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改良型TAT-VP3基因表达对人膀胱癌细胞凋亡的诱导作用
VP3来源于鸡贫血病毒(CAV),又被称为凋亡素[1].TAT能够跨膜导入细胞内部.我们利用分子克隆方法构建了重组质粒PcDNA3-TAT-VP3,观察改良型TAT-VP3基因在人膀胱癌BIU-87细胞中的表达及诱导凋亡的效应.
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p120-连环蛋白在不同膀胱癌细胞株中的表达及对膀胱癌BIU-87细胞增殖、侵袭和黏附能力的影响
目的：探讨p120-连环蛋白在膀胱癌BIU-87和T24细胞株中的表达水平，分析p120-连环蛋白下调对膀胱癌BIU-87细胞增殖、侵袭和黏附能力的影响。方法2010年8月至2011年5月，采用实时定量PCR和蛋白质印迹技术检测膀胱癌BIU-87和T24细胞株中p120-连环蛋白的表达水平。将膀胱癌 BIU-87细胞分为3组：未转染组，转染p120-连环蛋白siRNA 组和转染control siRNA组，应用siRNA方法沉默BIU-87细胞中p120-连环蛋白基因表达，采用噻唑盐法和克隆形成实验检测p120-连环蛋白siRNA对BIU-87细胞生长率的影响，Transwell小室法检测BIU-87细胞侵袭能力的变化，细胞黏附人工重组基底膜实验检测BIU-87细胞黏附能力的变化。结果 p120-连环蛋白在膀胱癌BIU-87和T24细胞株中均有表达，在BIU-87细胞株中的表达水平（0．11±0．39）显著高于T24细胞株（0．48±0．17），差异有统计学意义（P＜0．05）。噻唑盐法检测BIU-87细胞的增殖能力，转染p120-连环蛋白siRNA组的生长增殖率（182．7±13．4）％显著高于转染control siRNA组的（95．5±9．9）％和未转染组的100．0％，差异有统计学意义（ P＜0．05）。转染p120-连环蛋白siRNA组BIU-87细胞侵袭数量[（217．5±15．9）个]明显高于转染 control siRNA 组[（105．4±10．1）个]和未转染组[（92．7±8．3）个]，差异有统计学意义（ P＜0．05）。转染 p120-连环蛋白 siRNA 组 BIU-87细胞的黏附能力（57．3±6．4）％明显低于转染control siRNA组（98．1±11．0）％和未转染组100．0％，差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论 p120-连环蛋白在恶性度低的膀胱癌细胞中表达水平高，其表达下调可促进膀胱癌细胞的增殖和侵袭，抑制膀胱癌细胞的黏附。
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RNA干扰抑制膀胱肿瘤细胞BIU-87核干细胞因子基因表达对其增殖的影响
目的探讨体外培养膀胱肿瘤细胞BIU-87核干细胞因子(NS)表达在肿瘤发生和肿瘤细胞自身维护中的作用,以及RNAi技术应用于肿瘤治疗的可行性.方法通过RT-PCR和Northern blot方法检测体外培养的BIU-87细胞中NS的表达情况.采用分子克隆手段构建NS基因特异性siRNA表达载体,细胞转染获得稳定整合有pcDNA4/C-NS-Silencer载体和pcDNA4/C载体的细胞克隆,Northern blot方法检测阳性克隆NS基因表达丰度的变化,并观察其体外增殖能力的变化.结果RT-PCR和Northern印迹杂交结果均显示所检测的BIU-87细胞有较高水平的NS表达,NS在正常人膀胱组织中无表达.Northern blot检测证明获得稳定整合有pcDNA4/C-NS-Silencer载体的细胞克隆NS的表达丰度明显下调,且其体外增殖速率明显降低(P＜0.05).结论NS表达在BIU-87细胞体外增殖过程中发挥重要作用,通过RNAi技术实现NS基因沉默可能是一种较有前景的肿瘤治疗方法.
