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湿热环境对内毒素诱导杀菌/通透性增加蛋白mRNA表达的影响
为了阐明湿热环境对机体抗病力的影响机理,本实验以兔为实验对象,观察了湿热环境对体内一种重要的杀菌抗内毒素物质-杀菌/通透性增加蛋白mRNA表达的影响.结果:发现湿热环境能使兔在内毒素刺激下杀菌/通透性增加蛋白mRNA表达减少,这可能是湿热致病和湿热证缠绵难愈的病理机制之一.
关键词： 湿热环境 内毒素 杀菌/通透性增加蛋白 -
杀菌/通透性增加蛋白对脓毒症大鼠组织TNF-α表达的影响及意义
目的探讨杀菌/通透性增加蛋白(BPI)对脓毒症动物肝、肺肾组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达及多器官功能障碍的影响与意义.方法采用大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)造成脓毒症模型.动物分为正常对照组(10只)、CLP组(20只)及BPI治疗组(20只).CLP后12h和24h处死动物,分别检测肝、肺、肾组织TNF-α mRNA表达、TNF-α蛋白水平和器官功能指标.结果 CLP后12h动物肝、肺、肾组织TNF-α mRNA表达均显著增强,分别为伤前基础值的2.46倍(P＜0.05)、2.86倍(P＜0.01)、2.27倍(P＜0.01),同时各组织TNF-α水平迅速升高(P＜0.01).重组BPI治疗可不同程度地抑制肝、肺、肾组织TNF-α mRNA表达上调(P＜0.05),12h各组织TNF-α水平显著降低(P＜0.05),均恢复至伤前正常范围.此外,BPI组动物血清丙氨酸转胺酶、肌酐水平在CLP后12h显著低于未治疗组,CLP后24h肺组织髓过氧化物酶活性也明显下降(P＜0.01).结论严重腹腔感染早期应用重组BPI治疗有助于下调TNF-α的过量表达,从而抑制机体过度炎症反应,防止多器官功能障碍的发生与发展.
关键词： 杀菌/通透性增加蛋白 肿瘤坏死因子-α 脓毒症 多器官功能障碍综合征 -
脓毒症大鼠多器官Toll样受体4基因表达的改变及意义
目的探讨脓毒症大鼠肝、肺、肾及小肠组织中Toll样受体4 (TLR4)基因表达的变化规律及其意义.方法雄性Wistar大鼠100只,动物随机分为正常对照组、假手术组、盲肠结扎穿孔(CLP)致脓毒症组和杀菌/通透性增加蛋白(BPI)治疗组.分别检测肝、肺、肾、小肠组织TLR4、TNF-α mRNA表达以及组织、血浆中内毒素水平的改变.结果 CLP后6～12 h肝、肺、肾及小肠组织TLR4 mRNA表达显著升高达峰值(P<0.05或P<0.01);BPI早期治疗可显著降低各组织内毒素水平,CLP后12 h肝、肺、肾、小肠组织和24 h肾组织TLR4 mRNA表达亦明显抑制(P<0.05或 P<0.01).相关分析显示,肝、肺、肾组织TLR4 mRNA表达分别与相应组织及血浆内毒素水平、组织TNF-α mRNA水平均呈显著正相关.结论 CLP后细菌内毒素可迅速侵入血循环和多种组织,它对于诱导体内TLR4 基因表达上调具有显著影响,而TLR4 基因广泛表达可能参与了脓毒症的病理生理过程.
关键词： 多器官功能衰竭 脓毒症 Toll样受体4 肿瘤坏死因子-α 杀菌/通透性增加蛋白 -
严重外科感染患者杀菌/通透性增加蛋白水平的变化规律及意义
目的 观察外科严重感染患者内源性杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的变化规律及其临床意义.方法 筛选外科严重感染患者19例,分别于感染前和感染后第1、3、5、7、14天采集血标本.采用ELISA方法测定血浆BPI、脂多糖结合蛋白(LBP)和白细胞介素-6(IL-6)水平;内毒素含量采用改良基质显色法鲎试验检测.同时检查感染前及感染后第1、3、5、7、14天的中性粒细胞计数,并观察患者预后.结果 与正常对照组比较,脓毒症组患者感染后第1～5天血浆中BPI/LBP比值明显降低(P＜0.01),第7天恢复至正常范围;严重脓毒症组患者感染后第1～7天其比值显著降低(P＜0.01).此外,感染后第1～3天严重脓毒症组血浆中BPI/LBP比值显著低于脓毒症组(P＜0.05).结论 外科感染时机体内源性BPI和LBP水平迅速升高,但BPI的增幅明显低于LBP;感染早期BPI/LBP比值与脓毒症病情的严重程度密切相关.
