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中国1995～1999年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析
应用RT-PCR方法扩增到了我国1995～1999年10株IBV现地分离株的核蛋白基因片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析.结果发现,10株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1 230bp的ORF,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失.与GenBank中的20个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的毒株主要分布于3个群中,该3群病毒主要包括我国IBV现地分离株.对n基因及其局部功能区序列比较发现,我国分离株与H120疫苗株N蛋白存在广泛的氨基酸变异.通过与s1基因系统发育进化树比较发现,我国IBV分离株存在基因重组现象.以上结果表明我国1995～1999年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象.
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河南省2008～2009年麻疹野病毒核蛋白基因特征分析
目的 了解河南省流行的麻疹野病毒的基因特征,为制定消除麻疹策略提供依据.方法 用非洲绿猴肾细胞/淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞[Vero Cell/Signaling Lymphocyte Activation Molecule(Vero/SLAM)]从疑似麻疹病例标本中分离麻疹野病毒,用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)扩增麻疹野病毒分离株的核蛋白(Nucleoprotein,N)基因羧基末端676个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析.以N基因羧基末端450个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸变异分析.结果 河南省2008～2009年共分离麻疹病毒147株,挑选其中73株测序后均为H1基因型,73株麻疹野病毒450个核苷酸的平均进化距离为0.020.2008年分离株与参考毒株的平均进化距离为0.055,其中与Hunan.China93-7/H1基因型的进化距离为0.012～0.026; 2009年分离株与参考毒株的平均进化距离为0.067,其中与H1基因型的进化距离为0.013～0.020.结论 河南省2008～2009年麻疹野病毒流行优势株为H1基因型,未发现病毒有较大变异,但存在一定的进化距离,呈现多个传播链的流行.
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福建省漳州市2013-2015年流行麻疹病毒基因型别鉴定及基因特征分析
目的 了解2013-2015年漳州市麻疹病毒基因型流行情况.方法 用Real-time RT-PCR法对2013-2015年漳州市的392份疑似麻疹病例咽拭子标本进行核酸检测;用RT-PCR法扩增核酸阳性标本的N基因羧基末端594个核苷酸片段,并对扩增产物测序;以N基因羧基末端450个核苷酸序列构建系统进化树,并进行核苷酸和氨基酸同源性分析.结果 28份标本麻疹病毒核酸阳性,阳性率7.1％ (28/392);获得21份麻疹病毒的核苷酸序列,经基因型鉴定18株为H1a基因亚型,1株为A基因型,2株为D8基因型.漳州市所有的H1a亚型麻疹病毒与H1a亚型参考株China93-2-AF045205.1-H1a之间核苷酸和氨基酸同源性分别为98.0％-99.1％和97.3％-99.3％.A基因型麻疹病毒与疫苗株Shanghai-191-DQ390225-A的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6％和99.3％.2株D8基因型麻疹病毒之间核苷酸和氨基酸同源性均为100％,它们与世界卫生组织(WHO)参考株MVi/Manchester.GBR/30.94-AF280803-D8的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.4％和96.7％.结论 2013-2015年漳州市麻疹病毒优势基因型为H1a基因亚型;A基因型为疫苗相关株;漳州市首次出现D8基因型麻疹病毒输入性病例.
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广东省流行麻疹野病毒的核蛋白基因序列分析
广东省2000～2001年分离到7株麻疹病毒,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出该7株麻疹病毒核蛋白(N)基因碳末端590个核苷酸.其中碳末端450个核苷酸的序列测定和分析提示,该7株病毒为麻疹野病毒H1基因型.7株病毒之间核苷酸同源性为96.7%～100.0%,和其它基因型相比,碳末端450个核苷酸水平变异可达12.0%,提示氨基酸水平上的变异在12.4%.
