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发育相关基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达及意义
目的:探讨发育相关基因在儿童急性淋巴细胞白血病(Acutelymphoblasticleukemia,ALL)患者中的表达及其与临床特征的关系.方法:采用实时荧光定量RT-PCR方法检测125例初发ALL患儿(ALL组)骨髓样本中Notch1、Wnt3a和β-catenin的mRNA表达量,并与临床特征进行相关分析.对照组(Normal control,NC)为20例非恶性血液病且骨髓正常患儿.结果:Notch1、Wnt3a和β-catenin的mRNA在ALL患儿和对照组患儿骨髓中均有表达.与对照组相比,ALL组中Notch1mRNA表达水平均明显降低(P＜0.05),β-catenin mRNA表达水平明显增高(P＜0.05),而Wnt3a的表达与对照组相比无统计学差异(P＞0.05).Notch1的表达在T淋巴细胞白血病组高于对照组(P＜0.05),而在B淋巴细胞白血病组则低于对照组(P＜0.05);此外,β-catenin的表达与患儿高危年龄(＜1岁或＞10岁)及外周血高白细胞数(≥50×109个/L)等临床特征相关(P＜0.05),与性别、FAB(Franch-American-Britain,FAB)分型、免疫分型及临床危险分级无关(P＞0.05).结论:儿童ALL患者中Notch1和β-catenin的表达异常,提示其可能与儿童ALL的发生发展存在密切的关系;β-catenin基因的高表达可能提示预后不良.Notch1和β-catenin基因检测,有望成为ALL诊断和治疗的新靶点.
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sFRP5抑制Wnt3a对黑素细胞黑素形成作用的初步研究
目的 研究sFRP5抑制Wnt3a对黑素细胞黑素形成的作用.方法 以永生化的黑素细胞为模型,利用腺病毒表达载体,设置Control组、Wnt3a处理组、Wnt3a+ sFRP5处理组进行以下实验:L-DOPA测定酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性;Masson-Fontanas银染色法观察黑素形成情况;RT-PCR检测酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1, TRP-1)、TYR基因的表达;Western blot检测TRP-1、TYR蛋白的表达水平.结果 L-DOPA测定酪氨酸酶活性结果显示Wnt3a+ sFRP5处理组TYR活性低于Wnt3a处理组,差异有统计学意义(P＜0.05);Masson-Fontanas银染色法显示Wnt3a+sFRP5处理组形成的黑素明显低于Wnt3a处理组;RT-PCR检测结果显示Wnt3a+ sFRP5处理组能下调TRP-1、TYR基因的表达(P＜ 0.05);Western blot检测结果显示Wnt3a+ sFRP5处理组能下调TRP-1、TYR蛋白的表达水平(P＜0.05).结论 sFRP5能抑制Wnt3a对黑素细胞黑素生成的作用.
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Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响
目的 探讨Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响.方法 将细胞分为4组:阴性对照组(即空白组)、实验对照组(感染Ad-GFP组)、阳性对照组(50 ng/ml RANKL诱导组)、实验组(感染Ad-Wnt3a组).分别给予处理因素后常规细胞培养6d,通过酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞的分化成熟情况；Western blot检测TRAP、Cathepsin K蛋白的表达；分别于处理因素后3、6、9d提取细胞总RNA,荧光定量Real time (RT-PCR)检测核因子κB受体(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的表达.结果 TRAP染色显示50 ng/mL RANKL诱导组能成功诱导RAW 264.7成多核(核≥10),空白组和Ad-GFP组有少量多核细胞(3≤核≤5),Ad-Wnt3a组为单核有个别双核；Western blot检测显示Ad-Wnt3a组TRAP、Cathepsin K蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P＜ 0.05)；RT-PCR检测Ad-Wnt3a组能下调RANK、TRAP、Cathepsin K、MMP-9基因的表达.结论 Wnt3a能抑制RAW264.7分化成成熟的破骨细胞.
