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SH-SY5Y细胞凋亡过程中Cpne5蛋白表达的变化
目的 探讨Cpne5蛋白在SH-SY5Y细胞凋亡中表达量的变化.方法 显微镜观察细胞形态及流式细胞术检测凋亡率,鉴定A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡及血清剥夺诱导凋亡的模型;免疫印迹法检测两种凋亡过程中Cpne5蛋白表达量的变化.结果 10μmol/L A23187诱导SH-SY5Y细胞24h,细胞出现皱缩、凋亡率增加.A23187诱导0.5h,Cpne5蛋白表达量即出现明显的上升,持续至12h;在24h时Cpne5蛋白表达量回落至诱导前水平.血清剥夺72h的SH-SY5Y细胞24份,凋亡率为23.2 ±2.1％,与对照组1.1±0.1％比,差异有统计学意义(P＜0.01).免疫印迹结果表明,SH-SY5Y细胞分别经血清剥夺1h、6h、12h、24h、72h对Cpne5蛋白表达量无明显变化.结论 A23187诱导SH-SY5Y细胞凋亡早期Cpne5蛋白表达量有显著变化;提示Cpne5基因可能参与凋亡调控的钙信号通路.
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同型半胱氨酸抑制人脐静脉内皮细胞eNOS活性
目的 研究不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)作用不同的时间对人脐静脉内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响机制.方法 取2～3代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与不同浓度Hcy孵育以及孵育不同时间.用Western blot和实时荧光定量RT-PCR法检测热休克蛋白90(HSP90)、蛋白激酶B(Akt)蛋白表达,小凹蛋白(Caveolin-1)、eNOS、P-eNOS蛋白及mRNA的表达,二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)mRNA表达.结果 与静息和激活状态下的对照组相比,在Hcy作用下,Caveolin-1蛋白的表达上调(P＜0.05),而Akt蛋白的表达下调(P＜0.05),且均呈浓度、时间依赖性.eNOS蛋白的表达无明显改变.Hcy对其他检测指标无影响.结论 Hcy引起的eNOS活性降低与增强Caveolin-1蛋白表达使其与eNOS藕联增加,减少HSP90、Akt和eNOS复合物的形成,进而抑制了eNOS的活性有关.
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BAPTA-AM指质体通过恢复胞质钙稳态抑制D-GalN致HepG-2细胞凋亡
目的：探讨1，2-二（2-氨基苯氧基）乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸四乙酰氧甲基酯（ BAPTA-AM）恢复胞质钙离子稳态后对D-GalN诱导HepG-2细胞凋亡的影响。方法建立D-GalN诱导HepG-2细胞凋亡模型，采用MTT比色法、台盼蓝染色及Annexin Ⅴ-EGFP、Hoechst-33258荧光染色等考察HepG-2细胞活性及细胞凋亡情况；通过Fura-2/AM钙离子荧光探针法测定不同处理组细胞内游离钙浓度，初步评价钙离子稳态与细胞凋亡的关系。结果 BAPTA-AM脂质体能显著抑制D-GalN致胞质钙离子浓度的升高，恢复胞质钙稳态，维持细胞形态，减少D-GalN诱导细胞凋亡。在一定范围内，细胞内钙离子浓度的增加与细胞活性的提高呈负相关，且钙离子载体 A23187能够拮抗BAPTA-AM脂质体对HepG-2细胞的保护作用。结论BAPTA-AM脂质体通过减轻钙超载，抑制D-GalN诱导HepG-2细胞凋亡。
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离子载体A23187介导pH梯度法制备重酒石酸长春瑞滨长循环脂质体
目的:采用A23187制备重酒石酸长春瑞滨长循环脂质体,优化了处方工艺,并考察了含量、包封率、药脂比和体外释放等检测指标.方法:采用A23187介导的pH梯度法制备了重酒石酸长春瑞滨脂质体；用HPLC法检测了脂质体中重酒石酸长春瑞滨的含量和脂质(HSPC)的含量,考察了药脂比；采用阳离子交换树脂分离脂质体和游离药物,HPLC法检测包封率；以4 mmol· L- NH4Cl-PBS(pH 7.4)为体外释放介质考察了脂质体的体外释放行为.结果:重酒石酸长春瑞滨脂质体包封率为96.1％,药脂比为1:5(w/w)；高药脂比有利于延长药物体外释放的时间.结论:采用A23187介导的pH梯度法制备重酒石酸长春瑞滨脂质体工艺可行、载药量大、包封率高；所建立体外释放的检测方法快速、准确.