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腹部大手术后杀菌/通透性增加蛋白的变化规律及意义
目的 观察外科大手术后内源性杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的变化规律及其临床意义.方法 选择拟行腹部大手术患者11例,分别于术前和术后1、3、5、7、14天采集血标本,测定外周血中性粒细胞数的变化,并采用ELISA方法测定血浆BPI、脂多糖结合蛋白(LBP)和IL-6水平,改良基质显色法鲎试验检测血浆内毒素含量.结果 正常对照组血浆中BPI/LBP比值为(0.672±0.083)×10-3,腹部大手术后第1天增高至(1.058±0.074)×10-3(P=0.004),第3天为(1.107±0.061)×10-3(P=0.001),第5天后降至正常范围(P＞0.05).11例患者术前血浆中均未检测到IL-6,腹部大手术后第1天血浆中IL-6水平迅速增高达峰值(27.440±12.144pg/ml,P=0.04),第3天仍处于较高水平(11.530±5.312pg/ml).结论 手术创伤后机体内源性BPI的增幅明显高于LBP,可能有助于控制大手术后内毒素血症的发生及发展.
关键词： 杀菌/通透性增加蛋白 脂多糖结合蛋白 细胞因子类 外科手术 -
BPI-BD3融合抗菌肽修饰C3H10T1/2细胞对小鼠感染创面愈合的影响
目的 观察pAdxsi-BP1-BD3转染C3H10T1/2细胞对小鼠感染创面愈合的影响.方法 使用重组腺病毒载体pAdxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2细胞,并采用RT-PCR及Western blotting进行鉴定.取30只KM小鼠行直径1cm的全层皮肤缺损创面,并接种金黄色葡萄球菌制造感染创面.造模后,随机均分为3组每组10只,T组尾静脉注射pAdxsi-BPI-BD3转染后的C3H10T1/2细胞,C组注射未转染的C3H10T1/2细胞,N组注射等量PBS.通过大体观察、痂下细菌计数、测定创面残留面积、HE染色等来评价BPI-BD3修饰的C3H10T1/2的促愈效果.结果 与其余两组相比,T组痂下菌量较少(P＜0.05),且T组愈合较快,7、14d时,创面残留面积与其余两组相比差异有统计学意义(P＜0.05).HE染色结果显示,与其余两组相比,T组炎症较轻、表皮生长较快.结论 BPI-BD3修饰的C3H10T1/2可以促进金黄色葡萄球菌所致的小鼠感染创面的愈合.
关键词： C3H10t1/2细胞 β防御素 杀菌/通透性增加蛋白 伤口感染 -
一种优化的DNA家族改组方法
目的:优化DNA家族改组方法,增加改组分子库的多样性.方法:以人、猴、兔的BPI23基因为模板,首先将3种基因的PCR产物等量混合后用DNaseⅠ消化,回收50bp左右的片段,再经过无引物和有引物两步PCR反应获得与原基因大小相同的改组分子,将其与载体连接获得改组分子库.随机挑取4个克隆测序观察改组效果.结果:4个克隆均为3种模板基因片段的杂合体,其中3个克隆还包含氨基酸点突变,表明改组分子库多样性较大,改组方法较为成功.结论:该方法的建立为进一步筛选高活性的BPI23分子打下基础,并为改组其他基因家族提供了借鉴.
