首页 > 文献资料
-
猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白介导的E蛋白假型鼠白血病病毒的构建
利用RT-PCR法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5和ORF6基因,分别构建pcDNA-ORF5、pcD-NA-ORF5/6和pcDNA-ORF5-ORF6真核表达载体,磷酸钙共沉淀法瞬时转染293T细胞,48h后收集细胞,流式细胞仪检测,结果表明:PRRSV ORF5基因编码囊膜蛋白(E蛋白)能在在293T细胞表面表达,而由共表达M蛋白(ORF6基因编码的基质蛋白)介导的E蛋白的表达量比单独E蛋白表达量高,串联表达与单独E蛋白相比较低.将pcDNA-ORF5、pcDNA-ORF5/6和pcDNA-ORF5-ORF6分别与MuLV假病毒构建体系的两种骨架载体pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHITlll(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后通过Western blot证实E蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,证明E蛋白已整合到此假病毒粒子表面.将整合PRRSVE蛋白的假病毒粒子分别感染Marc-145和PAM宿主靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,结果表明:所构建的假病毒粒子具有感染性,且由M蛋白介导的MuLv-E/M感染性比MuLV-E假病毒感染性高.
关键词： 假病毒 鼠白血病病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5/6基因 -
2014～2015年河南地区PRRSV的分子检测及NSP2、ORF5基因变异分析
为了解河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子特征及变异情况,本研究对2014～2015年河南各地118个养殖场的250份PRRS疑似病料进行RT-PCR检测,并对PRRSV阳性样品的NSP2和ORF5基因进行测序及变异分析.结果显示,PRRSV阳性样品共58份,阳性率为23.2％;扩增得到29个NSP2基因序列和31个ORF5基因序列;遗传进化分析表明,河南地区PRRSV流行毒株主要为美洲型毒株,其中14株与高致病性PRRSV(HP-PRRSV)高度同源,其余15株与美洲毒株NADC30高度同源,且该类毒株的nsp2蛋白存在131个氨基酸的不连续缺失,与国内及韩国报道的新变异毒株具有相似的缺失特征.与2012～2013年河南地区PRRSV分子流行病学调查结果相比,2014～2015年河南地区PRRSV流行株主要以HP-PRRSV和NADC30-Like毒株为主,尤其是后者在流行毒株中所占比例急剧上升,并且PRRSV流行毒株的NSP2和ORF5基因均发生很大变异,提示有必要对PRRSV的流行和变异进行持续监测,并对其致病性等进行深入研究,从而为新型疫苗及抗病毒药物的研发提供科学的参考依据.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP2基因 ORF5基因 NADC30株 变异分析 -
共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5和M蛋白增强DNA疫苗免疫应答的研究
为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5基因)及ORF6为候选基因,构建了单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI ORF5m、pCI-ORF6及pCI-ORF5m/ORF6.转染BHK-21细胞,Western blot检测证实ORF5m和ORF6基因均获得正确表达,并且共表达的GP5m和M蛋白能够形成异源二聚体.将构建的表达质粒免疫小鼠,首免后6周共表达ORF5m和ORF6基因的pCIORF5m/ORF6免疫组小鼠血清中和抗体全部阳转,8周时高可达到1:32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答,明显高于单独表达ORF5m基因的pCI-ORF5m免疫组.进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI-ORF5m/ORF6免疫组同样能诱发优于pCI-ORF5m免疫组的中和抗体和细胞免疫反应.上述研究结果表明采用ORF5m和ORF6双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA疫苗效力,为PRRSV新型疫苗的研制提供了有用的数据.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5m ORF6 双基因共表达 DNA疫苗 -