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沪191麻疹病毒疫苗株的核蛋白基因分析
目的研究沪191(S191)麻疹病毒疫苗株的核蛋白(N)基因.方法将S191株主代病毒(HK33HAM39CEC20)在实验室连续传递11代,从原代鸡胚细胞(CEC)20代连续传至CEC31代.除观察每代病毒培养特性外,还选其中的21、22、25、26、29、30、31代病毒及S191强毒株(HK33HAM45)、Edmonston(Ed)强毒株(HK28HAM40MRC-55),以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对这些病毒标本的N基因编码区的全长以及羧基末端的450个核苷酸区域进行片段扩增.结果通过N基因的序列分析发现,S191疫苗株与强毒株在N基因上有10～13个核苷酸差异,差异率为0.63%～0.82%.S191株主代病毒在CEC上连续传递11代的过程中,有2个代次病毒的个别核苷酸出现有义突变,分别导致第22代病毒的278位氨基酸Glu→Lys,第26代病毒的341位氨基酸Val→Lys,但这一变化不存在重复性,随着继续传代又恢复到21代的序列水平.结论S191麻疹病毒疫苗株在CEC长期传代过程中,各代次之间的N基因高变区序列一致,包括N基因中与免疫功能有关的3个B细胞表位区域的序列在传代中也无改变,故不可能影响到疫苗的免疫效果.
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福建省2012～2014年麻疹病毒核蛋白基因特征分析
目的 了解2012 ～2014年福建省麻疹病毒核蛋白N基因的变化.方法 应用描述性流行病学方法对2012～2014年福建省麻疹发病情况进行分析.使用Vero/hSLAM细胞对疑似麻疹病例的咽拭子标本进行麻疹病毒分离,经逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法扩增麻疹病毒核蛋白N基因羧基末端450核苷酸片段,测序获得序列后进行遗传变异分析.结果 2012 ～2014年福建省共报告548例麻疹病例,包括1起麻疹爆发和1例麻疹疫苗相关病例.共获得64株麻疹病毒N基因羧基末端片段,经基因型鉴定1例为疫苗株A型,63例为野毒株H1a亚型.野病毒的核苷酸同源性为91％～99.4％,在遗传图谱上分化成两个分支Lineage 1和Lineage 2,两支系之间核苷酸同源性为96.7％～99.0％,氨基酸同源性为96.5％～99.1％.Lineage 1毒株主要分布于2012和2014年,Lineage 2毒株主要分布于2013年,同一年份存在两个分支病毒的同时传播.福建省与同时期中国地区麻疹流行株在N基因羧基末端核苷酸片段上有高度同源性.结论 福建省流行的麻疹病毒基因型为H1a亚型,并存在多地区两条麻疹病毒传播链交替流行的趋势.
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改良菌落PCR法筛选、鉴定DHBV部分核衣壳蛋白基因的重组隆
[目的]优化并验证改良菌落PCR程序的有效性.[方法]经常规PCR扩增DHBV编码核衣壳蛋白与DNA多聚酶重叠区的部分核苷酸片段(DHBc-dp),纯化特异性扩增产物并连入pMD 18-T载体,转化DH5α感受态细胞后涂布于Amp加倍的LB平板,记为亲代样品(PS),37℃培养12h,室温放置4h～8h.无菌操作挑取细菌转入优化的PCR反应液扩增、鉴定；余菌体室温放置完成二次生长.PS剩余PCR鉴定产物继代转化并涂布LB平板,记为继1代样品(F1S),同样进行菌落PCR鉴定.选取PS和F1S中PCR强阳性样品进行扩增及菌液PCR、质粒PCR、质粒酶切和测序鉴定.[结果]挑菌后的菌落二次生长成面积扩大的菌苔；优化菌落PCR反应体系保持、甚或提高了原有方法的高度特应性和稳定性；携外源目的片段的重组质粒在菌落PCR反应过程中能保持结构完整,并能在继代转化宿主细胞中忠实复制与扩增.[结论]改进的菌落PCR程序,继承了既有菌落PCR程序鉴定重组克隆的特异性和高效性,并能有效预防阳性转化子的丢失；同时,在增加优势抗性菌落生长量的前提下有效地抑制了卫星菌落的生长.
