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艾滋病患者感染HIV-1病毒的gag、 env和pol基因变异研究
目的 通过巢式聚合酶链式反应和菌落聚合酶链式反应检测艾滋病患者感染HIV-1病毒的gag、env和pol基因变异情况,为艾滋病的临床治疗提供参考. 方法 采集HIV-1艾滋病患者全血标本,提取HIV-1 cDNA,进行巢式PCR和菌落PCR,并测序. 结果 巢式PCR检测70份全血标本HIV-1病毒gag、env、pol基因,分别有50、44和59份阳性,电泳检测3种基因巢式PCR产物分别为650、650和1 100 bp.挑取阳性克隆体进行菌落PCR,扩增产物大小分别为750、750和1 200 bp.分析3种基因序列,有两份标本gag基因在其片段尾部第118和119位间插入一个氨基酸;env基因的V3环顶端存在6种四肽序列变异方式,即GPGR、GPGQ、GQGR、GPGA、GLGR、GPGK; pol基因在PR区的第40位发生了氨基酸突变,即由TGG变异为TAG,在其第52位同样也发生了突变,由GGT变异为AGT,而在RT区第153位发生了无义突变,即突变为终止密码子. 结论 本地区艾滋病患者感染HIV-1病毒的gag、env和pol基因均发生了不同程度的突变,可供治疗时参考.
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改良菌落PCR法筛选、鉴定DHBV部分核衣壳蛋白基因的重组隆
[目的]优化并验证改良菌落PCR程序的有效性.[方法]经常规PCR扩增DHBV编码核衣壳蛋白与DNA多聚酶重叠区的部分核苷酸片段(DHBc-dp),纯化特异性扩增产物并连入pMD 18-T载体,转化DH5α感受态细胞后涂布于Amp加倍的LB平板,记为亲代样品(PS),37℃培养12h,室温放置4h～8h.无菌操作挑取细菌转入优化的PCR反应液扩增、鉴定；余菌体室温放置完成二次生长.PS剩余PCR鉴定产物继代转化并涂布LB平板,记为继1代样品(F1S),同样进行菌落PCR鉴定.选取PS和F1S中PCR强阳性样品进行扩增及菌液PCR、质粒PCR、质粒酶切和测序鉴定.[结果]挑菌后的菌落二次生长成面积扩大的菌苔；优化菌落PCR反应体系保持、甚或提高了原有方法的高度特应性和稳定性；携外源目的片段的重组质粒在菌落PCR反应过程中能保持结构完整,并能在继代转化宿主细胞中忠实复制与扩增.[结论]改进的菌落PCR程序,继承了既有菌落PCR程序鉴定重组克隆的特异性和高效性,并能有效预防阳性转化子的丢失；同时,在增加优势抗性菌落生长量的前提下有效地抑制了卫星菌落的生长.
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外源指导序列转换临床耐药大肠埃希菌表型研究
目的研究外源指导序列(external guide sequence, EGS)在体外逆转大肠埃希菌临床分离株耐药菌为敏感菌中的作用与能力.方法构建针对β-内酰胺酶并含卡那霉素抗性基因的EGS重组质粒,常规CaCl2法将重组质粒导入临床分离耐氨苄西林大肠埃希菌E16菌株中,通过菌落PCR鉴定,并利用分光光度计A600检测阳性转化菌t-E16在含不同浓度氨苄西林LB液体和固体培养基中的生长情况.结果耐氨苄西林的临床分离大肠埃希菌E16菌株在浓度为50 μg/ml、100 μg/ml的氨苄西林LB培养皿中均生长良好,而导入EGSAMP的转化菌t-E16在浓度为100 μg/ml的氨苄西林LB培养液和培养皿中不能生长,在浓度为50 μg/ml的氨苄西林LB培养基中生长受抑,表明转化菌t-E16部分恢复了对氨苄西林的敏感性.结论外源指导序列在逆转临床耐药大肠埃希菌耐药性中的作用肯定.
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菌落PCR快速分析抗体库重组率时的假阳性现象
目的评价菌落PCR法鉴定噬菌体抗体库阳性重组率的可靠性. 方法鼠抗体基因Lc片段、Fd片段经酶切、纯化后,依次克隆入pComb3载体上相应的酶切位点,电转化XL1-blue菌后建立鼠源性Fab噬菌体抗体库.比较菌落PCR法、质粒PCR法及质粒酶切法鉴定转化菌阳性重组率的一致性.同时用空菌、空载体、空载体菌等作模板为对照PCR,以排除相关组分的干扰. 结果建立的Lc库的库容为1.175×106CFU, Fab库的库容为1.02×106CFU.3种方法鉴定的阳性重组率不同(Lc的重组率依次为100%、78%、78%,Fd的重组率依次为90%、66%、66%,Lc与Fd同时插入的重组率依次为90%、50%、50%).菌落PCR法鉴定的重组率偏高,存在假阳性现象.对照PCR提示,XL1-blue菌本身可能是导致假阳性扩增的原因. 结论用菌落PCR法不能准确鉴定噬菌体抗体库的重组率,用质粒PCR法或质粒酶切法鉴定更为可靠.