关键词： DNA改组 体外进化 杀菌/通透性增加蛋白 -
多粘菌素B和杀菌/通透性增加蛋白对烫伤大鼠肠道细菌易位和肿瘤坏死因子α基因表达的影响
目的:比较两种不同内毒素拮抗剂--多粘菌素B和杀菌/通透性增加蛋白(BPI)对大鼠烫伤后肠道细菌易位和组织肿瘤坏死因子α(TNFα)基因表达的影响.方法:采用大鼠35%体表面积Ⅲ度烫伤模型,动物随机分为正常对照组(8只)、烫伤组(24只)、多粘菌素B治疗组(7只)和BPI治疗组(6只).结果:大鼠烫伤后肠道细菌易位率明显上升,伤后8小时细菌易位率达37.1%,与正常对照组比较差异显著(P<0.01);细菌易位率高的器官是肠系膜淋巴结,不同器官易位细菌量无显著性差异;给予烫伤大鼠多粘菌素B和BPI治疗均可不同程度地降低细菌易位率,其细菌易位率分别降至烫伤8小时组的61.7%和53.9%;BPI比多粘菌素B更为有效地降低肠、肾等组织TNFα mRNA表达水平(P均<0.01).结论:多粘菌素B和BPI均可降低大鼠烫伤后肠道细菌易位的发生;BPI较多粘菌素B能更有效地抑制多种组织TNFα mRNA表达.因此,烧伤早期应用BPI治疗对抑制创伤后机体过度炎症反应具有重要意义.
关键词： 灼伤 多粘菌素B 杀菌/通透性增加蛋白 细菌易位 肿瘤坏死因子α -
急性高容量血液稀释对全髋关节置换术患者血浆杀菌/通透性增加蛋白表达的影响
目的 探讨羟乙基淀粉急性高容量血液稀释对全髋关节置换术患者血浆杀菌/通透性增加蛋白(BPI)表达的影响.方法 选择ASAⅠ、Ⅱ级择期行全髋关节置换术患者20例,随机分为羟乙基淀粉组(HES组)和乳酸钠林格液组(LR组),每组各10例.20例患者均采用腰麻-硬膜外联合麻醉,于麻醉后,以20 ml/kg的剂量和30 ml/(kg·h)的速率分别输入6%HES和LR.分别记录手术时间、术中出血量和输血量.分别在麻醉前(T0)、手术开始前(T1)、手术开始后30 min(T2)、手术结束(T3)时采外周静脉血测定BPI含量.结果 HES组术中出血量[(560±90)ml]、输血量[(200±100)ml]显著少于LR组[(810±110)ml与(600±200)ml,t分别为5.562和5.657,P均<0.001].HES组T2、T3时BPI浓度为(8.9±1.6)μg/L和(13.4±1.2)μg/L,显著高于麻醉前[(4.9±1.2)μg/L,P均<0.05)].LR组T2、T3时BPI浓度为(7.3±1.2)μg/L和(9.9±0.8)μg/L,明显高于麻醉前[(5.0±1.1)μg/L,P均<0.05],HES组T2、T3时BPI浓度明显高于LR组(t分别为2.530和7.674,P分别为0.021、0.001).结论 全髋关节置换术患者用羟乙基淀粉进行急性高容量血液稀释,不仅可以减少术中输血,而且可以有效提高血浆BPI浓度,有利于机体免疫功能的稳定.
关键词： 羟乙基淀粉 急性高容量血液稀释 杀菌/通透性增加蛋白 全髋关节置换术 -
杀菌/通透性增加蛋白N端片段在原核细胞中的表达及其临床应用的初步探讨
目的:构建编码杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端片段基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白.方法:采用RT-PCR技术,从人外周血中性粒细胞的总RNA中扩增BPI蛋白N端片段cDNA编码区基因,DNA序列分析鉴定;将测序证实的BPI蛋白N端片段编码区基因PCR产物直接克隆于原核表达载体pBAD/Thio-TOPO中,再次测序鉴定;通过在大肠杆菌中以L-阿拉伯糖进行诱导表达,然后以SDS-PAGE、Western blot对表达的重组蛋白进行分析.重组蛋白经初步纯化处理后,进行生物学活性检测.结果:RT-PCR扩增出一个835 bp的DNA片段,DNA测序表明为所需目的基因.限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明,BPI蛋白N端片段正确克隆到大肠杆菌表达载体pBAD/Thio-TOPO中,SDS-PAGE和Wester blot结果表明在大肠杆菌中成功表达了BPI蛋白N端片段.对该蛋白进行初步活性测定显示其可与BPI单克隆抗体结合并具有杀灭耐药铜绿假单胞菌的活性.结论:成功构建了BPI蛋白N端片段编码区基因原核表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,表达的重组蛋白具有一定的生物活性.
