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膀胱癌T24顺铂耐药细胞系的建立及生物学特性
目的 采用浓度梯度法诱导建立人膀胱癌顺铂耐药细胞系(T24/DDP),并观察其生物学特性.方法 利用人膀胱癌细胞株T24,采用顺铂(DDP)作为诱导剂在体外建立人膀胱癌顺铂耐药细胞模型T24/DDP(0.6μg/mL).通过倒置相差显微镜下观察T24、T24/DDP细胞形态,MTT法检测细胞多药耐药性,生长曲线检测细胞的增殖能力,流式细胞术测细胞的周期,qRT-PCR检测耐药基因MRP(muhidrug resistance-associated protein)的表达.结果 经过顺铂14个月的诱导,成功建立了T24/DDP.倒置相差显微镜下观察与T24细胞相比较,T24/DDP排列不规则,形态出现多形性,出现巨细胞;与T24相比较,T24/DDP对顺铂、阿霉素、长春新碱、甲氨蝶呤均产生不同程度的交叉耐药,比T24细胞倍增时间明显延长,细胞周期中G1期细胞增多,G2、S期细胞减少.qRT-PCR结果显示,耐药细胞MRP基因的表达明显高于亲本细胞.结论 人膀胱癌耐顺铂细胞株T24/DDP具有多药耐药性,可以作为研究膀胱癌细胞多药耐药的良好实验模型.
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IL-18基因转染人膀胱癌T-24细胞及其表达的研究
目的:建立表达IL-18基因的人膀胱癌细胞系IL-18/T-24,探讨外源性IL-18基因对T-24细胞生长及其生物学性状的影响.方法:将插入IL-18基因的质粒,应用逆转录病毒载体LXSN感染ψ2(ecotropic)和PA317(am-photropic)两种包装细胞,通过药物G418筛选获得表达IL-18蛋白的PA317阳性细胞克隆,用IL-18/PA317培养上清转染T-24细胞,获得表达IL-18的IL-18/T-24细胞.分别用RT-PCR、ELISA和免疫组化染色分析IL-18/T-24细胞表达IL-18的mRNA和蛋白的水平,筛选出高表达IL-18的IL-18/T-24细胞克隆用于下层研究中;用流式细胞仪检测转染前后细胞的周期变化及细胞凋亡情况:用ELISA法检测IL-18/T-24细胞培养上清诱导脾细胞分泌IFN-γ的能力;采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)比色法,测定转染前后细胞增殖及黏附能力的变化.结果:外源性IL-18基因转染的人膀胱癌细胞系IL-18/T-24,在mRNA水平和蛋白水平均可获得稳定表达;并且,IL-18/T-24细胞的培养上清可明显促进小鼠脾细胞分泌IFN-γ(P<0.01).IL-18/T-24细胞与LXSN/T-24和T-24比较,细胞周期及细胞凋亡率无显著性差异(P0.05),IL-18/T-24细胞的增殖率与LXSN/T-24和T-24细胞相比虽有所降低,但无显著性差异(P0.05).结论:建立的稳定表达IL-18的IL-18/T-24细胞,既保持了肿瘤细胞原有的免疫原性,又具有分泌IL-18的功能,引起较强的免疫应答反应.IL-18/T-24细胞与LXSN/T-24和T-24细胞相比较,其生物学性状无明显差异,可进一步用于肿瘤相关免疫基因治疗的研究.
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羟基喜树碱对3种人膀胱癌细胞体外生长作用的实验研究
目的 探讨不同浓度的羟基喜树碱(HPT)对3种人膀胱癌细胞(EJ细胞、T24细胞及5637细胞)体外生长的抑制作用.方法 通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度HPT对EJ细胞、T24细胞、5637细胞体外生长的抑制率,从而筛选出能够抑制多种膀胱癌细胞体外生长的药物浓度.结果 当加入的HPT浓度≥5ng/ml时,实验组3种膀胱细胞的OD值低于对照组,且呈剂量递减;生长抑制率高于对照组,且呈剂量逆增,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 HPT浓度在≥5ng/ml时对3种膀胱癌细胞体外生长有较好的抑制作用.