仔猪人工感染猪繁殖与呼吸综合征病毒后宿主细胞凋亡动态变化规律的研究
28日龄长白仔猪滴鼻人工感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),于接种后8h、24h、30h、3d、5d、7d、9d、11d、14d、21d、28d、35d和42d各随机剖杀2头,取各组织器官,利用原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法检测PRRSV感染仔猪后所产生的细胞凋亡情况.结果表明,PRRSV在体内可诱导肺脏、淋巴结(肺门淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结)、扁桃体、脾脏、肝脏、胰脏、十二指肠、胸腺、肾脏、子宫、睾丸、附睾、大脑和小脑等组织的细胞发生凋亡,发生凋亡的靶细胞主要是各种巨噬细胞、单核细胞以及生殖细胞.感染后8h即可检测到细胞凋亡,且凋亡细胞数目随着感染时间的延长在感染后第7d达到高峰,以后逐渐减少,至感染后42d时仍能检测到少量凋亡细胞.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 细胞凋亡 原位末端标记 -
环介导间接PCR鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立
建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)环介导间接PCR检测方法,用于该病毒的感染检测和高致病性毒株与低致病性毒株的鉴别诊断.根据GenBank数据库中PRRSV中国流行株ORF7和ORFla基因序列的保守性,设计2对特异性探针,分别标记于大豆Lectin基因两端,作为报告基因,经过一步链置换反应后,采用反向PCR扩增报告基因,建立PRRSV环介导间接PCR检测方法,该方法扩增HP-PRRSV可得大小为193bp和355bp的特异片段,扩增LP-PRRSV可得大小为193bp和442bp的特异片段.试验结果表明,该方法能成功鉴别HP/LP-PRRSV,可检测出5.6 TCID50/mL LP-PRRSV和18 TCID50/mL HP-PRRSV的病毒RNA,HP/LP-PRRSV混合感染不影响检测灵敏度,与CSFV、PPV、PRV、PCV2、ETEC和Haemophilus parasui等常见猪源性病原的检测无明显交叉反应；对20份临床样本进行比较检测,环介导间接PCR检测出14份PRRSV阳性样本,其中4份LP-PRRSV、9份HP-PRRSV和1份LP/HP-PRRSV,与常规PCR检测结果一致.环介导间接PCR是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具,适合PRRSV感染的快速检测和HP/LP-PRRSV鉴别诊断,尤其适合HP/LP-PRRSV混合感染的鉴别.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 环介导间接PCR 报告基因 -
猪NF-κB p65/p50亚基的原核表达及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响
为了研究经原核表达的猪细胞核转录因子NF-κB p65/p50融合蛋白对猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)体外增殖影响,本文采用RT-PCR技术扩增出编码成熟p50区和p65开放阅读框(ORF),将其克隆至pET21a(+)中,转化至Rosetta感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)对表达产物进行鉴定;纯化复性后添加到DMEM细胞维持液中,观察p65/p50对Marc145细胞毒性,确定佳使用浓度;探讨佳浓度的p65/p50对PRRSV体外感染增殖活力的影响,通过实时荧光定量PCR方法研究PRRSV感染时相,绘制PRRSV增殖曲线.成功构建了大量以包涵体形式表达Mr均约为70kD的p65/p50融合蛋白的p65/p50-pET21a(+)原核表达载体;Western-blot显示p50和p65重组蛋白可分别与兔抗人p50多克隆血清、兔抗人p65纯化抗体反应.确定p65/p50佳添加浓度为0.4μg/mL.通过实时荧光定量PCR技术研究PRRSV感染时相,结果表明NF-κB p65/p50可促进PRRSV感染Marc-145 CPE出现及病毒早期增殖;但CPE出现后,病毒增殖受到抑制,病毒滴度水平显著降低(P＜0.05).该结果为进一步研究PRRS的发病机理及治疗策略提供了新思路.
