA的表达无明显变化.LD 5.0,2.5 g·kg-1对胆汁淤积大鼠的肝组织MDR1a,MDR1b,MDR2,MRP1,MRP2 mRNA表达均无明显影响.LD各给药组白细胞总数以及粒细胞总数有下降趋势,CD18荧光强度明显低于模型组(P＜0.05或P＜0.01).结论:龙胆泻肝丸对ANIT诱导的胆汁淤积(类肝胆湿热证)具有利胆保肝作用,其作用机制主要与其抑制白细胞黏附,降低胆管炎症反应,减轻胆管损伤,从而有利于胆汁排泄有关,而与胆管上皮的转运体蛋白分子MDR,MRP关系可能不大.
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大黄酸对Caco-2细胞多药耐药蛋白转运体表达的影响
目的:探讨大黄酸对人结肠腺癌上皮细胞(Caco-2)多药耐药蛋白mRNA表达的影响.方法:用大黄酸作用于Caco-2细胞,采用荧光定量PCR(real time PCR)法检测转运体MRPl-5 mRNA的表达量,数据分析采用2-AACT法.结果:高(5.00 mg·L-1)低(2.50 mg·L-1)质量浓度大黄酸均可以显著上调Caco-2细胞MRP3 mRNA表达(P<0.05或P<0.01);低浓度大黄酸可以显著下调Caco-2细胞MRP5 mRNA表达(P<0.05);大黄酸对MRPI,MRP2和MRP4 mRNA的表达没有显著影响.结论:大黄酸可能通过上调Caco-2细胞MRP3 mRNA的表达和下调MRP5 mRNA的表达而影响其口服药物的生物利用度.
关键词： Caco-2细胞 大黄酸 荧光定量聚合酶链反应 多药耐药蛋白 -
不同浓度葛根芩连水煎液对Caco-2细胞P-糖蛋白及多药耐药蛋白转运体表达的影响
为了检测葛根芩连水煎液对人结肠腺癌上皮细胞Caco-2 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)及多药耐药蛋白(multi-drug resistanceprotein,MRP) mRNA表达的影响,将不同浓度的葛根芩连水煎液作用于Caco-2细胞,采用Real-time PCR检测不同浓度葛根芩连水煎液对Caco-2细胞P-糖蛋白及多药耐药蛋白转运体MDR1及MRP1-6 mRNA的表达量.药液作用12 h后,当质量浓度为5.00 g·L-1时,可显著下调MDR1和MRP1-6的表达;2.50 g·L-1时,可显著下调MDR1,MRP1,MRP2,MRP4,MRP5和MRP6 mRNA的表达;1.00 g·L-1时,仅对MRP2和MRP5 mRNA的表达有显著性影响.结果证明,葛根芩连水煎液可以显著下调Caco-2细胞MDR1及MRP1-6 mRNA表达,且有浓度依赖性.葛根芩连汤可能通过下调Caco-2细胞转运蛋白的mRNA的表达而降低药物外排,增加药物作用时间,从而增大化疗药物的生物利用度.
关键词： Caco-2细胞 葛根芩连汤 荧光定量聚合酶链反应 P-糖蛋白 多药耐药蛋白 -
多药耐药蛋白P-gP170在胃癌中的表达
肿瘤对化疗药物的耐药性,常常影响化疗药物的效果,其耐药机理之一是由多药耐药基因(mdr-1)表达产物P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp 170)增高介导的多药耐药性(multidrugresistance,MDR)[1,2].本文应用免疫组化法检测了133例原发性胃癌P-gp170的表达,探讨其表达与组织学类型、生物学行为间的关系.
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肺耐药蛋白基因和多药耐药相关蛋白基因在急性白血病骨髓细胞中的表达及临床意义
为了研究肺耐药蛋白基因和多药耐药相关蛋白基因在急性白血病骨髓细胞中的表达及其临床意义,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测初治急性白血病、复发难治白血病及正常对照骨髓细胞肺耐药蛋白基因(lung resistance protein, LRP)及多药耐药相关蛋白基因(multidrug resistance protein, MRP)的表达.结果显示,正常对照骨髓细胞LRP表达阴性,初治急性髓细胞白血病(AML)组及复发难治组LRP表达水平与正常对照组相比明显升高,增高的LRP mRNA水平与对初次化疗不敏感及预后差有关,LRP表达阳性患者的完全缓解率明显低于表达阴性者.经直线相关分析发现,LRP表达与MRP表达水平成正相关.结论: LRP可能是一项新的耐药指标,其高表达与急性髓细胞白血病的疗效及预后密切相关,同时检测LRP和MRP的表达可以指导治疗,估计预后.