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MTA1沉默对膀胱癌细胞株BIU-87侵袭能力影响的探讨
目的:采用RNAi沉默膀胱癌细胞株BIU-87 MTA1基因的表达,观察对膀胱癌细胞侵袭能力的影响.方法:构建针对MTA1的siRNA表达质粒,体外转染BIU-87细胞.分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测各组MTA1 mRNA和蛋白表达；Millicell PCF侵袭小室及肿瘤细胞体外黏附试验研究转染前后膀胱癌细胞侵袭能力的变化.结果:与转染空质粒组和未转染组相比,转染siRNA载体组细胞MTA1表达在RNA及蛋白水平都显著低于对照组,前组穿透侵袭小室滤膜的数目明显少于空质粒组和未转染组(F＝213.147,P＝0.000),MTT法测定已黏附细胞的OD490 nm,显示前组的体外黏附能力与转染空质粒组和未转染组体外黏附能力差异有统计学意义,F＝5.663,P=0.008.结论:shMTA1可抑制MTA1在膀胱癌细胞中的表达,并可抑制膀胱癌细胞侵袭转移,以MTA1为靶点的RNA干扰技术可望成为膀胱癌基因治疗的新方法.
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自噬在槲皮素诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡中的作用
目的 研究自噬在槲皮素诱导的人膀胱癌BIU-87细胞凋亡中的作用.方法 以不同浓度的槲皮素处理人膀胱癌BIU-.87细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测槲皮素对BIU-87细胞增殖的抑制作用,采用单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色、Hochest 33258染色分别观察槲皮素处理后BIU-87细胞的自噬和凋亡现象,采用流式细胞仪检测阻断自噬对BIU-87细胞凋亡的影响.以乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测3-甲基腺嘌呤阻断自噬后对槲皮素细胞毒作用的影响.结果 槲皮素对BIU-87细胞的增殖有明显的抑制作用,且此抑制作用呈明显的时间和浓度依赖性,200 μmol/L槲皮素作用72 h时对BIU-87细胞的增殖抑制率达89.2％.槲皮素可以诱导BIU-87细胞发生自噬和凋亡,并且自噬先于凋亡出现；阻断自噬后可使BIU-87细胞的凋亡峰明显增高.在槲皮素处理前后,分别以3-甲基腺嘌呤阻断自噬,可观察到槲皮素对BIU-87细胞的细胞毒作用均增强.结论 槲皮素能明显抑制BIU-87细胞的增殖,并在诱导细胞凋亡之前先诱导自噬发生.在槲皮素诱导BIU-87细胞凋亡的过程中,自噬在早期能够保护BIU-87细胞,延迟凋亡,减少因槲皮素导致的细胞死亡.
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香菇多糖对人膀胱癌BIU-87细胞增殖的抑制作用
目的 探讨香菇多糖对人膀胱癌BIU-87细胞增殖的影响以及作用机制.方法 配制不同浓度(0、10、100、500、1000、2000 μmol/L)的香菇多糖溶液,每个浓度取100 μl为不同浓度组,分别作用于经培养处理后的BIU-87细胞,检测各组细胞的增殖和凋亡情况、线粒体膜电位变化以及活性氧含量.结果 BIU-87细胞的OD值随香菇多糖浓度的增大逐渐降低,各组OD值与对照组(0 μmol/L)比较差异均有统计学意义(P＜0.05);不同浓度的香菇多糖对BIU-87细胞凋亡率无显著影响(P＞0.05),但细胞死亡率与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);BIU-87细胞线粒体膜电位水平随着香菇多糖浓度的增大呈下降趋势,除10 μmol/L组外,其余各组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);活性氧水平则随着香菇多糖浓度的增大而呈上升趋势,各组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 香菇多糖可使人膀胱癌BIU-87细胞线粒体膜电位去极化,诱发细胞内活性氧的产生,导致细胞死亡,从而抑制肿瘤的生长.