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消癌平对人膀胱癌细胞体外生长作用的实验研究
目的 探讨不同浓度的消癌平注射液对人膀胱癌细胞(EJ细胞)体外生长的抑制作用.方法 通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度消癌平注射液对EJ细胞体外生长的抑制率,从而筛选出能够抑制EJ细胞体外生长的药物浓度.结果 消癌平注射液浓度为30、40、50、60μl/ml时对EJ细胞生长具有明显抑制作用,实验组OD值均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01).实验组生长抑制率随药液浓度的升高而升高,计算出的半抑制率(IC50)=54.17μl/ml.结论 消癌平注射液浓度在≥30μl/ml时对EJ细胞体外生长有较好的抑制作用.
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miRNA-195在膀胱癌细胞中功能的研究
目的：研究微小RNA（miRNA）-195对人膀胱癌细胞5637增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法利用阳离子脂质体方法将miRNA-195转染至人膀胱癌细胞5637（miRNA-195组），同时以只转染病毒载体的5637细胞作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测转染细胞中miRNA-195的表达量。采用噻唑蓝（MTT）法、细胞计数法和集落形成实验测定miRNA-195对5637细胞体外增殖的影响。采用划痕试验、Transwell实验、Matrigel 肿瘤细胞侵袭实验检测miRNA-195对5637细胞迁移、侵袭能力的影响。结果实时荧光定量PCR检测结果表明转染后的5637细胞高表达miRNA-195。MTT法、细胞计数法及集落形成实验证明miRNA-195可以抑制5637细胞在体外的增殖，miRNA-195组和对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。划痕实验、Transwell实验以及Matrigel肿瘤细胞侵袭实验证明miRNA-195可以抑制5637细胞的迁移和侵袭能力，miRNA-195组和对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 miRNA-195能够抑制膀胱癌细胞5637在体外的增殖、迁移以及侵袭能力。
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DDX46基因慢病毒载体的构建及其在人膀胱癌细胞中的表达
目的 构建DDX46基因低表达慢病毒载体,并检测其在人膀胱癌细胞中的表达效果,为DDX46基因在人膀胱癌细胞中的研究奠定基础.方法 应用实时荧光定量检测5637细胞和T24细胞中DDX46 mRNA表达水平,以寻找合适的细胞系进行实验.分别以DDX46基因序列和普适型阴性序列为模板,设计合成靶点序列,并合成寡核苷酸双链,定向克隆到慢病毒质粒GV115,合成重组质粒shDDX46和shRNA,分别称之为实验组和对照组.将不同重组质粒与pHelper 1.0和pHelper 2.0分别转染293 T细胞以包装成慢病毒颗粒后感染5637细胞和T24细胞.应用实时荧光PCR定量检测重组慢病毒感染5637细胞和T24细胞后DDX46mRNA表达水平,判断其干扰效率.结果 5637细胞和T24细胞均高丰度表达DDX46mRNA,其结果(用ΔCt值表示)分别为(6.53±0.08)和(8.48±0.11);重组慢病毒感染膀胱癌细胞后,在5637细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.32±0.01),低于对照组(1.00±0.10),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为67.70％;在T24细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.11±0.01),低于对照组(1.00±0.03),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为89.00％.结论 成功构建DDX46基因低表达慢病毒载体,为研究DDX46基因在膀胱癌细胞中的作用奠定了基础.
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塞来昔布对膀胱癌细胞T24增殖的影响
目的 观察塞来昔布对人膀胱癌细胞T24 增殖的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 不同浓度塞来昔布(25、50、100 和200 μmoL·L-1)分别作用于人膀胱癌细胞T24 不同时间(24 h、48 h 和72 h),MTT 检测T24 细胞增殖抑制率,半定量RT-PCR 和Western-blot 检测T24 细胞中COX-2 表达的变化.结果 塞来昔布对膀胱癌T24 细胞抑制作用存在剂量、时间依赖性,200 μmoL·L-1 塞来昔布作用72 h 时抑制率达75.7±1.9%,明显高于其它各组(P<0.05 或0.01);半定量RT-PCR 和Western-blot 方法显示塞来昔布可显著降低T24 细胞中COX-2 mRNA 和蛋白水平(P<0.05),且呈时间依赖性.结论塞来昔布可通过减少COX-2 的表达抑制人膀胱癌细胞T24 的增殖,并呈时间和剂量依赖性.