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胃癌多药耐药蛋白的相互作用蛋白鉴定及分子机制
目的:研究多药耐药蛋白(multidrug resistance protein,MRP)的相互作用蛋白及其对肿瘤耐药性的影响.方法:采用免疫沉淀结合质谱方法分离鉴定MRP的相互作用蛋白,并对其中的耐药相关蛋白之一Annexin A5进行功能研究,Western blot及siRNA干扰技术分析MRP、Annexin A5 蛋白表达的变化、相关性及胃癌SGC-7901细胞的耐药性变化.结果:经免疫沉淀结合质谱方法分离鉴定发现了14个MRP的相互作用蛋白,其中Annexin A5为其中得分高的蛋白;Western blot检测显示耐药细胞株SGC-7901/DDP中MRP、Annexin A5蛋白表达均高于SGC-7901和siRNA-SGC-7901/DDP,siRNA干扰Annexin A5表达后,siRNA-SGC-7901/DDP中MRP 蛋白表达下调,MRP、Annexin A5蛋白在SGC-7901和siRNA-S GC-7901/D DP-之间表达无明显差异;MTT法结果显示经siRNA干扰SGC-7901/DDP后,顺铂、5-Fu和紫杉醇作用后的IC50值明显减少,对其的敏感性分别增加了36倍、17倍和4倍.结论:Annexin A5表达与胃癌细胞耐药有关,是MRP的相互作用蛋白之一.
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依托泊苷对耐药和非耐药肺癌细胞survivin基因、端粒酶活性及其亚基表达的影响
肺癌的耐药机制系多因素参与.以往人们主要注意P-糖蛋白、多药耐药蛋白、肺癌耐药蛋白、谷胱甘肽/谷胱甘肽-S-转移酶、拓扑异构酶Ⅱ以及Bcl-2等在肺癌多药耐药(MDR )中的作用[1],而对端粒酶和新的凋亡抑制蛋白survivin在肺癌MDR发生机制中的作用知之甚少.为此,我们用由顺铂(DDP)诱导的多药耐药A549细胞模型研究依托泊苷(VP16 )对耐药和非耐药肺癌A549细胞株survivin基因、端粒酶活性和端粒酶各亚基表达影响的差异,以进一步探讨肺癌多药耐药的发生机制.
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地塞米松对单层培养的大鼠肝细胞分泌机能的影响
目的研究地塞米松对大鼠肝细胞分泌机能的影响.方法用Seglen 两步灌注法从F344大鼠肝脏中灌注并以低温离心分离肝细胞,然后单层培养.在Willam's E培养基中加入地塞米松,通过位相差显微镜观察细胞形态;并通过荧光染料分泌实验及Rhodamin-Phallodine染色后荧光显微镜观察胆汁分泌机能和细胞骨架的改变.结果培养基中加入地塞米松后,肝细胞毛细胆管样结构扩张,荧光染料在扩张的毛细胆管样结构中聚集,细胞骨架蛋白在毛细胆管样结构周围聚集.结论地塞米松促进大鼠肝细胞胆汁分泌,导致肝细胞毛细胆管样结构扩张.
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胆囊胆固醇结石患者肝细胞MRP2基因表达的半定量研究
新近研究表明,多药耐药蛋白2(multidrug resistance protein 2,MRP2)与胆盐的分泌有关[1].本研究旨在探讨肝细胞中MRP2基因的表达与胆囊胆固醇结石形成之间的关系.
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IGF1和IGF1R及AKT与卵巢癌顺铂耐药相关性研究
目的:检测胰岛素生长因子(IGF)信号通路关键蛋白IGF-1、IGF-1R及Akt在顺铂耐药卵巢癌患者血清中的表达,及其与多药耐药蛋白MRP2的相关性.方法:利用ATP-TCA法对40例卵巢癌标本进行药敏试验,其中16例对顺铂耐药,24例对顺铂敏感.ELISA法分别检测顺铂耐药和敏感组患者血清中IGF-1、IGF-1R及Akt和MRP2的表达,进行相关性分析.结果:IGF-1、IGF-1R及Akt在卵巢癌顺铂耐药组的表达显著高于敏感组,P值均为0.000 1；MRP2的表达卵巢癌顺铂耐药组高于敏感组,P=0.035; IGF-1和IGF-1R有显著相关性,r=0.755,P=0.0001；IGF-1、IGF-1R和Akt有显著相关性,r值分别为0.812和0.643,P值均为0.000 1；MRP2和IGF-1有相关性,r=0.493,P=0.018；IGF-1R与MRP2无相关性,r=0.231,P=0.173; Akt和MRP2无相关性,r=0.274,P=0.106.结论:IGF信号通路关键蛋白IGF-1、IGF-1R及Akt可能参与卵巢癌顺铂耐药,IGF-1与多药耐药蛋白有一定的相关性,IGF-1可能作为卵巢癌靶向治疗的新靶点.