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Wnt3a诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化
目的 探讨Wnt3a对小鼠肝前体细胞发生上皮-间质转化的影响.方法 将表达Wnt3a的腺病毒Ad-GFP-Wnt3a转入小鼠肝前体细胞中,与空白对照组相比,观察其形态变化.细胞划痕实验和细胞迁移实验观察其对小鼠肝前体细胞迁移能力的影响.实时荧光定量Real-time PCR和Westem blot分别检测小鼠肝前体细胞中上皮标志物和间质标志物的表达改变.结果 镜下观察,高表达Wnt3a的小鼠肝前体细胞由不规则多边形变为长梭形.细胞划痕实验结果显示,Ad-Wnt3a组细胞48h迁移距离为(0.53±0.05) mm,Ad-GFP组细胞48 h迁移距离为(0.33±0.02) mm,相对对照组,其迁移距离增加,差异具有统计学意义(P＜0.05).细胞迁移实验结果显示,Ad-GFP组24 h穿过小孔的细胞为(10.33±2.08)个,而Ad-Wnt3a组穿过的细胞为(62.00±3.60)个,相对对照组,其穿过小孔的细胞数量增加,差异具有统计学意义(P＜0.01).RT-PCR和Western blot结果显示,间质标志物N-cadherin、vimentin和snail的mRNA和蛋白水平表达上调,相反上皮标志物E-cadherin和CK-18的mRNA水平和蛋白水平表达下调,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 Wnt3a能够促使小鼠肝前体细胞发生上皮-间质转化,提示其可能参与了肝纤维化的发展进程.
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Wnt3a在小鼠胚胎心肌分化中的作用
目的:探讨Wnt3a在小鼠胚胎心肌分化中的作用.方法:检测Wnt3a在小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化过程中的表达和作用.实验组以二甲基亚砜(DMSO)作为诱导剂,对照组以DMSO和Frizzled-8/Fc作为诱导剂,诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化,检测分化过程中Wnt3a的表达,对比分化率.结果:两组在分化第二、三、四天Wnt3a表达,分化细胞具有自动收缩性;实验组分化率为91.67%,对照组分化率为37.50%,两组差异有显著性.结论:Wnt3a能够促进小鼠胚胎心肌分化.
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Notch和Wnt信号通路在自体骨髓间充质干细胞复合富血小板纤维蛋白修复兔牙槽骨缺损中的表达
目的 通过建立自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合富血小板纤维蛋白(PRF)修复兔拔牙窝骨缺损的动物模型,探讨Notch和Wnt信号通路在牙槽骨缺损修复过程中的表达及意义.方法 选用36只健康雄性2月龄新西兰兔,随机分为4组,均于全身麻醉下微创拔除下颌左侧中切牙.A组植入BMSCs-PRF复合物,B、C组分别植入单一PRF和BMSCs,D组未植入任何材料作为空白对照.术后4、8、12周(每个时间点3只动物)处死动物,立即在骨缺损同一部位取材,制作骨标本,利用免疫组织化学和免疫荧光染色检测骨缺损修复过程中Notch1和Wnt3a的表达情况.结果 免疫组织化学染色结果显示:第4、8周,A、B、C组Notch1和Wnt3a表达均高于D组(P＜0.05);第12周,D组Notch1和Wnt3a表达高于其他3组(P＜0.05).免疫荧光染色显示:第4周,骨缺损区新生骨细胞Notch1和Wnt3a的表达多,随着时间的延长,骨缺损修复完成,表达逐渐降低.结论 Notch1和Wnt3a信号分子在BMSCs复合PRF促进骨缺损修复过程中均有表达,可以通过调控BMSCs的增殖与分化加速牙槽骨缺损修复的愈合过程;二者表达情况相似,有可能存在串话机制.