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靶向肽NYZL1对膀胱癌细胞生物学行为的影响
目的 通过体外实验来研究靶向肽NYZL1对膀胱癌BIU-87细胞增殖、侵袭和迁移、细胞凋亡等生物学行为的影响.方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法、细胞划痕实验,研究靶向肽NYZL1对BIU-87细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响;使用流式细胞术,研究靶向肽NYZL1对膀胱癌细胞凋亡、周期分布的影响.结果MTT实验结果显示,NYZL1对膀胱癌细胞的增殖无明显抑制作用;细胞生长曲线显示,NYZL1不直接影响肿瘤细胞的生长;损伤修复实验结果显示,BIU-87细胞的迁移能力不受NYZL1的影响;流式细胞仪分析结果显示,NY-ZL1对BIU-87细胞的周期分布与凋亡结果均无明显影响.结论 靶向肽NYZL1对膀胱癌BIU-87细胞的恶性生物学行为无显著影响.
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西罗莫司对膀胱癌BIU-87细胞增殖及侵袭能力的影响
目的 探讨西罗莫司对膀胱癌BIU-87细胞增殖和侵袭能力的作用.方法 将BIU-87细胞贴壁培养于10％胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中,37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养.取对数生长的BIU-87细胞,处理组加入西罗莫司的浓度范围是(10-1000)nmol/L;对照组不加药物,每天紧更换1640培养液.MTT怯分析各浓度组的生长抑制率并制作抑制曲线,Transwell法通过使用matrigel基质胶检测BIU-87细胞在体外的侵袭能力.结果 西罗莫司对BIU-87细胞有明显抑制作用,呈时间和量效依赖关系.Transwell法发现不同浓度的西罗莫司可以减弱BIU-87细胞的体外侵袭能力,呈量效依赖性.结论 西罗莫司可以抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖活性及侵袭能力.
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中国人膀胱癌BIU-87细胞导向肽的体外筛选与特异性鉴定
目的:体外差减筛选噬菌体展示环七肽库,获得与中国人膀胱癌BIU-87细胞系高度结合的小分子多肽并鉴定其结合特异性.方法:以中国人膀胱癌BIU-87细胞作为靶细胞,正常人膀胱上皮细胞为吸附细胞,对噬菌体展示环七肽库进行3轮体外差减筛选.ELISA法鉴定与BIU-87细胞呈强阳性结合的噬菌体克隆,对其编码的DNA进行序列测定和同源性分析.化学合成与BIU-87细胞强阳性结合的肽段并制备成FITC标记的荧光探针,流式细胞术、荧光显微镜下鉴定其与BIU-87细胞、正常人膀胱上皮细胞、人前列腺癌PC3M细胞、人肝癌SMMC-7721细胞以及人结肠癌HCT116细胞的特异结合能力.结果:经3轮差减筛选将噬菌体展示环七肽库富集了25倍,阳性率达76％.共获得10个强阳性克隆,DNA共有序列为SISS-LTH、MARYMSA、TVRTSAD.BIU-87细胞与小分子荧光探针FITC-SISSLTH的结合率为(80.06±8.78)％,显著高于FITC-MARYMSA的(52.93±7.28)％、FITC-TVRTSAD的(38.04±7.47％)、FITC-EDRKETA的(1.91±1.37)％和FITC的(9.85±2.9)％(均P＜0.01).FITC-SISSLTH与BIU-87细胞的结合率显著高于与正常人膀胱上皮细胞、人前列腺癌PC3M细胞、人肝癌SMMC-7721细胞和结肠癌HCT116细胞的结合率[(80.06 ±8.78)％ vs (13.89±1.97)％,(8.13±2.85)％,(27.00±2.87)％,(2.33±1.75)％；均P＜0.01].结论:噬菌体展示环七肽库经3轮体外差减筛选获得高效结合BIU-87细胞的导向肽SISSLTH,具有良好的结合特异性.