关键词： 核转录因子-κB 猪繁殖与呼吸综合征病毒 病毒复制 -
猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112弱毒株NSP2区表达猪瘟病毒E2基因表位的研究
建立共表达猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV) E2蛋白主要中和性抗原表位基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,为进一步研究PRRSV作为病毒载体提供实验数据.本研究在PRRSVHuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因插入HuN4-F112弱毒株PRRSV已鉴定出的两个NSP2蛋白的复制非必需区,经基因片段的克隆、拼接,构建了两株含有CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因的感染性PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ508-532+ E2和psk-HuN4-F112-Δ480-532+ E2.用限制性内切酶Swa Ⅰ分别将两株共表达的感染性克隆线性化,之后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法分别将病毒RNA转染BHK-21细胞包装出病毒粒子,再分别将其转接到MARC-145细胞传代拯救出两株病毒.分别对两株拯救病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定.结果表明,两株拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(拯救病毒基因组的14 667位因同义突变产生的MluⅠ酶切位点)和插入基因序列.间接免疫荧光试验表明,CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因均能在两株拯救的PRRSV中表达,且能够在其传代过程中稳定遗传.病毒生长特性结果比较显示两株拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性.本研究构建了两株共表达CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因的PRRSV感染性克隆并获得了拯救病毒,且外源基因能在拯救病毒中稳定表达,为进一步开发新型PRRSV二联疫苗提供了有效的反向遗传操作平台.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 感染性cDNA 拯救病毒 病毒载体 -
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD2株ORF5/ORF6双基因真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达
为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5和ORF6基因在同一质粒中分别表达各自编码的蛋白,发挥E蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势,将构建成功的pIRES-ORF5/ORF6转移载体用脂质体法转入稳定表达的细胞CHO,经G418加压筛选获得具稳定表达的细胞株.以RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况.结果表明:RT-PCR检测到两种目的基因的转录;SDS-PAGE和Western blot检测到同时表达的两种目的蛋白;间接免疫荧光检测到目的蛋白得到表达.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 SD2株 ORF5/ORF6 CHO 蛋白的表达 -
我国猪繁殖与呼吸综合征病毒NT0801分离株分子特征
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前引起国内外养猪业严重经济损失的重要病原之一,病毒基因和毒力变异较大.PRRSV NT0801株分离自我国发病猪群,毒力较强,但NSP2基因不存在高致病性PRRSV 30个氨基酸的缺失.为了进一步阐明该分离株的分子特征,本研究对该毒株全基因序列进行了测定和分析,结果该毒株基因组全长15 439 bp,其中包含29 nt Poly(A).与高致病性PRRSV毒株JXA1比较,核酸序列同源性为96.7％,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为97.2％和98.5％,但NSP2基因无30个氨基酸的缺失；与传统型毒株ch-la比较,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为92.9％和91.5％；基因进化树分析结果显示其介于高致病性和传统PRRSV毒株之间.与其它不同毒力PRRSV分离株基因序列比较,未发现明显重组信号.不同毒力毒株氨基酸残基比对分析结果显示,15个位点潜在毒力相关氨基酸残基中,该毒株有9个与高致病性PRRSV毒株一致,3个与高致病性PRRSV毒株不同,但与传统型和JXA1疫苗株相同,1个位点只与JXA1疫苗株相同,2个与其它毒株都不相同.表明该分离株与高致病性PRRSV密切相关,PRRSV流行毒株变异与基因突变有关,从而为该病毒毒力基因定位研究奠定了基础.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 分子特征 -
表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是目前危害世界养猪业的两种重要病原.本研究采用PCR方法构建PRRSV疫苗株TJM-F92全长cDNA克隆载体pCMV-TJM,并在其ORF7和3'UTR之间插入AflⅡ/MluⅠ酶切位点和转录调控序列TRS6,构建获得pCMV-TJ M-TRS表达载体.将PCV2ORF2基因插入该载体AflⅡ/MluⅠ位点,获得重组质粒pCMV-TJM-Cap.将pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJ M-Cap分别转染Marc-145细胞,拯救获得3种重组病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap.基因测序列、酶切鉴定、Western blot、间接免疫荧光和病毒生长特性结果显示,3种重组PRRSV病毒都含有特征性分子标记,在Marc-145细胞增殖特性与亲本病毒相似;rTJM/Cap传至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染细胞能有效表达PCV2 Cap蛋白,从而为PRRSV致病机制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基础.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪圆环病毒2型 反向遗传 重组病毒 -
猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-1(sh)/2002株全基因组分子特征分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)可引起妊娠母猪流产,早产,产死胎、弱胎、木乃伊胎及仔猪和肥育猪的呼吸道症状.先于20世纪80年代末期爆发于美国和欧洲一些国家,随后很快传至全世界,给世界养猪业造成了巨大的损失.我国在1995年底爆发该病,之后蔓延到我国很多省份.1996年郭宝清、杨汉春等分别从疑似PRRS的病例中分离出PRRSV[1,2].
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 全基因组 分子特征分析 -
融合表达牛疱疹病毒1型VP22及猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组伪狂犬病毒TK-/gE-/VP22GP5+的构建
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)和伪狂犬病(pseudorabies,PR)是两种严重危害养猪业的重要病毒性传染病.而引发PR的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是构建基因工程疫苗优良的活病毒载体[1].已有报道将表达猪瘟病毒(hog cholera virus, HCV)囊膜蛋白E1基因的重组PRV(rPRV)二价基因工程疫苗免疫猪后, 能同时抵抗HCV和PRV的强毒攻击[2],显示了PRV作为活病毒载体的可行性和"一针防两病"的独特优点.由ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要的免疫保护性抗原蛋白[3].