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高胆固醇血症小鼠相关基因消减文库的建立
目的 构建高胆固醇血症小鼠cDNA消减文库.方法 以高胆固醇血症小鼠肝组织的eDNA为Teste,以正常小鼠肝组织的cDNA为Driver,应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization).构建正向消减文库,反之构建反向消减文库.结果 成功构建高胆固醇血症cDNA正.反向消减文库,利用葛落PCR技术鉴定文库的阳性克隆.结论 用SSH技术成功构建了高胆固醇血症小鼠差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选.克隆高胆固醇血症小鼠差异表达的基因奠定了基础.
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改良PCR-RFLP方法快速鉴别常见致病念珠菌
目的:建立快速准确鉴别常见致病念珠菌菌落的PCR-限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)方法.方法:结合直接菌落PCR检测技术,使用通用引物扩增6种念珠菌(包括白念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和季也蒙念珠菌)ITS1-ITS2区.分别用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ和Hpy F10Ⅵ等5种内切酶对PCR产物进行酶切,建立以菌落PCR为基础的RFLP方法,然后对30株临床株进行PCR-RFLP图谱分析.结果:应用MspⅠ进行酶切反应,6种念珠菌的酶切带型有明显差异,易于鉴别.结论:通过直接菌落PCR检测技术,使用MspⅠ进行酶切,可以经1次反应,简便快速鉴别出常见的6种致病念珠菌,为临床念珠菌感染的快速准确诊断赢得时间.
关键词： 念珠菌 菌落PCR 限制性内切酶片段长度多态性 -
菌落PCR在快速鉴定头癣病原菌中的临床应用
目的 评价菌落PCR在快速鉴定头癣病原菌中的可靠性及临床实用性.方法 于2016年1月至2017年3月在无锡市第二人民医院皮肤科门诊收集儿童头癣病例17例,采用菌落PCR技术检测病原菌,同时与常规PCR及形态学鉴定结果进行比较,评价菌落PCR应用于头癣病原菌鉴定的可靠性.结果 17例儿童头癣患者临床标本经培养收集菌种、菌落PCR均扩增成功,从断发或皮屑标本中取材至DNA模板制备成功耗时(3.82±0.50)d,较传统形态学鉴定(14d)明显缩短.以常规PCR鉴定结果为标准,菌落PCR菌种鉴定正确率为100％,优于传统的形态学鉴定(正确率88.2％).结论 菌落PCR可用于临床头癣病原菌的检测,是一种快速、经济、可靠的分子检测技术.
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菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究
目的 探讨菌落PCR在检测病原性丝状真菌方面的应用价值.方法 初步建立用于丝状真菌的菌落PCR检测技术,用19种丝状真菌标准株进行验证,所有菌落PCR扩增产物进行测序,并选取8种菌株的菌落PCR产物和酶切结果与常规PCR进行比较,检测其准确性和可靠性.结果 19株菌中有16株(84.2%)菌落PCR成功扩增内转录间隔(ITS)区,ITS区基因序列分析鉴定菌种正确,与NCBI数据库中相同菌种的相似度为96%～100%;与常规PCR进行比较的8株菌中,除构巢曲霉菌落PCR扩增结果为阴性外,其他菌种菌落PCR产物及酶切条带与常规PCR基本一致.结论 与常规PCR相比,菌落PCR检测丝状真菌操作简单,省时省力,鉴定菌种具有较高的准确性和可靠性,可以用于丝状真菌的快速鉴定.
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大肠埃希菌药敏分析及qnr基因分布情况研究
目的 了解衡水地区大肠埃希菌的药敏情况以及qnr基因的存在情况.方法 采用肉汤稀释法测15种抗菌药物低抑菌浓度(MIC)并计算其MIC50和MIC90;采用聚合酶链反应(PCR)检测qnr基因.结果 15种抗菌药物中仅亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦对大肠埃希菌敏感,245例大肠埃希菌中检出5株存在qnrB基因,占2.0%,1株存在qnrS基因,占0.4%.结论 我院检出的大肠埃希菌存在多重耐药.少数菌株中,存在qnrB和qnrS基因,临床应加强监测.
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菌落PCR差异筛选cDNA片段文库
目的探索菌落PCR差异筛选cDNA片段文库的可行性. 方法在用抑制性PCR构建cDNA片段文库的同时,分别制备正、反向减法杂交探针并用碱性磷酸酶直接标记.随后用这些探针与菌落PCR的产物杂交,从而筛选出差异表达克隆,并再次用RT-PCR证实其差异表达.结果建立的菌落PCR反应体系经济实用,方法稳定,并成功地从500个克隆中筛选出差异表达克隆.结论菌落PCR可用于差异筛选构建于质粒载体的cDNA片段文库.
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菌落PCR和质粒PCR对转化菌的筛选
目的为建立简便、可靠转化菌的筛选方法.方法应用菌落PCR和重组质粒PCR方法对转化菌进行筛选和DNA序列分析.克隆载体和表达载体筛选及鉴定采用与载体多克隆插入位点序列互补的通用引物或免疫球蛋白家族特异性引物.阳性菌落和质粒PCR产物通过酶消化后作为模板进行自动测序.结果菌落PCR和质粒PCR技术可作为基因克隆筛选和鉴定的方法.结论菌落PCR和质粒PCR方法简便、快速、可靠,其产物可作为模板直接用于序列分析.