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RT-PCR法检测尿液标本中麻疹病毒核蛋白(N)基因的临床应用及意义
目的 探讨逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)直接从临床麻疹患者的尿液中检测麻疹病毒特异性核蛋白(Measles virus nucleoprotein,MV-N)基因诊断价值.方法 选取2010-2011年安徽省蚌埠市散发的15例临床确诊为麻疹的患者,采集尿液,提取RNA,用RT-PCR方法扩增麻疹病毒核蛋白的515 bp核苷酸片段.同时采集同一患者血清,进行MV-IgM抗体检测,并比较两种方法的阳性率.结果 尿液RT-PCR法检测MV-N基因,15例患者中有14例扩增出阳性产物,阳性率为93.3%,高于血清MV-IgM抗体检测的阳性率60.0%(χ2=9.60,P=0.002).结论 麻疹病人尿液标本的RT-PCR检测可用于麻疹病毒的早期快速辅助诊断,特别是对于出疹初期的患者.同时对血清MV-IgM抗体阴性的病例进行此法复检,可弥补漏检.
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水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析
目的对水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因进行PCR扩增、克隆和序列分析.方法将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18-T载体中,构建N基因重组质粒载体.进行PCR及限制性内切酶分析,筛选获得N基因插入的阳性克隆.经核苷酸序列分析,并与Genbank中的VSV编码核衣壳蛋白N基因序列进行比较.结果该序列与VSV New Jersey型的09/82-HD-B株同源性高,核苷酸和推测氨基酸的同源性分别为98.9%和98.8%,有13个核苷酸差异,伴有5个氨基酸改变,第72位的酪氨酸变为组氨酸,第89位的缬氨酸变为异亮氨酸,第183位的天冬氨酸变为天冬酰胺,第205位的苯丙氨酸变为亮氨酸,第418位的丙氨酸变为缬氨酸;与Indiana型各株的同源性较低,与Glasgow株相比,核苷酸和氨基酸的同源性分别为67.9%和716%.结论已成功地克隆了水泡性口炎病毒N基因,为水泡性口炎免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.
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汉坦病毒核蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用
目的从国内生产肾综合征出血热(HFRS)疫苗Z10株中克隆汉坦病毒核蛋白基因,应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统使其在昆虫细胞中表达,制成抗原片,用于检测血清中汉坦病毒抗体.方法从汉坦病毒Z10株感染细胞上清液中提取病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增S基因,与穿梭质粒连接并转化大肠杆菌,得到重组穿梭质粒.将其转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌,筛选出含S基因的重组杆状病毒DNA的大肠杆菌,提取重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞,应用ELISA法及间接免疫荧光法检测重组蛋白的抗原性.结果用RT-PCR方法扩增得到S基因,筛选出的重组杆状病毒感染细胞sf9,制成抗原片.此抗原片仅与HFRS阳性患者血清起反应,而与正常人及其它发热患者血清不起反应.检测浙江省各医院送检的97份疑似肾综合征出血热患者血清及36份正常人血清,与传统的抗原片比较,阳性符合率为100%.结论可以应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达汉坦病毒重组蛋白.以此制备的抗原片,可用于患者血清中汉坦病毒抗体检测,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,为诊断肾综合征出血热提供新的途径和手段.
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SARS荧光免疫诊断技术研究
目的应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达SARS核蛋白基因,产生无感染性的核蛋白抗原,利用此蛋白制备抗原片,用于检测血清中SARS特异性抗体.方法从非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增出SARS核蛋白基因片段,将核蛋白基因插入杆状病毒,构建重组昆虫杆状病毒,转染昆虫细胞,收获细胞,经丙酮固定,制成SARS抗原片,建立了SARS荧光免疫方法(IFA).结果用此抗原片检测多份血清,仅与SARS病人血清起反应,而与正常人及其它发热病人血清不起反应.结论利用该方法制备抗原片,不需要P3实验室,操作简便,为诊断与研究SARS提供了方便而安全的方法.