关键词： 杀菌/通透性增加蛋白 基因克隆 基因表达 -
重组杀菌/通透性增加蛋白对内毒素休克中肝脏一氧化氮合酶的影响
探讨重组杀菌/通透性增加蛋白(rBPI21)对内毒素休克中肝组织一氧化氮合酶(NOS)的影响及其意义.方法:大鼠腹腔注射大肠杆菌内毒素(15.0mg/kg)复制内毒素休克模型,动物随机分成正常对照组、内毒素休克组和rBPI21治疗组.检测肝组织NOS活性、三磷酸鸟苷环水解酶I(GTP-CHI)活性及生物喋呤含量,同时还观察肝脏微循环血流灌注量的改变.结果:内毒素攻击后肝组织诱生型NOS(iNOS)活性急剧升高(P＜0.01),但原生型NOS(cNOS)活性变化不明显(P＞0.05).rBPI21治疗可显著抑制iNOS活性,明显提高肝脏微循环灌注量(P＜0.01);同时局部组织的GTP-CHI活性降低(P＜0.01),生物喋呤含量也显著下降(P＜0.05).结论:内毒素休克早期给予rBPI21能选择性抑制肝组织iNOS活性并改善局部微循环,其作用机理可能与降低组织GTP-CHI活性及其介导生物喋呤诱生有关.
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人β-防御素3与杀菌/通透性增加蛋白重组腺病毒载体及其转染C3H10T1/2细胞的构建
目的 构建人β-防御素3(hBD3)与杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的重组腺病毒载体pAdxsi-BPI-BD3,并转染鼠胚胎间充质干细胞系(C3H10T1/2),观察融合蛋白的表达.方法 酶切原始质粒,得到BPI-BD3片段,连接到pShutde-CMV得到pShuttle-BPI-BD3,验证后将插入片段转移至pAdxsi载体构建重组腺病毒质粒,线性化后转染HEK293细胞,扩增纯化后,TCID50测定重组腺病毒滴液.pAdxsi-BPI-BD3及空载体pAdxsi(作为对照组)转染C3H10T1/2.RT-PCR、Western blot检测BPI-BD的表达;MTT法检测其对细胞增殖的影响.结果 成功构建重组腺病毒载体pAdxsi-BPI-BD3,纯化后病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml.pAdxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2后,RT-PCR、Western blot结果显示,BPI-BD3融合蛋白表达成功.MTT结果显示,转染的C3H10T1/2生长无明显影响(P＞0.05).结论 成功构建重组腺病毒裁体pAdxsi-BPI-BD3,且转染C3H10T1/2后可稳定表达BPI-BD3融合蛋白,为进一步研究应用抗菌肽BPI-BD3奠定基础.
关键词： 腺病毒载体 人β-防御素3 杀菌/通透性增加蛋白 -
BPI-LL37抗菌融合蛋白质表达载体的构建与功能鉴定
目的 构建杀菌/通透性增加蛋白和LL37抗菌蛋白的融合蛋白(BPI-LL37)表达载体,获得针对脓毒症治疗的多效抗菌融合蛋白,为脓毒症治疗提供新的措施.方法 通过PCR方法从杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)和LL37基因的cNA中扩增并修饰获得需要的rBPI21和LL37活性片断,构建rBPI21-LL37/LL37-rBPI21融合蛋白的表达载体,构建的表达载体(pLVX-Tight-Puro)上的BPI和LL37基因之间通过柔性片段(GGSGG)连接.之后使用PolyJetTM体外DNA转染试剂转染人肺腺癌细胞A549.通过Western blot检测真核细胞A549表达融合蛋白的水平,通过抑菌试验验证此融合蛋白的分泌与抗菌能力.结果 经限制内酶切酶切、DNA电泳和DNA测序证明融合蛋白表达载体(pLVX-Tight-Puro-BPI-LL-37)构建成功;Western blot检测结果表明融合蛋白rBPI21-LL37/LL37-rBPI21能被真核细胞A549细胞表达,融合蛋白大小介于25～30×103;抑菌试验进一步验证此融合蛋白具有抑制细菌生长的生物学效应.结论 构建的两种rBPI21-LL37/LL37-rBPI21表达载体能够成功转染入人的体细胞,并表达和分泌具有抗菌活性的融合蛋白,该融合蛋白有潜力成为治疗脓毒症的新药.
