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Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5'端非编码区变异关系
脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)是一类无包膜单股正链RNA病毒,基因组长约7.5kb.其5'端非编码区由约742个核苷酸长,主要与病毒RNA复制、蛋白翻译起始、病毒颗粒的装配及病毒的细胞适应减毒及神经毒力密切相关[1].
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大鼠Pten和Runx3基因5'端非编码区序列的生物信息学分析
目的 分析大鼠Pten和Runx3基因5'端非编码区(5'-UTR)序列的CpG岛、启动子及其转录因子结合位点.方法 通过NCBI获得大鼠Pten和Runx3基因全长序列及转录本,采用Blast中的可读框比对外显子、内显子及上游5'-UTR信息,所获得ATG上游2 kb、下游1 kb序列分别应用CpG island searcher软件、CpGPlot工具、Methprimer2.0工具预测CpG岛,NNPP工具、Promoter scan工具、FirstEF工具预测启动子,Matlspector、Match、Con-site预测启动子区域转录结合位点.结果 大鼠Pten基因和Runx3基因属于CpG岛关联基因,启动子可能分别位于-1 253 ～-684 bp和-690 ～-121 bp,Pten和Runx3基因在109和94种转录因子结合位点中,被≥2种软件共同预测有结合位点的转录因子分别有6和9种.结论 初步获得大鼠Pten和Runx3基因5'-UTR序列的生物学信息,为进一步基因调控甲基化实验验证奠定了基础.
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丙型肝炎病毒5'端非编码区的5'端序列对其翻译启动活性的影响
目的分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(5'NCR)的5'端序列对其翻译启动活性的影响.方法用PCR技术扩增获得全长和5'端17个碱基缺失的HCV 5'NCR片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2-Control的SEAP基因上游,分别构建成全长和5'端截短的HCV 5'NCR调控SEAP表达的重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP.用脂质体方法将重组质粒转染至肝细胞株QSG7701,并用化学发光法检测SEAP的表达.结果酶切和测序结果表明,重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP构建成功.表达的发光强度分别为390482±42856和635265±52285RLU,二者有差异显著性(P＜0.01).结论 HCV 5'NCR的5'端碱基缺失提高了它对SEAP基因的翻译启动活性,为进一步分析HCV IRES的结构提供了实验基础.
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猪内源性反转录病毒5'端非编码区的克隆及结构分析
通过五指山猪内源性反转录病毒5'端非编码区(5'UTR)cDNA的克隆,分析其一级结构和调控元件,为进一步研究其在PERV复制、转录中的调控机制奠定基础.本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长约1035bp的PERV 5'UTR.通过NCBI公共数据库BLASTn序列进行同源性分析,并应用KEGG数据库对该转录调控区进行顺式作用元件定位分析,结果发现PERV 5'UTR与GenBank公布的部分PERV 5'UTR相比较,同源性在82.6～94.8%之间.一级结构分析发现PERV 5'UTR由U3、R、U5区、引物结合区(PBS)及前导序列组成,可能的核心启动子序列与具有增强子作用的39bp重复序列分别位于U3区的-67～+1与-97～-59区段.在5'UTR转录调控区(-428～+507)鉴定出31个有效的顺式作用元件位点,其中NF-Y、TBP、Oct-1、HSF、GATA-1和GATA-2等与PERV的转录、调控密切相关.
关键词： PERV猪内源性反转录病毒 五指山猪 5'端非编码区 一级结构 顺式作用元件 -
中国丙型肝炎患者中发现新的丙型肝炎病毒核苷酸序列
应用RT-PCR和DNA克隆重组技术,从中国云南地区丙型肝炎患者血清中克隆到3个丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(5'NCR)核苷酸序列.这3个序列分别来自3个不同的丙型肝炎患者.与国内外已发表的HCV原型株同源序列比较研究发现,这3个HCV 5'NCR序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或出现插入重复.在YS225-1 5'NCR序列-155～-174位之间,有18个核苷酸序列缺失;在YS203-4和YS242-1 5'NCR序列-55～-56位之间,分别有28个(YS203-4)和40个(YS242-1)核苷酸序列插入.这些插入序列(28个核苷酸)在其相邻部位已有存在,即为重复序列.YS242-1插入序列中有11个核苷酸出现两次重复.其它部位的核苷酸变异也同已知基因型的相应核苷酸变异有很大差异.结果表明,这3个序列是迄今为止国内外都未曾发现过的新的HCV核苷酸序列.
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丙型肝炎病毒5'端非编码区结构域Ⅱ、Ⅱ在其翻译启动活性中的作用具有细胞特异性
目的：分析在不同宿主细胞的翻译体系下，缺失不同片段的HCV 5'UTR翻译启动活性的差异。方法以脂质体介导基因转染技术，将截短型HCV 5'UTR调控Fluc的真核表达质粒与Rluc真核表达质粒pRL-TK共转染至不同的细胞中，转染后36 h：①提取细胞RNA，半定量RT-PCR检测目的质粒的转录水平；②用双荧光素酶报告基因检测系统检测Fluc基因相对表达活性，分析HCV 5'UTR缺失不同结构域后在不同翻译体系中翻译启动活性的差异。结果⑴缺失5'端44个碱基的HCV 5'UTR的翻译启动活性分别与缺失前相比：在HeLa细胞和C6细胞中无明显影响，在L-02细胞中活性下降为46%，而在293T细胞则为缺失前的146%；⑵缺失5'端118个碱基后，HCV 5'UTR的活性分别与缺失前相比：在HeLa细胞中，缺失后活性仅为缺失前的49%，而在L-02细胞、C6细胞和293T细胞中，活性分别为缺失前的140%、160%和235%。在本研究使用的四种细胞中，pCNl的翻译启动活性的差异无统计学意义，pCNl-d2在293T细胞中活性高，在L-02细胞中活性低。pCNl-d3在293T、C6和L-2细胞中活性相近，但在HeLa细胞中的活性明显比其他细胞低。结论 HCV 5'UTR的DomainⅠ和DomainⅡ对其翻译启动活性的影响与宿主细胞种类相关，具细胞特异性。
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实时荧光RT-PCR技术在黄热病快速检测中的应用
[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测. [方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索佳反应体系条件并用于黄热病疫苗和入境发热患者标本的检测.[结果]建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法佳反应体系为:2xRT-PCR缓冲液10 μl,正向引物5UTR-FP终浓度750 nM,反向引物5UTR-RP终浓度750 nM,探针5UTR-Probe终浓度500 nM,25xRT-PCR Enzyme Mix 0.8μl,RNA 5μl,用DEPC H2O补足到反应总体积20μl;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,56℃10 s(single),72℃15 s,45次循环.该方法低检测限约为20copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应.应用该方法对黄热病疫苗、媒介蚊虫和入境发热患者的血清标本进行检测,结果为黄热病疫苗核酸阳性,其他标本为阴性.[结论]该实时荧光RT-PER方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验,防止该病在国境口岸的传入.
关键词： 黄热病病毒 5'端非编码区 实时荧光RT-PCR 快速检测