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应用蛋白质芯片检测多药耐药蛋白表达水平
目的探讨蛋白质芯片在检测白血病细胞多药耐药(MDR)蛋白表达中的价值.方法以人红白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为实验研究对象.将3种耐药蛋白:P糖蛋白(P-gP)、多药耐药相关蛋白(MRP1)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)相应的单克隆抗体固定在玻片上形成微阵列,细胞直接与固定在芯片上的耐药抗体阵列反应,电荷耦合器件(CCD)检测反应结果,并与流式细胞术测定的结果进行比较分析.结果在K562细胞中,蛋白质芯片检测到P-gP和BCRP表达率低,MRP1有较高水平的表达;在K562/A02细胞中,P-gP和MRP1均有高水平表达,BCRP表达率低.流式细胞术结果显示,K562细胞P-gP、MRP1和BCRP表达率分别为5.98%±2.19%、95.80%±3.98%和1.03%±0.45%;K562/A02细胞P-gP、MRP1和BCRP表达率分别为92.67%±1.80%、97.18%±1.02%和3.98%±0.37%.经统计学分析,两种方法结果一致(Ρ＞0.05).结论利用蛋白质芯片检测MDR蛋白结果可靠,具有高通量、低成本、制备简单、测定快速的优点.
关键词： 蛋白质芯片 多药耐药蛋白 红白血病细胞系K562 -
多药耐药基因MDR1C1236T多态性与炎症性肠病患者的活性代谢物6-TGNs的相关性
目的 考察多药耐药基因MDRl的单核苷酸多态性(SNP) C1236T与炎症性肠病(IBD)患者服用硫嘌呤类药物后的活性代谢产物6-硫鸟苷酸(6-TGNs)的相关性.方法 有105名患者纳入研究,收集全血提取DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法,进行MDR1 C1236T基因型分析,采用HPLC方法检测红细胞内6-TGNs的浓度,并统计药物不良反应情况.卡方检验分析相关性.结果 相同剂量下,6-TGNs浓度在1236CT/TT型携带者比CC型携带者高(P=0.048)；同时,1236CT/TT型携带者服药后发生不良反应的风险显著高于1236CC型携带者(P=0.045).结论 MDR1 1236 C>T突变与高6 - TGNs浓度及高不良反应发生率密切相关.
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多药耐药基因1基因多态性对硫嘌呤类药物转运的影响及其分子机制研究
目的：研究多药耐药基因1（MDR1）基因多态性对硫嘌呤类药物转运影响的差异及产生差异的机制。方法通过构建野生型及突变型单倍型的MDR1重组质粒并进行细胞转染，考察6-巯基嘌呤在不同MDR1基因型中转运的差异，Westen blot检测不同基因型蛋白表达水平。结果与野生单倍型相比， MDR1突变单倍型外排转运6-巯基嘌呤的活性显著降低（ P＜0.05），但2种基因型的蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），说明该转运差异不能用该转运蛋白表达水平的差异来解释。结论 MDR1不同基因型影响其对硫嘌呤类药物的外排转运，这可能是造成硫嘌呤类药物反应个体差异的原因之一；MDR1不同基因型对药物转运的影响可能不是由蛋白表达水平的差异造成的。
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舒尼替尼对吉非替尼耐药的肺癌细胞的治疗效果及意义
目的 探讨舒尼替尼对吉非替尼耐药的肺癌细胞的治疗作用及意义.方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测舒尼替尼对28例肺癌患者肿瘤组织提取的吉非替尼耐药细胞的增殖抑制作用;CellTiter-Glo法检测舒尼替尼给药后,耐药细胞株对吉非替尼的敏感性;流式细胞术方法检测舒尼替尼作用后吉非替尼耐药细胞中Rh-123的含量;Western blot法检测舒尼替尼给药后吉非替尼耐药细胞中多药耐药蛋白(MDR)、核转录因子κB(NF-κB)及血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达情况.结果 舒尼替尼剂量依赖性的抑制吉非替尼耐药细胞的增殖,IC50值为(6.73±1.57) μmol· L-1;舒尼替尼可显著增加耐药细胞对吉非替尼的敏感性,降低吉非替尼抑制耐药细胞增殖的IC50值,1和2μmol·L-1舒尼替尼作用耐药细胞株的吉非替尼IC50值分别为(38.64±1.29)与(20.37±1.75) μmol·L-1.1μmol·L-1舒尼替尼给药后可显著增加耐药细胞中Rh-123的含量(P＜0.05),荧光密度是对照组的2.44倍;2μmol·L-1舒尼替尼给药后耐药细胞中Rh-123的含量与对照组相比具有显著性差异(P＜0.01),荧光密度是对照组的5.64倍;1和2μmol·L-1的舒尼替尼给药后可显著减少吉非替尼耐药细胞中MDR、NF-κB及VEGF蛋白的表达,并具有剂量依赖性.结论 舒尼替尼可逆转吉非替尼耐药,为临床治疗吉非替尼耐药的患者提供理论依据.