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清热化痰方治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期(痰热阻肺证)的疗效观察及机制探讨
目的 观察清热化痰协定方治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)(痰热阻肺证)患者的临床疗效,并探讨其作用机制.方法 2009年10月-2010年3月选择AECOPD(痰热阻肺证)患者60例,随机分为试验组和对照组(各30例),对照组仅给予西医基础治疗,试验组在西医治疗基础上加用清热化痰协定方汤药(100 mL,3次/d),共治疗10 d.主要观察中医症候疗效及气道炎症指标包括血浆白细胞介素(IL)-8、IL-10、杀菌/通透性增加蛋白(BPI)水平.结果 ①痰热阻肺证证候:两组治疗前后中医证候总积分差值组间比较差异有统计学意义(P＜0.05),清热化痰协定方在改善咳嗽、痰量、咳痰、舌苔方面优于对照组(P＜0.05).②疾病疗效:试验组的总显效率和总有效率分别为82.1％和92.9％,对照组的总显效率和总有效率分别为56.0％和84.0％,两组总显效率比较,试验组优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),两组总有效率比较差异无统计学意义(P＞0.05).③气道炎症指标:两组治疗后IL-8水平明显下降,IL-10及BPI水平明显升高,两组治疗前后组内比较差异均有统计学意义(P＜0.05),IL-8下降幅度及BP2升高幅度组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05),IL-10升高幅度试验组大于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在西医治疗基础上,清热化痰协定方能改善AECOPD(痰热阻肺证)患者中医症状及体征,其疗效的机制之一可能是通过促进IL-10水平的升高.
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人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达
目的构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的真核表达载体并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞,免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功,为下一步BPI功能的研究奠定了基础.
关键词： 杀菌/通透性增加蛋白 逆转录PCR 序列分析 基因重组 真核表达 -
杀菌/通透性增加蛋白的细胞定位
目的确定人体内能产生杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)的细胞群体,为研究BPI在细胞内的定位奠定基础. 方法分离人外周血获得嗜中性多形核粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMN)和单个核细胞,PMN,HL-60及单个核细胞分别进行RNA提取,逆转录PCR反应扩增BPI基因片段和免疫荧光法检测. 结果逆转录PCR在PMN和HL-60细胞中扩增出BPI基因片段,活细胞免疫荧光染色观察到PMN和HL-60能够与抗BPI的单抗所结合而呈阳性. 结论 BPI是中性粒系细胞的特异性产物.
关键词： 杀菌/通透性增加蛋白 逆转录PCR 免疫荧光检测法 -
杀菌/通透性增加蛋白(BPI)研究进展
杀菌/通透性增加蛋白(BPI)是人中性粒细胞中存在的一种碱性蛋白,它能与革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)结合,具有中和内毒素和杀灭细菌作用,在革兰氏阴性菌感染的治疗方面有良好的发展前景.本文主要就BPI的生理功能,作用机理及临床研究方面的进展作一综述.
关键词： 杀菌/通透性增加蛋白 内毒素 中性粒细胞 -
人、猴、兔BPI活性部位基因的克隆和序列分析
为比较不同动物来源杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的活性部位在基因组成上的差异,为今后对人BPI进行分子改构打下基础,分别从人、恒河猴和家兔外周血白细胞中克隆出BPI全长或活性部位基因,进行序列分析和比较,并进行蛋白二级结构预测.结果发现:猴、兔BPI活性部位序列与人序列在核苷酸水平的同源性分别为94%和77%,在氨基酸水平的同源性分别为88%和62%;人氨基酸序列中包含一个糖基化位点,而猴、兔序列没有;兔序列比人、猴序列少一个氨基酸;3种BPI活性部位有近似的二级结构.
关键词： 杀菌/通透性增加蛋白 基因克隆 序列分析