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CpG寡聚脱氧核苷酸抑制人膀胱癌细胞在裸鼠体内的生长
目的:观察不同剂量的CpG ODN 1668对裸鼠皮下接种人膀胱移行细胞癌T24细胞生长的抑制作用,并与卡介苗的作用进行比较.方法:通过皮下接种T24细胞,建立裸鼠皮下接种人膀胱癌细胞的动物模型.将裸鼠随机分为5组,(1)对照组;(2)BCG组;(3)小剂量CpG ODN 1668组;(4)中等剂量CpG ODN 1668组;(5)大剂量CpG ODN 1668组.自肿瘤细胞接种后第1天起给药,共4次(第1、8、15、22天),在肿瘤周围多点注射相应药物(早期给药);同样方式另设5组动物,自肿瘤细胞接种后第7天起(第7、14、21、28天)于肿瘤周围多点注射相应药物(延迟给药).观察肿瘤体积和裸鼠的生存率.结果:早期给药时,在CpG ODN 1668各剂量组和BCG组,肿瘤生长均被抑制,裸鼠的生存期得到延长.中等剂量和大剂量CpG ODN 1668组对肿瘤细胞生长的抑制作用强于BCG组.延迟给药时,CpG ODN 1668各剂量组肿瘤体积和裸鼠的生存率,与对照组和BCG组的差异无显著统计学意义.结论:CpGODN 1668的早期应用,可抑制人膀胱癌细胞T24在裸鼠体内的生长,并表现为剂量依赖性;其抗肿瘤效应是非T细胞依赖的.当加大使用剂量时,CpG ODN 1668对膀胱癌细胞生长的抑制作用强于BCG.而当肿瘤负荷较大时,CpG ODN 1668和BCG的延迟使用对膀胱肿瘤细胞在裸鼠体内的生长无抑制作用.
关键词： 卡介苗 CpG寡聚脱氧核苷酸 人膀胱癌细胞 裸鼠 -
融合蛋白TAT-EGFP的表达及其对膀胱癌细胞和组织的穿膜活性鉴定
目的 构建穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白(TAT-EGFP)融合蛋白的原核表达系统,研究该融合蛋白在体外对人膀胱癌细胞(EJ细胞)和膀胱癌组织的跨膜作用.方法 以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,用PCR技术扩增TAT-EGFP基因,扩增产物插入载体pET30a,构建成重组质粒pET30a-TAT-EGFP.将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,Ni-NTA Superflow Cartvidge亲和层析柱纯化融合蛋白.将融合蛋白TAT-EGFP加入培养的EJ细胞和膀胱癌组织,荧光显微镜观察TAT-EGFP融合蛋白进入EJ细胞和膀胱癌组织的情况.结果 成功构建了高表达pET30a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为31 kD的融合蛋白TAT-EGFP.不同浓度的TAT-EGFP融合蛋白对膀胱癌细胞均无明显毒性.TAT-EGFP融合蛋白具有穿过膀胱癌细胞和膀胱癌组织的作用.结论 通过对TAT-EGFP融合蛋白表达纯化及活性分析,证实TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.
关键词： 穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白 融合蛋白 穿膜 人膀胱癌细胞 膀胱癌组织 -
人膀胱癌细胞波状层次生长的研究
目的观察人膀胱癌细胞(BIU)在体外培养条件下的生长有序行为.方法将BIU细胞悬液进行局限区域接种,待其形成贴壁生长的群落后进行宏观和显微动态观察及参数测量(扩展直径、扩展速率、细胞形态、细胞平均密度、细胞平均大小、脱氢酶活性、对pH的敏感性等).结果体外细胞培养条件下,局限区域生长的BIU细胞群落能出现明显的层次特性,不同区域细胞的形态、大小、密度、脱氢酶活性以及对pH的敏感性均存在差异.结论空间封闭和生物耗散导致细胞自组织,其结果表现为生长有序行为.本实验为人体细胞的波动生长提供了一个简单可控的初步模型.
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槲皮素抑制人膀胱癌细胞BIU-87生长并诱导其凋亡的研究
槲皮素(quercetin,Que)是一种天然的黄酮类化合物,广泛存在于植物界,大约68%的植物中都含有槲皮素.研究发现槲皮素具有扩张冠脉、清除自由基、抗炎、调节免疫及抗肿瘤的作用[1].本实验旨在研究槲皮素抑制人膀胱癌细胞BIU-87细胞增殖的作用,并探讨其可能的作用机制.