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CYP3A5和MDR1基因多态性与肝移植病人他克莫司浓度/剂量比的关系
目的研究肝移植术后患者的细胞色素P450 3A5酶(CYP3A5)和多药耐药蛋白(MDR1)基因多态性对他克莫司浓度/剂量比的影响.方法记录患者的体重、他克莫司剂量和血药浓度等指标,采用聚合酶链式反应-限制性内切片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对肝移植患者进行基因分型,比较不同基因型患者之间他克莫司的浓度/剂量比.结果 CYP3A5*1/*1和*1/*3型患者的他克莫司浓度/剂量比明显低于*3/*3型患者(P<0.01),MDR1的3435和2677位点各基因型分组之间无明显差异(P>0.05).结论 CYP3A5基因*3多态性与他克莫司血药浓度/剂量比具有显著相关性,*1/*1和*1/*3型的患者拟取得相似的血药浓度要比*3/*3型患者服用更高剂量的他克莫司,用药前检测基因型可以更有效地对他克莫司进行剂量调整.
关键词： 肝移植 他克莫司 细胞色素P4503A5酶 多药耐药蛋白 基因多态性 -
柴贝止痫汤对难治性癫痫大鼠多药耐药蛋白P-gp表达影响的研究
目的 通过比较不同药物干预对多药耐药蛋白P-gp的影响,观察难治性癫痫大鼠脑内P-gp的表达和分布,探讨难治性癫痫多药耐药可能的分子病理机制,及中药复方柴贝止痫汤对其表达的影响.方法 80只Wistar大鼠腹腔注射氯化锂-盐酸匹罗卡品建立难治性癫痫模型,12只同周龄Wistar大鼠作为正常组.筛选出59只造模成功大鼠,随机分为模型组14只,柴贝止痫汤组(15只;8.1 g/kg灌胃),卡马西平组(15只;36 mg/kg灌胃)和联合用药组(15只;柴贝止痫汤和卡马西平联合灌胃).干预2周后观察各致痫组大鼠癫痫发作的平均持续时间、癫痫发作级别,以判定、分析药物的疗效.采用免疫组织化学和蛋白质印迹法,分析、比较P-gp在各组大鼠海马和皮质等部位的表达和分布.结果 与正常组大鼠比较,在难治性癫痫大鼠海马和皮质部位,各致痫组P-gp表达含量均有明显增高,具有统计学意义(P<0.05).结论 柴贝止痫汤联合卡马西平的给药方式对难治性癫痫大鼠的疗效优于单独应用卡马西平及柴贝止痫汤.中药复方柴贝止痫汤具有一定的抑制P-gp药物转运体功能.
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非小细胞肺癌患者肺耐药蛋白和多药耐药相关蛋白表达与预后的关系
肺癌耐药性形成机制,已成为肺癌分子生物学研究热点[1].肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药的原因较多,肺癌耐药机制复杂.肺耐药蛋白(lung resistance protein,LRP)、多药耐药蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)是近年发现的肿瘤耐药相关基因,在肺癌耐药中起着一定的作用.本实验应用免疫组化方法检测LRP、MRP在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达,并进一步探讨与临床的相关性.