-
DNA免疫法研制抗猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白中和性单克隆抗体
目的:研制抗PRRSV M蛋白的单克隆抗体(McAb),以期获得中和性单克隆抗体.方法:将PRRSV M蛋白的基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,利用构建成的重组真核质粒免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV M蛋白的单抗,建立间接ELISA方法筛选阳性克隆.利用试剂盒检测Ig亚类.通过免疫印迹(Westem blot)、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定McAb的特异性.间接ELISA和病毒中和试验检测杂交瘤细胞上清McAb效价和腹水McAb效价.结果:获得3株可分泌特异性抗PRRSV M蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A7、4G3、5F3.1A7和4G3的Ig亚类为IgM.ELISA检测杂交瘤细胞培养上清效价为1:64～1:1 024,腹水效价为1:3 200～1:10240.同时用Western blot、IFA检测,结果均是阳性.4G3和1A7相对亲和力不同,证明其识别不同抗原位点.1A7和4G3具有病毒中和活性,中和效价达到1:96.结论:获得2株特异性抗PRRSV M蛋白的中和性单抗,为PRRSV诊断和免疫预防研究奠定了重要基础.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 单克隆抗体 M蛋白 质粒 中和抗体 -
含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒对猪体免疫作用研究
目的:为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,以pVAX1为真核表达载体,以PRRSV ORF5基因为目的基因,构建了含有CpG和PRRSV ORF5的真核表达质粒CpG-pVAX1-ORF5,并在猪体进行了免疫试验.方法:检测猪PRRSV的特异性抗体滴度、IL-2水平以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平,并做了攻毒保护试验.结果:试验结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫(显著的淋巴细胞增殖反应水平).攻毒结果表明CpG-pVAX1-ORF5组能够有效地抵抗经鼻攻毒,可以保护猪轻微病毒血症,比对照组减少80%,也不表现临床症状,对肺的损害能提供部分保护.结论:CpG的加入可使免疫猪的病变减轻或消失.从而表明含有CpG-ODN能作为PRRSV DNA疫苗的有效佐剂.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因 CpG DNA免疫 -
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、M蛋白基因核酸疫苗表达质粒的构建及其免疫原性
目的 构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株GP5、M蛋白基因核酸疫苗表达质粒,并检测其免疫原性.方法 用RT-PCR法扩增PRRSV的GP5和M蛋白基因片段,克隆至真核表达载体pIRES-neo中,构建真核表达质粒pIRES-G和pIRES-M,制备核酸疫苗,以其单独或联合免疫小鼠,检测其免疫原性.结果 真核表达质粒pIRES-G和pIRES-M经酶切鉴定证明构建正确.第1次免疫后4周,各重组质粒免疫组小鼠血清ELISA抗体水平均显著升高,其中pIRES-G+pIRES-M组抗体水平高;第1次免疫后9周,pIRES-G+pIRES-M组小鼠血清中和抗体效价(1:16)高于pIRES-G组(1:8)和pIRES-M组(1:4),但均低于灭活疫苗组(1:64);第1次免疫后9周,与pIRES-neo组相比,各组免疫小鼠脾细胞经特异性(PRRSV)和非特异件(ConA)抗原刺激后,均有明显的增殖,对非特异性刺激反应比特异性刺激反应略强.结论 已成功构建PRRSV GP5、M蛋白基因核酸疫苗表达质粒,二者联合免疫效果更好.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因 M基因 核酸疫苗 免疫原性 -
表达PRRSV GP5、GP3和猪IL-18的重组鸡痘病毒的构建及鉴定
目的 研制安全有效的预防猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组鸡痘病毒活载体疫苗.方法 将PRRSV长春株的GP5和GP3基因插入到含有猪IL-18基因的鸡痘病毒转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL-IL-18-GP5-GP3.将该重组质粒与鸡痘病毒(FPV)282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组.通过3次BrdU加压筛选,经PCR、RT-PCR和IFA方法鉴定重组病毒.结果 从重组鸡痘病毒基因组和总RNA中扩增出340 bp的目的基因片段,感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达.结论 已成功构建1株重组鸡痘病毒,并可正确表达PRRSV ORF5/ORF3基因.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5 GP3 鸡痘病毒 -
猪繁殖与呼吸综合征病毒野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92一步RT-PCR鉴别方法的建立
目的 建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92一步RT-PCR鉴别方法.方法 基于高致病性PRRSVTJ株及其基因缺失致弱疫苗株TJM-F92的nsp2基因序列设计1对引物,建立可鉴别不同高致病性PRRSV野毒株与基因双缺失弱毒疫苗株的一步法RT-PCR,并进行特异性、灵敏度、敏感性、重复性验证.结果 高致病性PRRSV TJ株扩增出1 100bp的条带,基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92扩增出740 bp的条带,可对两毒株作出准确鉴别；建立的一步法RT-PCR可测出101 TCID50/ml的PRRSV-TJ疫苗毒株,灵敏度较高；对已知阳性和阴性仔猪血清样品的检测结果100％相符,敏感性较高,且重复性较好.结论 建立的一步法RT-PCR可用于接种TJM-F92疫苗猪群中PRRSV野毒感染与疫苗免疫猪的临床鉴别,有助于评价疫苗的免疫效果并及早发现野毒感染.