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Wnt3a、β-catenin与CyclinD1在胃癌和胃溃疡组织中的表达及其临床意义
目的:探讨Wnt3a、β-catenin、CyclinD1在胃癌和胃溃疡组织中的表达及其临床意义.方法:采用免疫组织化学S-ABC法检测48例胃癌组织及42例胃溃疡组织中Wnt3a、β-catenin、CyclinD1的表达及分布.结果:胃癌及胃溃疡组织中均未检测到Wnt3a的表达.β-catenin、CyclinDl在胃癌组织中表达较强,阳性反应与患者的年龄、性别、肿瘤的类型及TNM分期无关,平均光密度值为0.523 ±0.044及0.446±0.054,在胃溃疡组织中阳性反应的平均光密度值为0.367±0.073及0.311±0.029.β-catenin、CyclinD1在胃癌组织的表达明显高于胃溃疡组织,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:胃癌组织中β-catenin、CyclinD1的表达明显高于胃溃疡组织,其表达与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤的类型及TNM分期无关.
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Wnt通路关键分子Wnt3a表达对肝癌诊断与鉴别诊断价值
目的：分析Wnt通路关键信号分子Wnt3a表达对HCC的诊断价值。方法：收集80例肝癌、53例肝硬化及慢乙肝患者和40例健康对照血清，用ELISA检测Wnt3a水平，与AFP比较评估Wnt3a诊断价值；以免疫组化法分析80例肝癌及癌周组织Wnt3a表达。结果：肝癌患者血Wnt3a水平显著高于各良性肝病组(P<0.001)，与肝硬化、HBV感染、TNM分期显著相关(P<0.05)；如以800 ng/L为正常上限，诊断肝癌敏感度、特异度、准确度、阳性和阴性预测值分别为92.5%、94.3%、93.2%、96.1%和89.3%，与AFP联检敏感度达96.3%， ROC下面积为0.994高于AFP的0.710(P<0.001)。癌组织Wnt3a定位于胞浆和细胞膜上，阳性率96.2%显著高于癌周组46.3%(P<0.001)；癌组织Wnt3a高表达(3~6分)占71.3%，癌旁组仅13.8%。 Wnt3a高表达与分化等级、肝硬化、HBV感染、TNM分期显著相关(P<0.01)。结论：Wnt通路关键信号分子Wnt3a表达是良、恶性肝病诊断与鉴别的特异标志物。
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miR-27a-3p通过阻断Wnt3a/β-catenin途径抑制大鼠肺纤维化
目的 探讨微小RNA-27a-3p(miR-27a-3p)对博莱霉素A5所致大鼠肺纤维化(PF)的影响及分子机制.方法 雄性SD大鼠45只,随机分为对照组、miR-27a-3p激动剂(miR-27a-3p agomir)组和miR-27a-3p拮抗剂(miR-27a-3p antagomir)组,每组15只.经气管内注入博莱霉素A5建立PF模型,给药后次日分别予生理盐水、miR-27a-3p agomir、miR-27a-3p antagomir尾静脉注射,每3d注射1次,共9次.第28天收集血液,ELISA检测血清1型前胶原蛋白羧基端前肽(P1CP)和3型前胶原蛋白氨基端前肽(P3NP)水平;处死大鼠,取肺组织,HE染色和Masson染色评价PF病变程度,实时荧光定量PCR检测miR-27a-3p、1型胶原蛋白(col)、Col3的mRNA水平,Western blot法检测Col1、Col3、Wnt3a、β联蛋白(β-catenin)的蛋白水平.结果 miR-27a-3p agomir处理明显增加肺组织miR-27a-3p表达,miR-27a-3p antagomir则降低miR-27a-3p表达,提示miR-27a-3pagoir/antagomir转染效率较高.与对照组相比,miR-27a-3p agomir显著减轻大鼠肺泡炎症和PF程度,而miR-27a-3p antagomir则明显加重大鼠肺泡炎症和PF程度.miR-27a-3p agomir组血清P1CP、P3NP水平降低、下调肺组织Col1、Col3、Wnt3a、β-catenin水平,miR-27a-3p antagomir组则作用相反.结论 miR-27a-3p通过抑制Wnt3a/β-catenin信号通路,下调Col1、Col3表达,发挥抗PF作用.