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CH50多肽在膀胱癌细胞系BIU-87中的表达和鉴定
目的:研究CH50多肽真核表达载体pCH510体外转染膀胱癌细胞系BIU-87以及CH50多肽的表达和鉴定. 方法:以脂质体LipofectimineTM2000为介导,将pCH510质粒体外转染给BIU-87细胞,用免疫组化S-P法、Western Blot法鉴定CH50多肽的表达, RT-PCR法鉴定导入基因的表达. 结果:转染pCH510质粒的BIU-87细胞明显阳性表达CH50多肽,对照组则不表达. 结论:BIU-87细胞体外转染pCH510质粒后能表达CH50多肽,改变了癌细胞的黏附属性,为临床治疗膀胱癌提供了新的途径.
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冬凌草甲素对人膀胱癌细胞株BIU-87的生长抑制作用及机制探讨
目的 观察冬凌草甲素(ORI)对膀胱癌细胞BIU-87的生长抑制作用并探讨其作用机制.方法 用MTT法检测ORI作用后BIU-87的生长抑制情况;用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态;用流式细胞仪检测细胞凋亡;分光光度法检测BIU-87中Caspase-3的活性变化;用端粒酶重复扩增(TRAP)-PCR-银染法检测其端粒酶活性的变化.结果 ORI对BIU-87有明显的生长抑制作用,呈时间-效应关系和浓度-效应关系.随着ORI作用时间延长,BIU-87凋亡增加,BIU-87内的Caspase-3活性增加,端粒酶活性逐渐降低.结论 ORI对BIU-87有明显的生长抑制作用;其机制可能是通过活化细胞内的Caspase-3和抑制端粒酶活性诱发BIU-87细胞凋亡的.
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温热与冬凌草液对人膀胱癌BIU-87细胞体外凋亡的影响
目的:探讨温热和冬凌草液对体外培养的人膀胱癌BIU-87细胞体外凋亡的影响.方法:通过对体外培养的BIU-87细胞进行加温(37℃、41.5℃、43.5℃)和冬凌草液(0 g/L、0.15 g/L、0.3 g/L、0.6 g/L、1.2 g/L、2.4 g/L)处理,采用形态学和流式细胞术观察温热和冬凌草液诱导的细胞凋亡效应,采用MTT法检测冬凌草作用后细胞的生长抑制率.结果:冬凌草液对BIU-87细胞具有明显的抑制生长作用.形态学观察到实验组中大量具有凋亡特征的细胞.流式细胞仪定量分析显示,随着冬凌草液浓度的增加和温度的升高,BIU-87细胞凋亡率亦呈升高趋势(P＜0.05).结论:温热和冬凌草液具有协同诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的作用.
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三氧化二砷抑制人膀胱癌细胞BIU-87体外生长的实验研究
目的:观察三氧化二砷(As2O3)对人膀胱癌细胞的生长抑制作用,并探讨其机制.方法:采用MTT法检测不同浓度的As2O3对人膀胱癌细胞株BIU-87的生长抑制率,原位末端转移酶标记技术检测细胞凋亡,SABC免疫组织化分析BIU-87细胞中bcl-2的表达.结果:As2O3可有效地抑制BIU-87细胞生长,具有时间、浓度依赖性特点;经药物作用后,膀胱癌凋亡细胞明显增多,凋亡率随作用时间的延长而增高,BIU-87细胞中的bcl-2表达显著降低.结论:As2O3可显著抑制膀胱癌细胞生长;通过下调bcl-2基因表达诱导细胞凋亡是其作用机制之一.