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狂犬病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性
目的 构建狂犬病毒核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于狂犬病的检测及诊断.方法 应用RT-PCR方法扩增ERA株狂犬病毒NP基因后克隆到PCR[R]2.1TA载体,转化One ShortTMTOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用KpnI和NotI双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast ERA-NP重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h收获细胞,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析.结果 构建了舍有ERA NP基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中获得表达.结论 本研究成功表达出了具有免疫原性的狂犬病毒核蛋白.
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狂犬病毒N基因的原核表达及间接ELISA方法的建立
目的 用表达的狂犬病核蛋白建立检测狂犬病抗体的间接ELISA方法.方法 根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)ERA株N基因序列设计引物,利用PCR的方法从重组质粒pMD-N中扩增RV N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建原核表达载体pET-N.阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达N基因的佳诱导时间.通过凝胶薄层扫描分析和Western-blot分析确定表达蛋白的表达量和特异性.用纯化的表达产物作为诊断抗原,通过对各反应条件的优化,初步建立检测RV抗体的间接ELISA方法.结果 扩增了RV N基因,构建了原核表达载体pET-N和原核表达菌,表达了N基因且目的 蛋白以包涵体形式存在表达菌中,佳诱导时间为4 h.重组蛋白表达量占菌体总蛋白的56.8%,并能与RV阳性血清发生特异性反应.用表达的狂犬病重组N蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法.结论 成功表达了狂犬病核蛋白,用表达的狂犬病核蛋白建立的间接ELISA方法可以用于RV抗体的检测.
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双密达莫抑制流感病毒A(H1N1)核蛋白基因作用的实验研究
目的 探讨双密达莫抑制流感病毒A(H1N1)核蛋白基因(NPG)的作用.方法 采用荧光定量RT-PCR法检测药物抑制流感病毒NPG效应.结果 药物对MDCK细胞的毒性范围:1∶64稀释为无毒界限.病毒半数细胞感染量(TCID50)为6.5·25 μL-1.直线相关性分析结果显示:阈值循环数与不同浓度的定量模板的对数呈负相关(r=-0.999,P＜0.05).病毒对照组RNA水平明显高于实验组[(5.50±1.82)×109拷贝数·μL-1 vs (8.59±2.17)×107拷贝数·μL-1,P＜0.01)].结论 双密达莫能阻断流感病毒核蛋白的合成,为防治流感提供了分子实验依据.
关键词： 流感病毒A(H1N1) 双密达莫 核蛋白基因 荧光定量RT-PCR法 -
东莞市2011年麻疹病毒核蛋白基因序列分析
目的:了解东莞市2011年流行的麻疹病毒的基因型别和核蛋白基因变异情况.方法:采集病人的咽拭子或尿液标本,用VERO-SLAM细胞分离病毒.通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和测序技术获得毒株的核蛋白基因碳末端450 bp核苷酸序列,并与麻疹各基因型代表株及沪191疫苗株进行序列比对和构建进化树分析.结果:共分离到6株麻疹病毒株,均属于H1基因型H1a亚型.6株毒株间的核苷酸同源性为99.8％～100％.6株毒株间有5株序列相同.各毒株与China93-2毒株同源性高,为98.7％和98.9％.与沪191疫苗株同源性则为92.4％ ～ 92.7％.结论:东莞市2011年麻疹病毒流行株均属于H1基因型H1a亚型,与中国的流行情况一致.暂无新型及传入性的其它亚型出现.毒株间的变异很小.
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北京市门头沟区麻疹病毒流行株基因特征研究
目的 研究北京市门头沟区流行麻疹病毒(MeV)的基因型别及特征.方法 采集麻疹疑似患者咽拭子和尿液标本分离病毒,提取病毒RNA,逆转录PCR扩增病毒的N基因碳末端的634 bp的核苷酸片段,对扩增产物进行序列测定和比较分析.结果 在发病的39例患者中,14例扩增到N基因片段,序列阳性率为35.9％,经过序列比对,均为H1基因型.本研究所获得的14株麻疹病毒H1基因亚型在亲缘关系进化树上与WHO推荐的H基因型代表株Hunan.Chi-na93-7/H1-H1c同属一个分支,核苷酸同源性为96.7％～97.9％,氨基酸同源性为95.5％ ～ 97.3％.结论 H1基因型麻疹病毒是门头沟区麻疹病毒的优势流行株,与北京市及全国麻疹病毒流行株无差异.