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单用A23187诱导外周血单个核细胞成树突状细胞及其介导耐药肿瘤细胞杀伤的实验研究
目的 探索一种快速、高效的由外周血单个核细胞(PBMC)获取树突细胞(DC)的方法,并探索该种来源DC对耐药肿瘤细胞的杀伤作用.方法 通过单用A23187或联合细胞因子(GM-CSF、IL-4及TNF-a)将PBMC诱导分化为DC,观察细胞形态;流式细胞术检测诱导之DC表面分子表达;MTT法检测DC刺激异基因淋巴细胞增殖及其介导靶细胞的杀伤能力.结果 上述两种细胞因子组合均能诱导PBMC向成熟DC分化,均高表达CD1a、CD80、HLA-DR、CD83和CD86;A23187组诱导72h获得DC数量高于细胞因子组的诱导率,也高于细胞因子组诱导7d的诱导率(P值均<0.05);两组所获DC在对异基因淋巴细胞增殖及介导T细胞对耐药肿瘤细胞的杀伤无显著差异(P值均>0.05).结论 单用A23187可快速(72h以内)诱导PBMC向成熟DC转化,且能介导杀伤耐药肿瘤细胞;与联合细胞因子相比,该方法是一种快速而高效的获取DCs的方法.
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Hcy对脐静脉内皮细胞eNOS和caveolin-1表达影响
目的 研究不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)对静息和钙离子导体(A23187)激活状态下人脐静脉内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和小凹蛋白-1(caveolin-1) mRNA和蛋白表达的影响.方法 人脐静脉内皮细胞. (HUVECs)随机分4组:对照组、Hcy组(20、50、100、300 μmol/L)、A23187(1μmol/L)组及上述浓度Hcy分别与A23187(1 μmol/L)共同孵育组,测定各组eNOS和caveolin-1蛋白及mRNA表达情况,同时检测各组一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量和eNOS、超氧化物歧化酶(SOD)活力.结果 对照组caveolin-1蛋白表达为1.13,Hcy各组该蛋白为0.21 ～2.05,呈浓度依赖性增高,差异有统计学意义(F=30.163,P＜0.05)；各组eNOS mRNA表达为1.80 ～2.08,差异无统计学意义；对照纽eNOS活力和NO含量分别为1.20 U/mL和122.41 μmol/L,Hcy组eNOS活力和NO含量分别为0.65～0.74 U/mL和65.33 ～98.91 μmol/L,均呈浓度依赖性降低,差异均有统计学意义(F=5.12、18.91,P＜0.05).结论 Hcy可能通过增强caveolin-1蛋白表达,使其与eNOS藕联增加,进而抑制了eNOS活力.
关键词： 同型半胱氨酸 小凹蛋白-1 人脐静脉内皮细胞钙离子导体 A23187 -
A23187诱导恶性黑色素瘤患者的外周血单核细胞向树突状细胞分化
A23187为一种钙离子载体(calcium ionophore,CI),可提高胞浆内游离钙水平,模拟某些细胞内信号转导事件,导致多基因活化[1-2].我们先前曾探讨了A23187对正常人外周血单核细胞(peripheral monotytes,PBMC)来源的DC的影响[3],近,我们进行了有关A23187诱导MMe患者的PBMC向DC分化的实验研究.
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化学剂法对兔卵母细胞孤雌激活的效果
目的 研究钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)及3种酶对兔卵母细胞的激活率,并观察其体外发育情况.方法 兔超排后获得卵母细胞,经脱颗粒处理后用A23187和6-DMAP处理不同时间,体外培养5～7 d,观察细胞发育与囊胚形成情况.结果 钙离子载体A23187激活处理5 min后, 继续在2.0 mmol/L 6-DMAP中分别处理3.5、4.0、4.5、5.0 h,均能激活兔卵母细胞;以处理4.0 h的卵裂率高(58.82%,20/34),并有15%(3/20)的囊胚发育率.透明质酸酶、胶原酶和胰酶处理20 min后, 均能激活兔卵母细胞,其中透明质酸酶处理20 min的激活率和卵裂率高,分别为58.33%(28/48)和63.64%(28/44).结论 兔卵母细胞孤雌激活率与激活方法密切相关.化学激活剂的处理时间及消化酶的不同均对兔卵母细胞的激活产生显著影响.
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BAPTA-AM对MDCK细胞的保护作用及其机制
目的 观察BAPTA-AM抗D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导MDCK细胞损伤作用,探讨其作用机制.方法 采用MTT法,Annexin V-EGFP/PI与Hoechst33342/PI荧光染色,罗丹明123(Rhodamine 123)荧光染色,Caspase-8、Caspase-9活性测定及钙离子载体A23187诱导细胞内高钙等方法,分别测定D-GalN攻击下MDCK细胞活性,细胞凋亡状况,线粒体膜电位(△Ψm)、Caspase-8、Caspase-9活性和细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)变化等.结果 BAPTA-AM能明显抑制D-GalN所致的细胞活力下降、减少细胞凋亡、维持△Ψm,抑制Caspase-8、Caspase-9的激活,减轻A23187所致细胞损伤,降低[Ca2+]i.结论 BAPTA-AM通过减轻钙超载,保护线粒体、抑制外源及内源性凋亡通路的激活,发挥抗肾细胞凋亡作用.