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槲皮素对膀胱癌细胞BIU-87侵袭和凋亡的影响
目的 研究槲皮素(Quercetin)对膀胱癌细胞BIU-87侵袭和凋亡的影响.方法 采用不同浓度槲皮素处理人膀胱癌细胞BIU-87,应用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell法实验观察膀胱癌细胞BIU-87的侵袭能力,流式细胞术分析细胞凋亡率,免疫印迹法检测hIAP-2和MMP-2蛋白表达.结果 槲皮素可有效抑制BIU-87细胞的增殖和侵袭能力(P<0.05),一定浓度和时间的槲皮素作用于膀胱癌细胞BIU-87后可促使其凋亡(P<0.05),且hIAP-2和MMP-2蛋白的表达量下降(P<0.05).结论 槲皮素可抑制膀胱癌细胞BIU-87的增殖和侵袭能力,并促使其凋亡,其机制可能与下调hIAP-2和MMP-2蛋白表达有关.
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膜联蛋白Ⅱ反义寡核苷酸对人膀胱癌BIU-87细胞膜联蛋白Ⅱ表达及细胞侵袭力的影响
目的 探讨膜联蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)反义寡核苷酸(ASODN)对膀胱癌BIU-87细胞AnnexinⅡ基因表达及侵袭力的影响.方法 设计合成AnnexinⅡASODN,采用脂质体将低、中及高浓度(6、12及18μmol/L)的AnnexinⅡASODNs分别转染BIU-87细胞24、48及72h,同时设空白对照组(不转染).采用免疫细胞化学与原位杂交法分别检测各组细胞中AnnexinⅡ蛋白与mRNA的表达;采用MTT法检测细胞增殖情况,计算细胞生长抑制率,采用Boyden chamber侵袭实验检测高浓度转染72 h细胞侵袭力情况.结果 与空白对照组相比,各转染组细胞AnnexinⅡ蛋白和mRNA的表达均减弱,且差异均有统计学意义(P＜0.05),且AnnexinⅡ蛋白及mRNA的表达随AnnexinⅡASODN浓度的增加及转染时间的延而减弱(P＜0.05);AnnexinⅡASODN转染组细胞生长抑制率明显增加(P＜0.05);细胞穿越Matrigel的细胞数交空白组减少,且差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 AnnexinⅡASODN可有效抑制膀胱癌BIU-87细胞AnnexinⅡ蛋白及mRNA的表达,抑制BIU-87细胞的生长及侵袭力.
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可调控STAT3干扰载体抑制BIU-87细胞侵袭的体外研究
目的 探讨可调控RNA干扰载体通过抑制STAT3信号通路对膀胱癌细胞BIU-87侵袭性的影响.方法 采用受CRE重组酶调控的RNA干扰载体pSico构建针对STAT3的shRNA表达载体,以pLVX-CRE作为CRE蛋白的表达载体,将BIU-87细胞分为pSico-shNeg、pSico-shNeg/CRE、pSico-shSTAT3、pSico-shSTAT3/CRE 4组,分别转染相应质粒,RT-PCR和Western blot法检测其干扰效率,Transwell实验检测其侵袭能力.结果 双酶切及测序证实载体构建正确；各组细胞在转染重组质粒后EGFP的表达受CRE调控；RT-PCR结果显示STAT3的表达在干扰之后有显著降低.Western blot结果显示,在无CRE时,pSico-shSTAT3组与pSico-shNeg组STAT3的表达无显著差异(P＞0.05),在有CRE时,pSico-shSTAT3组STAT3相对表达量下降为pSico-shNeg组的(43±4.2)％(P＜0.05)；体外侵袭实验显示pSico-shNeg组透膜细胞数为(203.33±12.42)/视野、pSico-shNeg/CRE组(196.33±11.85)/视野、pSico-shSTAT3组(201.00±16.64)/视野,而pSico-shSTAT3/CRE组(42.00±3.00)/视野,较其他3组显著降低(P＜0.01).结论 由可调控RNA干扰载体介导的CRE依赖性STAT3表达载体能降低细胞内STAT3信号水平,并降低BIU-87细胞体外侵袭迁移能力.