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江西省2013年麻疹病毒分离株N基因特征分析
目的 研究江西省2013年麻疹病毒的基因型别和特征,掌握江西省麻疹病毒的基因型别和流行特点.方法 采用Vero/SLAM细胞分离培养麻疹病毒,用RT-PCR方法扩增麻疹病毒N基因,并进行序列测定和同源性分析.结果 2013年江西省分离的15株麻疹病毒株均为H1a基因亚型,与H1基因的同源性为97.3％ ～98.1％;与中国疫苗株Shanghai-191株的N基因核苷酸同源性为93.7％～94.7％.结论 H1a基因亚型为江西省本土流行病毒株的优势亚型,近年来江西省流行的麻疹病毒无较大差异.
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中国2000-2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析
对2000-2004年从中国9个省市分离到的13株IBV的核蛋白基因片段进行序列测定及分析的结果表明,13株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1230bp的ORF,但存在基因突变现象.与GenBank中的42株参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,系统进化关系显示55株IBV毒株分属于9个群.第Ⅰ-Ⅲ群主要包括美国、日本、荷兰等国家以及中国的部分IBV分离株和疫苗株.其中本研究中的CK/CH/LHN/00I可能为一株分离的疫苗毒,CK/CH/LSD/03I、CK/CH/LDL/01I可能为重组毒.而中国近十年来分离的IBV毒株主要分布在第Ⅵ-Ⅷ群中,此3群内IBV毒株之间N蛋白推导氨基酸同源性为88.3%～100%,与其他各群之间同源性为62.3%～95.1%.因此,此基因型的IBV毒株可能在中国已有较长时期的存在且发生了较大程度的变异.其中第Ⅵ群中两株韩国分离株与中国IBV分离株具有较近的亲缘关系.以上结果表明,中国大多数IBV分离株在N基因进化关系上较为独立,与国外毒株相比,和韩国毒株进化关系密切.此外,中国IBV毒株基因重组现象更加普遍,尤其是疫苗毒和野毒之间的重组.
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赤羽病病毒核蛋白基因克隆和序列分析
参考GeneBank发表的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)的核蛋白基因(SmRNA)序列,设计合成一对引物,从分离自牛体的AKAV BHK21细胞培养物中提取总RNA,对AKAV核蛋白基因进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约696bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18-T质粒载体中,然后进行核苷酸序列分析.与GenBank中报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白(N)的SmRNA基因比较后发现,与其它株的核苷酸的同源性为94.2%～98.3%,推导的氨基酸的同源性为97.6%～100%,证实为AKV的N基因.为生产AKAV特异性核蛋白抗原、免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.
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SARS病毒核蛋白基因的克隆及其表达研究
从一例输入性传染性非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增出SARS病毒核蛋白基因片段,克隆入质粒载体pUCm-T后,进行核苷酸序列的测定及分析,与已公布的SARS病毒基因序列进行比较,证实为SARS冠状病毒核蛋白基因.为了解该病毒核蛋白的抗原特性,将核蛋白基因插入表达载体,构建重组质粒pET28a-SN,转导大肠杆菌BL21(DE3)后,加IPTG诱导表达.产物经SDS-PAGE电泳分析,表达出相对分子量约为50kDa的蛋白,占整个菌体的45%左右.Western-blot分析表明,表达产物仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常血清不起反应.间接ELISA免疫检测,抗原滴度达1:12500.表明表达的核蛋白为SARS特异性抗原,这为SARS病毒的诊断试剂的研制提供了方便而安全的抗原来源.