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Wnt3a联合BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化
目的 探讨Wnt3a单独以及联合骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化的作用.方法 利用HEK293细胞扩增重组腺病毒AdGFP、AdBMP9、AdWnt3a;分别转染C3H10T1/2细胞3周后,倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态及绿色荧光蛋白表达;流式细胞术检测细胞转染效率;Western blot法、免疫荧光技术及实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测缝隙连接蛋白43(Cx43)、肌钙蛋白T(cTnT)、GATA结合蛋白4(GATA4)、心肌细胞增强因子2C(MEF2C)的表达.结果 经HEK293细胞扩增可得到高滴度的重组腺病毒;转染C3H10T1/2细胞3周后,Wnt3a组Cx43、cTnT、GATA4、MEF2C的表达量与空白组比较无明显差异;Wnt3a联合BMP9组的Cx43、cTnT、GATA4、MEF2C基因的表达量显著高于空白组、GFP组和Wnt3a组,与单独BMP9组相比无显著性差异.结论 Wnt3a不能单独诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化;Wnt3a联合BMP9可诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化.
关键词： 骨形态发生蛋白9 Wnt3a C3H10t1/2细胞 心肌细胞样细胞 -
Wnt3a过表达对小鼠胚胎肝干细胞凋亡的抑制作用
目的 研究Wnt3a对ELSC14.5小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响.方法 采用表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体系统(Ad-GFP-Wnt3a)转入小鼠ELSC14.5细胞,以Ad-GFP组为空白对照组,Ad-wnt3a组为实验组.实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测Wnt3a及凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Mcl-1的mRNA和蛋白的表达；Hoechst33258染色法结合annexin-PE/7-ADD法检测细胞的凋亡情况.结果 qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3a在ELSC14.5细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3a能高效感染ELSC14.5细胞.与对照组相比,抗凋亡因子Bcl-2、mcl-1的mRNA和蛋白的表达显著升高(P＜0.05),而促凋亡因子Bax的mRNA和蛋白的表达显著降低(P＜0.05).Hoechst33258染色结合annexin-PE/7-ADD法结果显示,Wnt3a高表达的ELSC14.5细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染的细胞数量很少,细胞凋亡率降低.结论 Wnt3a通过上调Bcl-2家族中抗凋亡因子和下调促凋亡因子来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡,延长其生存.
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Wnt3a对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的影响
目的:观察Wnt3a信号对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)心肌细胞分化的影响.方法:用悬滴培养法促进ESCs形成拟胚体(embryoid bodies,EBs).用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达.在不同分化时间加入Wnt3a及Wnt信号通路抑制剂Dkk-1观察对搏动EBs百分率的影响.用RT-PCR检测Nk同源异型盒5(Nkx2.5)、锌指转录因子-4(GATA-4)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)及心房钠尿肽(ANP)基因表达水平的变化.用Western blot检测cTnT表达水平的变化.将不加入Wnt3a,分化第0～5天及5～10天加入Wnt3a的组分别命名为对照组,D0-5组及D5-10组.加入Dkk-1的组命名为Dkk-1组.结果:通过悬滴培养法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT表达.EBs形成过程中即分化第0～5天加入Wnt3a与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率,Nkx2.5、GATA4、β-MHC和ANP基因表达的水平,以及cTnT蛋白表达水平,而EBs形成后即分化第5～10天加入Wnt3a的结果相反.分化第5～10天加入Dkk-1与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平,并且在分化第0～5天分别加入Wnt3a及Dkk-1与单独加入Wnt3a及Dkk-1相比,搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平更高.结论:Wnt3a对ESCs向心肌细胞分化的调控呈时间依耐性,EBs形成过程中激活Wnt3a信号及EBs形成后阻断Wnt3a信号能够获得更多的心肌细胞.