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槲皮素抑制人膀胱癌细胞BIU-87生长并诱导其凋亡的研究
槲皮素(quercetin,Que)是一种天然的黄酮类化合物,广泛存在于植物界,大约68%的植物中都含有槲皮素.研究发现槲皮素具有扩张冠脉、清除自由基、抗炎、调节免疫及抗肿瘤的作用[1].本实验旨在研究槲皮素抑制人膀胱癌细胞BIU-87细胞增殖的作用,并探讨其可能的作用机制.
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小白菊内酯诱导人膀胱癌细胞BIU-87凋亡作用的机制探讨
目的:研究小白菊内酯对人膀胱癌细胞BIU-87增殖与凋亡的影响及其机制.方法:采用不同浓度(15、30、60μmol·L-1)小白菊内酯孵育人膀胱癌细胞BIU-87后,用MTT法检测小白菊内酯对BIU-87细胞的增殖影响,流式细胞术检测小白菊内酯对BIU-87细胞凋亡率的影响,RT-PCR检测小白菊内酯作用BIU-87细胞后的bcl-2、bax mRNA表达情况.结果:经小白菊内酯作用后,MTT结果显示BIU-87细胞的增殖受到显著抑制,流式细胞术结果表明BIU-87细胞凋亡率显著上升(P＜0.05),RT-PCR结果表明BIU-87细胞bcl-2 mRNA表达水平降低(P＜0.05)、bax mRNA表达水平增高(P＜0.05).结论:小白菊内酯通过诱导凋亡能抑制人膀胱癌细胞BIU-87的增殖,其机制可能与其下调bcl-2mRNA和上调bax mRNA表达有关.
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PI3K抑制剂LY294002联合吡柔比星对膀胱癌BIU-87细胞增殖作用的影响
目的:探讨PI3K抑制剂联合吡柔比星对人膀胱癌BIU-87细胞增殖作用的影响.方法:用不同浓度的PI3K抑制剂LY294002联合吡柔比星对BIU-87细胞作用0、12、24、36 h后,通过MTT方法检测抑瘤率;通过Western blotting检测Caspase-3、Bax、Bcl-2及P-gp蛋白的表达.结果:THP能明显抑制BIU-87细胞的增殖,并且具有明显的时间的依赖性 (P<0.05).THP联合应用不同浓度LY294002组与单独使用同剂量的THP组比较,BIU-87细胞的增殖随着药物浓度的增加和时间的延长进一步受到抑制,而且,联合应用LY294002的低浓度THP组对BIU-87细胞抑制作用明显强于高剂量THP组(P<0.05).此外,PI3K抑制剂LY294002联合应用THP后,BIU-87细胞Bax与Caspase-3表达都明显上升(P<0.05),Bcl-2与P-gp表达量明显降低(P<0.05).结论:PI3K抑制剂联合THP比单独应用THP对人膀胱癌BIU-87细胞抑制作用效果明显.
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膀胱肿瘤细胞培养上清对树突状细胞的形成及功能的影响
目的: 探讨人膀胱肿瘤细胞BIU-87培养上清对树突状细胞(DC)的生成和功能的影响.方法: 分离培养外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC, 实验组加入BIU-87细胞的培养上清液, 以正常培养的DC作为对照组, 应用流式细胞术检测在实验组和对照组不同条件下培养的DC上表面标志的表达, 并用改良的MTT比色法检测和对比两组所培养的DC激活同种异体T细胞的能力及其差别.结果: DC与BIU-87细胞的上清液共培养后, CD1a、 CD83及CD86均呈低表达.实验组与对照组相比较, DC的成熟受到抑制, 对同种异体T细胞激活的作用明显降低(P＜0.05).结论: BIU-87细胞的上清液可抑制DC 的生成及相关表面标志的表达, 这可能是导致膀胱肿瘤患者DC 数量减少和功能降低的原因.