-
生物反应器微载体放大培养Marc-145细胞及PRRSV增殖情况
目的 确定不同级别生物反应器间Marc-145细胞在微载体上消化放大培养条件,实现Marc-145细胞二级放大后,在生物反应器内增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV).方法 在一级生物反应器(BC-7L型)内,以微载体密度4g/L培养Marc-145细胞,培养72 h时经灭菌PBS漂洗、胰酶消化后,接种至二级生物反应器(BC-14L型)继续培养,实现反应器间微载体细胞5倍体积增殖培养.以0.05 MOI接种PRRSV(TJM-F92株),接毒后24、36、48、60、72 h分别取上清及全液样品,检测病毒效价(TCID5o).结果 Marc-145细胞经过一级生物反应器培养72 h后,细胞密度达28.7×105个/ml;消化放大后,二级生物反应器培养72 h后,细胞密度达24.9×105个/ml.接毒后36 h,样品效价峰值可达108.19TCID50,上清与全液样品效价差异较小.结论 Marc-145细胞从BC-7L型到BC-14L型不同反应器之间进行放大培养是可行的,为PRRSV活疫苗新型工艺改进及大规模放大生产奠定了基础.
关键词： 生物反应器 微载体 Marc-145细胞 猪繁殖与呼吸综合征病毒 增殖 -
猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备及免疫试验
目的 利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)安徽分离株制备油乳剂灭活疫苗,并进行免疫试验.方法 PRRSV经Marc-145细胞传代增殖,制备油乳剂灭活疫苗;物理性状、无菌试验及安全性试验合格后,经肌肉注射免疫健康仔猪,并进行攻毒;分别检测免疫仔猪的血清抗体水平及保护力,并进行免疫程序及与市售疫苗的免疫效果的比较试验.结果 制备的灭活疫苗的适宜免疫剂量为2 ml/头,免疫后14 d血清抗体水平可达高峰;使用同一病毒攻毒,保护率为80%(4/5).采用灭活疫苗2次免疫及灭活疫苗与弱毒疫苗交替2次免疫,免疫效果均较好.制备的灭活疫苗免疫效果与1号市售灭活疫苗相比,差异无统计学意义,且优于2号市售灭活疫苗.结论 已成功制备了PRRSV安徽分离株油乳剂灭活疫苗,该疫苗安全可靠,免疫效果好,适于推广使用.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 灭活疫苗 免疫效果 -
美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
目的 原核表达美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(North American genotype porcinereproductive and respiratory syndrome virus,NA-PRRSV)N蛋白,并制备多克隆抗体.方法 以NA-PRRSV QH-08毒株的RNA为模板,扩增N蛋白编码片段,克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a-NA-PRRSV-N,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6h.采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达的重组蛋白,复性后的重组N蛋白与弗氏佐剂混合乳化,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,制备兔抗NA-PRRSV-N蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验检测多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测血清抗体效价.结果 经PCR、双酶切和测序鉴定,重组表达质粒pET30a-NA-PRRSV-N构建正确;重组N蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为24 000,纯度可达95％以上,可与NA-PRRSV阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体能够识别重组N蛋白和全病毒抗原,抗体效价＞1:25 600,显著高于商品化疫苗组.结论 成功在大肠埃希菌中表达了NA-PRRSV N蛋白,并制备了其多克隆抗体,为NA-PRRSV检测方法的建立奠定了基础.