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Wnt/β-catenin信号通路激活诱导食管癌Eca-109细胞miRNA表达谱的研究
目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路对食管鳞癌Eca-109细胞系miRNA表达的影响,为靶向该通路相关miRNA治疗提供实验依据.方法:食管癌Eca-109细胞分别以培养基终浓度10ng/ml、20ng/mlWNT3a处理48小时,细胞免疫荧光、Western-blot、RT-PCR检测β-catenin表达水平；芯片检测WNT3a处理组和对照组miRNA表达谱；qRT-PCR验证miRNAs表达水平.结果:WNT3a可上调食管癌细胞β-catenin mRNA和蛋白水平,增加其细胞核内分布；芯片检测经qRT-PCR验证,WNT3a处理后食管癌Eca-109细胞相对于未处理组miR表达改变,其中miR-21(3.87倍,P=0.002)、miR-638(2.90倍,P=0.016)显著升高；miR-107(0.18倍,P=0.003)、miR-99b(0.33倍,P=0.019)明显降低,差异均具有统计学意义.结论:Wnt/β-catenin信号通路激活影响食管癌Eca-109细胞miRNAs表达,提示Wnt/β-catenin信号通路的功能也可能通过调控相关miRNA表达参与实现.
关键词： Wnt/β-catenin信号通路 食管癌 miRNA Wnt3a -
Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化
目的:寻找促进骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的Wnt信号分子.方法:首先体外分离培养大鼠MSCs并传代,形态学观察和流式细胞学检测细胞表型CD44、CD9、CD34和CD45.采用bFGF分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化.免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a和Wnt5a对MSCs向神经元样细胞分化的影响.结果:MSCs为长梭形,CD9、CD44高表达,CD34、CD45低表达.Wnt3a诱导组的Nestin和NSE呈阳性,而GFAP无明显表达,诱导后细胞的活力良好.Wnt5a诱导组Nestin呈弱阳性表达,而NSE及GFAP阴性.RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组Nestin在诱导前后均有表达,NSE在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显.GFAP在诱导10 d后出现较弱的扩增条带.Wnt5a组、对照组MSCs在诱导后10 d Nestin有微弱表达,NSE和GFAP几乎无表达.结论:Wnt3a分子能够促进体外培养的MSCs向神经元样细胞分化.
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外源性重组Wnt3a蛋白对大鼠牙囊细胞成骨分化的影响
目的:研究外源性重组Wnt3a蛋白对大鼠牙囊细胞(DFCs)成骨/成牙骨质向分化的影响.方法:酶消化组织块法获取大鼠DFCs,用ALP活性检测法分别观察5、10、25、50、100 ng/mL重组Wnt3a蛋白刺激DFCs 9 d后对其ALP活性影响的浓度效应,以及100 ng/mL重组Wnt3a蛋白作用于DFCs 3、6、9、13 d后对其ALP活性影响的时间效应;用Western blot法检测100 ng/mL重组Wnt3a蛋白作用于DFCs 2、4d后,对细胞中成骨/成牙骨质向分化相关蛋白RUNX2、OCN、Ⅰ-胶原蛋白及β-连环蛋白(β-catenin)表达水平的影响.结果:100 ng/mL重组Wnt3a蛋白作用于DFCs 3、6、9、13 d后,各时间细胞ALP活性均较对照组有所升高,其中以6、9d时升高明显(P＜0.05);实验组细胞的ALP活性随重组Wnt3a蛋白作用时间延长而逐渐增加,各时间点两两相比,除9d与13 d相比无统计学差异(P＞0.05)外,其他各时间点均有统计学差异(P＜0.05).Western blot检测结果显示,100 ng/mL重组Wnt3a蛋白刺激DFCs 2、4d后,均可使细胞中RUNX2、OCN、Ⅰ-型胶原蛋白、β-catenin的表达水平增加(P＜0.05).结论:重组Wnt3a蛋白可能通过Wnt/β-catenin信号途径促进大鼠DFSc成骨/成牙骨质向分化.
